PLoS ONE: miR-101 Undertrykker karendotelvækstfaktor C der hæmmer migration og invasion og Forbedrer Cisplatin kemosensitivitet af blærekræft Cells

Abstrakt

Baggrund

microRNA miR-101 nedreguleres i flere kræftformer, herunder blærekræft. Men miR-101 rolle i invasionen, metastaser, og kemosensitivitet af blære cancerceller fortsat uklart. Denne undersøgelse blev udført for at bestemme miR-101 rolle på lymfangiogene molekyle vaskulær endotel vækstfaktor C (VEGF-C) og deres virkninger på blærekræft celle migration, invasion, og kemosensitivitet til cisplatin.

Metoder

To blære cancer cellelinjer (T24 og 5637), og værktøjet cellelinie 293T var ansat her. Blærekræft celler blev transficeret med enten en MIR-101 overekspression vektor eller en kodet-sekvens lentivirus, som begge udviste en høj transfektionseffektivitet. Ikke-transfektion blev anvendt som en mock negativ kontrol. Sårheling og Transwell assays blev udført for at måle cellemigrering og invasionsevne. En luciferase reporter assay blev udført for at validere MIR-101 samspil med VEGF-C’er 3 ‘utranslateret region efterfulgt af RT-PCR og Western bekræftelse blot. En MTS-assay blev anvendt til at evaluere cisplatin følsomhed cellelinjer.

Resultater

MIR-101 overekspression hæmmede migration og invasiv betydeligt, mens en væsentlig styrkelse cisplatin følsomhed. MIR-101 reguleres negativt VEGF-C-protein-ekspression, og VEGF-C overekspression reddede virkningerne af MIR-101 overekspression, hvilket indikerer, at MIR-101 negativt regulerer VEGF-C-protein-ekspression post-transkriptionelt. miR-101 og VEGF-C interferens uafhængigt forbedret cisplatin cytotoksicitet i blæren kræftceller.

Konklusioner

MIR-101 undertrykker VEGF-C-ekspression, hæmmer celle migration og invasion, og øger cisplatin følsomhed i blære cancerceller. Denne undersøgelse giver ny indsigt i miR-101 rolle i blærekræft og viser miR-101 løfte som en potentiel molekylær mål for blærekræft

Henvisning:. Lei Y, Li B, Tong S, Qi L, Hu X Cui Y, et al. (2015) miR-101 Undertrykker karendotelvækstfaktor C der hæmmer migration og invasion og Forbedrer Cisplatin kemosensitivitet for blærekræft Cells. PLoS ONE 10 (2): e0117809. doi: 10,1371 /journal.pone.0117809

Academic Redaktør: Ming Tan, University of South Alabama, UNITED STATES

Modtaget: August 21, 2014 Accepteret: December 30, 2014; Publiceret: 6 feb 2015

Copyright: © 2015 Lei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Nature Science Foundation for Ungdom Kina (nr 81.202.005), planen Fund af Hunan Videnskab Teknologi (nr 2013FJ4109 ), og Central South University Innovation Fond for Independent Graduate Exploration (nr 72150050587). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er den mest almindelige urinvejene malignitet, der producerer cirka 150.000 årlige dødsfald på verdensplan [1] og er klinisk kendetegnet ved sin progression, gentagelse, metastaser, og resistens [2, 3]. Trods aggressiv kemoterapi, 10-20% af ikke-muskel-invasiv blære kræft i sidste ende udvikle sig til muskel invasiv blære kræft [4]. Berigelse af blod- og lymfekar i urothelial lamina propria, invasion blodkar, invasion dybde, og regional lymfeknude-status er blevet identificeret som uafhængige prognostiske faktorer af tumor-overlevelse efter cystektomi, med de fleste tilfælde under trin II og derover distalt tilbagevendende med hver yderligere positiv lymfeknude øger dødeligheden risikoen med 20% [5,6]. Selvom cisplatin er første linje kemoterapi for avanceret blærekræft, cisplatin /gemcitabin (GC) regime har en median tid til progression af kun seks måneder, og har ingen effekt på den samlede overlevelse efter radikal cystektomi hos patienter i højrisikogruppen [7 ]. Trods radikal cystektomi eller præoperativ kemoterapi, ukontrolleret lymphovascular invasion af blærekræft fortsætter med at give en dårlig klinisk prognose [8-10]. Derfor er der behov for yderligere forskning i blærekræft progression, tilbagefald, metastaser, og kemoterapeutiske effekt.

MikroRNA’er (miRNA) er fylogenetisk-bevaret lille ikke-kodende RNA, der negativt reguleret i målrettet mRNA 3 ‘uoversatte regioner (3’ UTR) i flere kræftformer og er blevet mere og mere identificeret som tumorsuppressorer eller kræftfremkaldende stoffer [11-13]. Desuden har flere miRNA tidligere blevet forbundet med kemoterapeutisk følsomhed i flere cancer cellelinjer, herunder blærekræft [14]. Især MIR-101 er blevet veletableret som en tumorsuppressor med hæmmende virkning på cellulær proliferation, migration og invasion. Konkret har lavere miR-101 niveauer tidligere forbundet med blærekræft [15] samt prostata [16], i æggestokkene [17], kolorektal [18], lever [19], gastrisk [20], lunge [21], bryst [22], thyreoidea [23], og melanom [24] kræftformer. Med hensyn til blærekræft, miRNA profilering af blære overgangsperiode celle carcinom (TCC) prøver har vist, at MIR-101 nedreguleres i TCC, og at MIR-101 inhiberer celleproliferation og kolonidannelse i TCC cellelinier gennem direkte undertrykke histon methyltransferase EZH2 [15]. Men MIR-101 rolle (om nogen) i invasionen, metastase, og kemosensitivitet af blære cancerceller fortsat uklar.

VEGF-C, et medlem af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), betragtes som en vigtig lymfangiogene molekyle og er kendt for at forøge permeabiliteten af ​​lymfekar [25-27]. I kræft, er VEGF-C positivt korreleret med lymfe spredes i blærekræft, forbedrer lunge adenocarcinom celle migration til lymfekar, og modulerer cisplatin resistens i gastriske cancerceller [28,29,38]. Selvom blærekræft er kendt for at spredes primært gennem lymfekarrene (med metastase fundet hyppigst i de regionale bækken knudepunkter) [30], ingen undersøgelse har endnu identificeret et forhold (hvis nogen) mellem MIR-101 med VEGF-C i blære cancerceller . I den aktuelle undersøgelse blev miR-101 vist sig at have en effekt på blærekræft celle migration, invasion, og cisplatin følsomhed ved direkte at regulere dets funktionelle mål VEGF-C. Disse data tyder på, at miR-101 kan være en potentiel molekylær mål for blærekræft terapi.

Materialer og metoder

Cell Kultur

blærekræft cellelinier T24 og 5637 som såvel som den humane embryonale nyre værktøj cellelinie 293T anvendt i denne undersøgelse blev indkøbt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina) og blev opretholdt i RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) og Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; Gibco, Grand Island, NY, USA), henholdsvis suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin /streptomycin. Alle cellelinjer blev inkuberet ved 37- i befugtet 5% CO

2

Plasmid Byggeri og lentivirus Forberedelse

Et fragment af miR-101 blev genereret ved hjælp af følgende primere:. Fornuft , 5′-CGGGTACCGGTAGTCCTTCACTTCATGGGGAG-3 ‘og antisense, 5′-CGGAATTCAAA- AAACCCAGCCACCTGTTTCAC-3′ og indsat i GV209 vektoren med et grønt fluorescerende protein (GFP) reportergen inden for AgeⅠand EcoRⅠrestriction sites. Den førnævnte MIR-101-plasmidet, pHelper1.0 og pHelper2.0 blev co-transfekteret ind 293T-celler, og den lentivirale partikel-berigede supernatant blev opnået 48 timer senere. En forvrænget sekvens (5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ‘), som ikke havde nogen homologi med det humane gen, blev anvendt som en kodet negativ kontrol. VEGF-C-cDNA blev amplificeret ved anvendelse af følgende primere: sense, 5’-TCCGCTCGAGATGCACTTGCTGG- GCTTCTTC-3 ‘og antisense, 5′-ATGGGGTACCGTGCTCATTTGTGGTCTTTTCC-3′ og klonet ind i GV147 vektoren med et rødt fluorescerende protein (RFP) reportergen indeholdende restriktionsenzymsites XhoⅠand Kpn I. Non-transfektion blev anvendt som en mock negativ kontrol (S1 data). Alle sekvenserne i eksperimenterne blev bekræftet ved sekventering som følger: VEGF-C siRNA, sense, 5’-AGAUCUGGAGGAGCAGUUAUU-3 ‘og antisense, 5′-UAACUGCUCCUCCAGAUCUUU-3′; negativ kontrol siRNA, sense, 5’-UACUCACUACUCGAGAUGCUU-3 ‘og antisense, 5′-GCAUCUCGAGUAGUGAGUAUU-3’. Derefter blev den syntetiserede par komplementære VEGF-C shRNA anbragt i en pGenesil-1-vektor (Genesil, Wuhan). Fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) (Epics Altra Flow Cytosorter, Beckman, USA) blev anvendt til at vælge GFP + eller RFP + celler i overensstemmelse med producentens anbefalede procedure. Transfektionseffektiviteten af ​​MIR-101 (GFP) og VEGF-C (RFP) blev beregnet som følger: MIR-101 transfektionseffektivitet = GFP + celletal /total celletælling x 100%, og VEGF-C transfektionseffektivitet = RFP + /total celle tælle x 100%. På dette grundlag blev transfektionseffektiviteter for miR-101 (GFP) og VEGF-C (RFP) fundet at være 99% og 40%, hhv.

RNA Isolation og kvantitativ PCR

totalt RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Isoleret RNA blev målt ved hjælp af en NanoDrop 1000 spektrofotometer (Thermo Scientific, DE, USA) med en OD

260 /OD

280-forholdet er større end 1,8 anvendt til cDNA syntese. Revers transskription af MIR-101 og dens specifikke amplifikation blev udført under anvendelse af et miRNA QRT-PCR Detection Kit (GeneCopoeia, MD, USA). U6 blev anvendt som en endogen kontrol. cDNA-syntese af VEGF-C blev udført ved anvendelse af en First-Strand cDNA Synthesis Kit (GeneCopoeia, MD, USA), og real-time kvantitativ PCR (RT-qPCR) omsætning af VEGF-C blev udført ved anvendelse qPCR Mix (GeneCopoeia, MD , USA). GAPDH blev anvendt til VEGF-C skabelon normalisering. Alle primere blev indkøbt fra GeneCopeia. miR-101 og VEGF-C forstærkning blev bestemt på en ROTOR-GENE 3000 platform. De mål PCR tærskel cyklus (Ct) værdier blev normaliseret ved at trække U6 eller GADPH Ct-værdi, der gav ACt værdi. Relative ekspression blev beregnet ved anvendelse af følgende ligning: relative genekspression niveau = 2

– (ACt forsøgsgruppe-ACt kontrolgruppe)

Western blot-analyse

RIPA-lysepuffer indeholdende 1 mM. PMSF blev tilsat til cellerne i seks-brønds plader og derefter centrifugeret i 10 minutter ved 4-. Det totale indhold af supernatanten protein blev bestemt ved Lowry-metoden. Proteinet Prøven blev fortyndet, opvarmet til denaturering, og derefter udsat for natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Efter proteinerne blev overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) -membran (Millipore, MA, USA), 5% skummetmælkspulver blev påført i 2 timer ved 37-. Derefter 1: 1000 fortyndinger af kanin polyklonale primære antistof anti-VEGF-C (Cell Signaling Technology, MA, USA) eller anti-β-actin (som fungerede som en loading kontrol Bioworld Technology, Inc, USA) blev inkuberet med det membran natten over. Den næste dag blev membranen skyllet i TBST tre gange og derefter inkuberet med et fluorescerende sekundært anti-kanin-antistof i 2 timer. Membranen blev scannet af en infrarød billeddannende system (Odyssey), og båndintensitet blev detekteret ved Odyssey 3.0 analysesoftware.

VEGF-C 3’UTR vildtype og mutant Type Konstruktion og Luciferase Reporter Assay

Targetscan-analyse blev anvendt til at opdage en syv-nukleotid komplementær sekvens mellem mIR-101 og den VEGF-C 3’UTR. En vild type (wt) VEGF-C 3’UTR-sekvensen inklusive Xba1 restriktionssites (5′-TCTAGAACGAACCGCCAGAAGGCTTGTGAGCCAGGATTTTCATATAGTGAAG- AAGTGTGTCGTTGTGTCCCTTCATATTGGAAAAGACCACAAATGAGCTAAGATTGTACTGTTTTCCAGTTCATCGATTTTCTATTATGGAAAACTGTGTTGCCACAGTAGAACTGTCTGTGAACAGAGAGACCCTTGTGGGTCCATGCTAACAAAGACAAATCTAGA-3′) i tillæg til en mutant type (mut) VEGF-C 3’UTR-sekvensen med en helt anden MIR-101-bindende sekvens, blev syntetiseret og hver uafhængigt klonet i separate GV272 luciferase reporter vektorerne (Genechem, Shanghai, Kina). Den tidligere beskrevne mIR-101-overekspression eller krypteret-sekvens plasmid sammen med enten en wt eller mut VEGF-C 3’UTR plasmid blev cotransficeret ind i 293T-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, CA, USA), hvilket skaber fire forsøgsgrupper. Derefter 293T-celle luciferase assays blev udført for at bestemme interaktionen mellem mIR-101 og den wt og mut VEGF-C 3′-UTR. Renilla og ildflueluciferase aktiviteter blev målt ved 48 timer efter transfektion under anvendelse af Dual-Glo Luciferase Reporter Assay System ( Promega, Madison, WI, USA) i overensstemmelse med producentens protokoller. forholdet mellem renilla-til-ildflue-luciferase-værdi blev registreret (S1 tabel). eksperimenter blev udført i tredobbelte brønde, og dataene repræsenterer middelværdien af ​​fem uafhængige forsøg.

sårheling Assay

målcellerne, herunder T24 og 5637 celler, blev transficeret med rekombinant lentivirus (1 × 10

8 transducerende enheder /ml) og polybren (5 ug /ml) . Efter 48 timer blev en trypsiniseret enkelt cellesuspension fremstillet og podet i seks brønde (5 x 10

5 /brønd), indtil cellerne nåede 80% konfluens. Derefter blev 1-ml steril pipettespids anvendes til at skrabe den ind i centrum (svarende til et sår), skyllet med PBS tre gange, og det serumfrie medium blev erstattet med det samme. Cellerne fik lov til at migrere i 24 timer, og de ridser blev omhyggeligt iagttaget og fotograferet. Lette mikroskopiske og fluorescerende billeder blev taget med et Olympus IX71 mikroskop. De gap længder blev også beregnet ud fra mikrofotografier. Hver cellelinje blev målt i tre eksemplarer.

Transwell assay

A Transwell kammer (Corning Corporation, MA, USA) med 8-um polyester membran filterporer, blev anvendt både invasionen assay og migration assay. Forskellen mellem invasionen assay og migration assay var at invasionen anvendte analyse overtrukket Matrigel (BD Bioscience, MD, USA) i det øvre kammer, som simulerede karakteristika af den ekstracellulære matrix, mens migration assay ikke gjorde. I alt 2 × 10

5 lentivirus-inficerede celler blev podet ind i det øvre kammer med 200 pi serum-frit medium. I alt 500 pi medium indeholdende 20% FBS blev tilsat til det nederste kammer. Efter inkubation i 24 timer blev cellerne klæber til den nedre overflade af membranen på det øvre kammer fikseret i 90% ethanol i 10 minutter, farvet med 0,1% krystalviolet, tælles i tre tilfældige skud ved mikroskopi, og fotograferet. Det gennemsnitlige antal celler i de tre tilfældige skud blev rapporteret. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt.

MTS Assay

Cellesuspensionen blev podet i 96-brønds dyrkningsplader ved en tæthed på 4 x 10

3 celler /brønd (0,2 ml /brønd) i 24 timer før brug. Dyrkningsmediet blev udskiftet med frisk medium indeholdende cisplatin med forskellige koncentrationer i 72 timer. Dernæst blev MTS (20 pl /brønd) tilsat til hver brønd, og absorbansen ved 490 nm af hver brønd blev optaget med en universel mikropladelæser (Bio-Rad Hercules, CA, USA) efter 3 timer. Dosis-inhiberingshastighed kurver blev plottet ifølge absorbansværdier. IC50-værdien (den 50% maksimal inhiberende koncentration af cisplatin) blev også beregnet. Assayet blev gentaget tre gange.

Statistical Analysis

Resultater blev udtrykt som middelværdi ± SDS. Alle data blev analyseret under anvendelse SPSS softwareversion 21.0. Eksperimenter blev statistisk analyseret af Students

t

-test eller envejs ANOVA.

P

0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

miR-101 inhiberer blærekræft Cell Migration og Invasion

På grund af tidligere resultater. af lavere mIR-101-ekspression i blærekræft [15,31], konstruerede vi en mIR-101 overekspression plasmid og pakket det ind lentiviral vektor. Blærekræft celler blev transficeret med enten en MIR-101 overekspression vektor eller en kodet-sekvens lentivirus (krypteret negativ kontrol), som begge udviste en høj transfektionseffektivitet (fig. 1A). Ikke-transfektion blev anvendt som en mock negativ kontrol. Vi undersøgte derpå cellemigrering og invasion evnen af ​​disse blære cancerceller. Den sårhelende assay og Transwell migration assay viste, at cellemigration blev signifikant inhiberet af MIR-101-overudtrykkende lentivirus (fig. 1B, 1C). Den hæmmende effekt af miR-101 på celle invasion blev bekræftet af Transwell invasion analysen. Som følge heraf har både T24 og 5637 MIR-101-overudtrykkende celler i den nedre overflade af det øvre kammer udviste dramatisk inhiberede invasionsevne forhold til deres scrambled-sekvens-transficerede modstykker (fig. 1d).

(A) normaliserede mIR-101-mRNA-niveauer detekteret ved RT-qPCR. (B) Det åbne sår% (sår felt

endelige

/sår felt

indledende

x 100%) fra sårheling analysen efter transfektion. (C) Repræsentative billeder af migrerede celler med antallet af migrerede celler pr. Bemærk: T24 celler har en stærkere affinitet til krystal voldelige farvestof. Selv billedet synes at vise mere rigelige farvning for T24 celler, T24 celletal var faktisk lavere i forhold til de af 5637 celle. (D) Repræsentative billeder af invasive celler trænger det coatede Matrigel og antallet af invaderende celler pr. Data præsenteret som middelværdi ± SDS. *

s

0,05, **

s

. 0,01

miR-101 Direkte Mål VEGF-C i 293T Celler

at evaluere molekylære mekanisme (r) af mIR-101, Targetscan analyse fandt, at VEGF-C er et potentielt målgen for mIR-101, da der er en syv-nukleotid komplementær sekvens mellem mIR-101 og VEGF-C-3 ‘UTR (fig. 2A). Således viste en luciferase reporter assay, at MIR-101 opregulering faldt betydeligt luciferaseaktiviteten af ​​vildtype VEGF-C, men ikke mutant VEGF-C (fig. 2B). Derefter blev RT-qPCR og Western blotting anvendes til at vurdere VEGF-C-mRNA og protein niveauer, (fig. 2C, 2D). MIR-101 overekspression signifikant inhiberede VEGF-C-protein-ekspression, men ikke signifikant inhiberer VEGF-C mRNA-ekspression i både T24 og 5637 celler, hvilket antyder post-transkriptionel regulering af VEGF-C ved MIR-101.

(A ) de potentielle bindingssteder for mIR-101 på de syv bp-seed sekvenser af 3’UTR-regionen af ​​VEGF-C. Mutant typen blev bygget på dette frø region som understreget (vægt: vildtype, mut: mutant type). (B) Firely /Renilla luciferase aktivitet efter transfektion med wt og mut VEGF-C 3’UTR og enten MIR-101-overudtrykkende vektor eller en kodet-sekvens vektor. (C) VEGF-C-mRNA-ekspression målt med RT-qPCR i transficerede cellelinier viser ingen signifikante forskelle i VEGF-C mRNA-ekspression på tværs af de tre transfektionsforsøg stater. (D) Western blot-analyse af VEGF-C-ekspression i transficerede cellelinjer viser MIR-101 overekspression signifikant undertrykkelse VEGF-C-protein-ekspression. Data præsenteret som middelværdi ± SDS. **

s

. 0,01

VEGF-C Overekspression redder miR-101 invasion Effects

For at verificere rolle VEGF-C i blærekræft cellelinjer, udførte vi redning eksperimenter (S1 fig.). Efter T24-celler blev transficeret med MIR-101 lentivirus i 48 timer, blev de kortvarigt transficeret med et VEGF-C overekspression plasmid (fig. 3A) for at undersøge genopretning af celle mobilitet. Transwell invasion assay viste, at den efterfølgende transfektion af VEGF-C delvist forbedret cellernes invasion evne i forhold til VEGF-C negative kontrol og ikke-transficerede grupper (fig. 3B). Som forventet blev VEGF-C-proteinniveau reddet (fig. 3C). Inhibering af blærekræft celleinvasion ved MIR-101 sandsynligvis en konsekvens af nedsat VEGF-C-ekspression.

(A) Repræsentative billeder af blære cancerceller samtidigt transficeret med MIR-101 /grønt fluorescerende protein (MIR -101 /GFP) og VEGF-C /rødt fluorescerende protein (VEGF-C /RFP). (B) Repræsentative billeder af invasive celler gennemtrænger overtrukket Matrigel transficeret med enten MIR-101, MIR-101 og VEGF-C (MIR-101 /VEGF-C (+)), MIR-101 og en negativ kontrol af VEGF-C (mIR-101 /VEGF-C (-)), eller ikke-transfektion (fingeret). (C) Western blot-analyse validering VEGF-C protein-ekspression i de transficerede cellelinjer.

miR-101 Overekspression og VEGF-C Knockdown Selvstændigt Forbedre Blære Cell Følsomhed til cisplatin

miR -101 overekspression forøget følsomhed både T24 og 5637 celler for cisplatin, med IC50-værdien steg fra 4,06 ± 0,69 mg /l til 9,17 ± 1,24 mg /l og fra 2,96 ± 0,46 mg /l til 5,56 ± 0,36 mg /l, (fig. 4A, 4B). For at bestemme VEGF-C rolle i cisplatin følsomhed blev et VEGF-C interferens plasmid konstrueret og transficeret ind i blæren cancercellelinier (fig. 5A). Følsomheden af ​​T24 og 5637 celler for cisplatin steg efter VEGF-C interferens, med IC50-værdien steg fra 2,56 ± 0,31 mg /l til 8,23 ± 0,83 mg /l og fra 3,01 ± 0,5 5mg /l til 5,42 x 0,52 mg /l henholdsvis (fig. 5B, 5C). Disse resultater antyder, at VEGF-C nedregulering, som nedstrømsmål af MIR-101, forøger blærekræft celle følsomhed over for cisplatin.

(A) Kurver over dosis inhiberingshastighed kurver for cisplatin måling celletællinger efter transfektion med enten mIR-101-overudtrykkende eller krypteret-sekvens lentivirus. (B) IC50-værdier signifikant reduceret ved MIR-101 overekspression. Data præsenteret som middelværdi ± SDS. **

s

. 0,01

(A) Western blot analyse af VEGF-C-ekspression i cellelinjer transficeret med VEGF-C shRNA eller kontrol shRNA. (B) Plots af dosis hæmning sats kurver for cisplatin måling celletal efter transfektion med VEGF-C shRNA eller kontrol shRNA. (C) IC50 værdi signifikant reduceret efter VEGF-C knockdown. Data præsenteret som middelværdi ± SDS. **

s

. 0,01

VEGF-C Overekspression redder miR-101-induceret Cisplatin Sensitivity

Efter T24-celler blev transficeret med miR-101 lentivirus i 48 timer blev de derefter transient transficeret med enten en VEGF-C overekspression plasmid, et VEGF-C kontrol plasmid, eller en VEGF-C shRNA plasmid. Vi fandt, at VEGF-C overekspression delvis genvundet blærekræft celle følsomhed over for cisplatin sammenlignet VEGF-C-kontrol med IC50-værdier of10.05 ± 1,05 mg /l og 3,14 ± 1,02 mg /l til 0,63 ± 0,16 mg /l (fig . 6A, 6B). Desuden shVEGF-C mere signifikant forøget blærekræft celle følsomhed over for cisplatin sammenlignet med VEGF-C kontrol (fig. 6A, 6B).

(A) Kurver over dosis inhiberingshastighed kurver for cisplatin måling celletal efter transfektion med enten mIR-101 og VEGF-C (mIR-101 /VEGF-C (+)), mIR-101 og en negativ kontrol af VEGF-C (mIR-101 /VEGF-C (-)), eller miR- 101 og VEGF-C shRNA (mIR-101 /shVEGF-C). (B) IC50-værdien var signifikant forøget efter transfektion med miR-101 /VEGF-C (+).

Diskussion

Nye beviser for, at miR-101-ekspression går tabt i blære kræft væv og blærekræft cellelinjer [15,31]. De NDY1 /KDM2B-MIR-101-EZH2 aksen er blevet identificeret som aktiv i blæren cancerceller [32], hvor MIR-101 undertrykker motilitet T24 blære cancerceller ved målretning af c-Met s 3′-UTR [33]. den detaljerede molekylære mekanisme (r) af miR-101 rolle i blære cancerceller er dog stadig, at blive belyst. Derfor, ved anvendelse af en Targetscan-baserede bioinformatik tilgang for at søge efter potentielle MIR-101 mål, vi identificeret VEGF-C som en potentiel MIR-101 target. Vi konstruerede derefter en MIR-101-overudtrykkende lentivirus til transfektion ind i T24 og 5637 blærecancer cellelinier og demonstrerede, at MIR-101 overekspression hæmmer blærekræft cellemigration og invasion. Endvidere demonstrerede vi, at MIR-101 negativt regulerer VEGF-C-protein-ekspression, og VEGF-C overekspression redder virkningerne af MIR-101 overekspression, hvilket antyder, at MIR-101 negativt regulerer VEGF-C-ekspression post-transkriptionelt. Endelig viste vi, at både miR-101 og VEGF-C interferens uafhængigt forbedret cisplatin cytotoksicitet i blære cancerceller, og VEGF-C reddet også miR-101 effekt på blærekræft celle følsomhed over for cisplatin.

Produktion og sekretion af VEGF’erne-potente stimulatorer af angiogenese, der påvirker endotelcelleproliferation og motilitet samt vaskulær permeabilitet-har været almindeligt observeret i flere aggressive tumortyper og væsentligt påvirker prognosen for kræftpatienter [28], selv om VEGF-C har vist sig at har angiogene virkninger på endotelceller [34], VEGF-C primært virker lymphatically gennem Flt4 /VEGFR-3 og KDR /VEGFR-2 receptortyrosinkinaser [35], som udelukkende udtrykkes i lymfatiske endotel og høj venular endotel af lymfeknuder knudepunkter i normale voksne væv. For eksempel har VEGF-C overekspression vist sig at give lymfatisk endotel proliferation og selektiv hyperplasi i lymfatiske kar [36].

Med hensyn til VEGF-C rolle i malignitet, VEGF-C mRNA-ekspression blev oprindeligt detekteret i et blandet sæt af faste humane tumorer med VEGF-C rolle i lymfangiogenese tilvejebringe en mulig mekanisme for metastase via nydannede lymfekar [37]. Senere undersøgelser opdaget, at VEGF-C primære receptor Flt4 /VEGFR-3 udtrykkes i en række forskellige humane maligniteter, herunder lunge-, tyktarms-, prostata- og pladecellecarcinomer i hoved og hals samt Kaposis sarkom [28]. Endvidere er der fundet positive korrelationer mellem VEGF-C-ekspression og lymfe spredning i blæren TCC [38] samt i prostata [39], kolorektal [40], gastriske [41], skjoldbruskkirtel [42], og neuroblastom cancere [43 ]. VEGF-C nedregulering reducerer murine lunge og tyktarmskræft metastaser, og Flt4 /VEGFR-3-hæmning er blevet associeret med reduceret angiogenese /lymfangiogene aktiviteter samt nedsat vækst og metastase i bryst, bugspytkirtel, og ovariecancer, der baner vej for udvikling og afprøvning af VEGFR3 hæmmere som målrettede kemoterapeutika [44]. Her miR-101 overekspression undertrykt VEGF-C proteinekspression, forringe blærekræft celle migration og invasion

in vitro

i fravær af lymfangiogenese. Disse resultater antyder, at VEGF-C virker gennem ikke-lymfangiogene mekanisme (r) i fremme blære tumorudvikling. Der kræves yderligere forskning for at bestemme den nedstrøms affector (e) af VEGF-C-Flt4 /VEGFR-3 akse i blære kræftceller, der fremmer blærekræft celle mobilitet.

Cisplatin kemoterapi stadig den første linie behandling for lokalt fremskreden blærekræft, så cisplatin modstand er et stort klinisk problem for patienter blærekræft [45]. Selvom vi fundet nogen tidligere arbejde undersøger MIR-101 rolle på cisplatin-resistens i blære cancerceller, MIR-101-ekspression er blevet vist at være nedreguleret i docetaxel-induceret cisplatin krydsresistente over hoved og hals pladecellecarcinom cellelinier [46], mens mIR-101 har vist sig at virke synergistisk med cisplatin, doxorubicin, og fluoruracil til at inducere apoptose i hepatocellulære carcinomceller [47,48]. Som MIR-101 s antagonist, VEGF-C fremmer cisplatin resistens i gastriske cancerceller [29], og VEGF-C opregulering resulterer i tumor resistens over for anti-VEGF-behandling i en murin lungecancer model [49]. I overensstemmelse med disse tidligere fund, her både miR-101 og VEGF-C interferens blev vist til selvstændigt forbedre cisplatin cytotoksicitet i blære cancerceller, og VEGF-C reddet også miR-101 effekt på blærekræft celle følsomhed over for cisplatin. Men mekanismen (r) underliggende VEGF-C rolle i cisplatin modstand blære cancerceller forbliver ukendt og kræver yderligere undersøgelse.

Der er to begrænsninger denne undersøgelse. Første, denne undersøgelse viser, at VEGF-C spiller en nøglerolle i blærekræft cellemigrering, invasion, og cisplatin kemosensitivitet og er et direkte mål for MIR-101. Men denne kendsgerning ikke udelukker muligheden for, at miR-101 har andre mål, der har lignende cellulære funktioner til VEGF-C. Brug af Targetscan databasen, fandt vi 803 udskrifter, der er forudsagt til at være mål for HSA-miR-101, herunder EZH2, BTBD3, NLK, og MITF. Yderligere undersøgelse er nødvendig for at fastslå, om disse 803 formodede mål er faktiske mål for miR-101, og om sådanne protein mål er forbundet med blærekræft celle migration, invasion, og cisplatin kemosensitivitet. For det andet har tidligere arbejde vist, at MIR-101 nedreguleres i TCC og at MIR-101 inhiberer TCC celleproliferation og kolonidannelse gennem direkte undertrykke histon methyltransferase EZH2 [15]. Derfor, i dette studie, vi ikke vurdere miR-101 s virkninger på blærekræft celledeling, men snarere specifikt fokuseret på miR-101 indflydelse på blærekræft celle migration og invasion gennem VEGF-C. Således uanset om miR-101-VEGF-C-aksen påvirker blærekræft proliferation stadig et åbent spørgsmål. Tredje, transfektionseffektiviteten af ​​MIR-101 lentivirus var 99%, men transfektionseffektiviteten af ​​VEGF-C-plasmidet var kun 40%; på grund af tekniske fotografiske spørgsmål, antog vi, at alle celler var MIR-101 + (GFP +) og derved valgte celler ved FACS udelukkende på grundlag af VEGF-C + (RFP +). Kort sagt, VEGF-C + (RFP +) blev celler anses dobbelt-positive celler. På grund af denne tekniske begrænsning, det var vanskeligt at foretage en passende vurdering co-lokalisering af MIR-101 og VEGF-C-mRNA.

Sammenfattende viser vi MIR-101 post-transkriptionelt undertrykker VEGF-C-ekspression, hæmmer blære cancercelle migration og invasion, og øger cisplatin følsomhed. Selvom der er behov for yderligere forskning for at identificere andre relevante mål for miR-101, denne undersøgelse giver ny indsigt i miR-101 rolle i blærekræft og viser miR-101 løfte som en potentiel molekylær mål for blærekræft.

Støtte Information

S1 data. Opførelsen af ​​miR-101-overekspression plasmid og VEGF-C-overekspression plasmid

doi: 10,1371 /journal.pone.0117809.s001

(DOC)

S1 Fig. Repræsentative Billede af blærekræft T24 celler samtidigt transficeret med MIR-101 /grønt fluorescerende protein (MIR-101 /GFP) og VEGF-C /rødt fluorescerende protein (VEGF-C /RFP)

doi: 10,1371 /journal.pone. 0117809.s002 Hotel (TIF)

S1 Table. Firely /Renilla Luciferase Analyser af transfektion med wt og mut VEGF-C 3’UTR og Enten miR-101-overekspression Vector eller en Scrambled-sekvens Vector

doi:. 10,1371 /journal.pone.0117809.s003

(XLSX)