PLoS ONE: Meget forskellige KRAS Mutation status i Rektal Cancer

Abstrakt

Introduktion

Anti-EGFR målrettet terapi er af stigende betydning i fremskreden kolorektal cancer og før

KRAS

mutation test er obligatorisk for terapi. Men hvor lejligheder dette skal udføres er stadig under debat. Vi havde til formål at vurdere i patienter med lokalt fremskreden endetarmskræft, om der er intra-eksemplar KRAS heterogenitet før og efter præoperativ strålebehandling (CRT), og hvis der er nogen ændringer i

KRAS

mutation status på grund af denne intervention.

Materialer og metoder

KRAS

mutation status blev udført i 199 tumorprøver fra 47 patienter med endetarmskræft. At evaluere heterogenitet mellem forskellige tumor områder inden for den samme tumor før præoperativ CRT, 114 biopsier fra 34 patienter (betyder 3 biopsier per patient) blev analyseret (præ-terapeutisk intratumoral heterogenitet). Til vurdering af heterogenitet efter CRT resterende tumorvæv (85 prøver) fra 12 patienter (gennemsnit 4,2 vævsprøver per patient) blev analyseret (post-terapeutisk intratumoral heterogenitet) og vurdering af heterogenitet før og efter CRT blev evalueret i tilsvarende patientprøver (interventionel heterogenitet). Primer extension metode (Snapshot ™) blev anvendt til initial

KRAS

mutation status test for Codon 12, 13, 61, og 146. uoverensstemmende resultater af denne metode blev revurderes ved hjælp af FDA-godkendte

KRAS

Pyro Kit 24, V1 og

RAS

Extension Pyro Kit 24, V1 Kit (TheraScreen®

KRAS

test).

Resultater

for 20 (43%) ud af de 47 patienter, en

KRAS

mutation blev opdaget. Med 12 ud af 20, de fleste af disse mutationer påvirkede codon 35. Vi har ikke fået bevis for, at CRT resulterer i ændringer af

KRAS

mutation mønster. Derudover ingen intratumoral heterogenitet i

KRAS

mutationsstatus kunne bevises. Dette var tilfældet for både biopsier før CRT og resektion prøver derefter. Forskellen observeret i nogle prøver ved brug af Snapshot ™ analysen skyldtes utilstrækkelig følsomhed denne teknik på massive tumorregression af CRT som anvendelsen af ​​TheraScreen®

KRAS

test afslørede overensstemmende resultater.

Konklusion

Vores resultater viser, at

KRAS

mutation status på den primære tumor site af endetarmskræft er homogen. Vurderingen til terapeutiske beslutninger er muligt i præ-terapeutiske biopsier samt i post-terapeutiske resektion prøver. Mængden af ​​levedygtige tumorceller synes at være en vigtig faktor for analysen følsomhed og bør derfor i betragtning ved udvælgelsen af ​​analysemetoden

Henvisning:. Jo P, König A, Schirmer M, Kitz J, Conradi LC, Azizian A, et al. (2016) Meget forskellige

KRAS

Mutation status i endetarmskræft. PLoS ONE 11 (4): e0153278. doi: 10,1371 /journal.pone.0153278

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN

Modtaget: August 24, 2015; Accepteret: 25 Mar 2016; Udgivet: 11 April, 2016

Copyright: © 2016 Jo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data /den minimale datasæt er inden manuskriptet

Finansiering:.. Værket er en del af Klinisk Forskningsenhed (KFO 179) og blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG)

Konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Målrettet terapi mod epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) repræsenterer en godt accepteret og effektiv behandlingsstrategi i metastatisk kolorektal cancer forbundet. med en øget responsrate og langvarig patient overlevelse [1, 2]. I sin onkogene funktion

EGFR

styrer afgørende cellulære funktioner såsom differentiering, proliferation og overlevelse gør det et værdifuldt mål for anti-cancer terapi [3]. Imidlertid er hæmning af denne centrale signalmolekyle i kolorektal cancer kun lovende når intracellulære effektorer nedstrøms for

EGFR

ikke ændres ved at aktivere mutationer. En af de store intracellulære effektorer oversætte

EGFR

signaler repræsenterer de små GTPaser

KRAS

styre vitale intracellulære signalleringskaskader såsom mitogenaktiveret-protein- (MAP-) Kinase-signalvejen. Genomisk mutation i

KRAS

gen locus resulterer i en kontinuerlig aktivering af MAPKinase pathway uafhængig af ekstracellulære faktorer og fra

EGFR

. Ikke overraskende og på grund af kontinuerlig stimulering af onkogene signalveje ved mutatively aktiverede

KRAS

, hæmning af

EGFR

havde nogen gavnlig eller endda negative virkninger i kolorektal kræftpatienter huser en

KRAS

mutation. Derfor patienter med muteret

KRAS

er udelukket fra anti-

EGFR

terapi og bestemmelse af

KRAS

mutation status er påkrævet før tilsigtede terapi.

generelt

KRAS

mutation status vurderes ved at analysere primære tumorvæv. Men på grund af intratumoral heterogenitet [4-6]

KRAS

mutation heterogenitet inden for forskellige områder af tumoren måtte være, et potentielt problem som for nylig rapporteret i det mindste for udvalgte patienter [7, 8]. Et fænomen, der ikke kun er for kolorektal cancer som vist ved Queirós et al. [9]. Forskelle i de

KRAS

mutation status mellem primær tumor og fjernmetastaser [7, 10]. samt tumorstatus afhængighed [11] er også blevet rapporteret. Der er helt sikkert en stor overensstemmelse mellem primær tumor og metastaser som for nylig afsløret af en meta-analyse fra Han og kolleger [12]. Det bør dog også tages i betragtning, at den metode mutation test udnyttet, kan være kilde af indberettede afvigelser som for nylig påpeget af Sherwood et al. i lungekræft [13].

I modsætning til tyktarmskræft præoperativ strålebehandling (CRT) er behandling strategi valg i patienter med lokalt fremskreden endetarmskræft. Men der er ikke enighed om timingen af ​​bestemmelsen af ​​de

KRAS

mutation status. Derudover potentielle resultater vedrørende overensstemmelse af

KRAS

mutation status i præ- og post-terapeutiske tumorprøver (benævnt intertumoral heterogenitet) er sjældne og af modstridende karakter [14-16]. Endvidere er der ingen resultater, der demonstrerer reproducerbarheden af ​​

KRAS

test i den primære biopsi samt i de operativt fjernede prøve inden for samme tumorvæv (benævnt intratumoral heterogenitet). Vi har derfor til formål at vurdere

KRAS

status i flere præ-terapeutiske biopsier samt i resektion tumor prøver. Målet var at sammenligne mutationen status før og efter kemo- og stråleterapi i endetarmskræft og at afklare, om mutation forskelle i behandling naive tumorer forekomme overhovedet.

Materialer og metoder

Patienter og behandling

Patienter inkluderet i denne analyse blev behandlet på departementerne General, Visceral og Pediatric Kirurgi og strålebehandling og Radiation Oncology, University Medical center Göttingen, og blev indrulleret eller behandles i overensstemmelse med retningslinjerne i CAO /forsøg ARO /AIO-94 [ ,,,0],17] eller CAO /ARO /AIO-04 [18] (EudraCT-nummer 2006-002385-20-NCT00349076) i den tyske endetarmskræft Study Group. Alle patienter blev fulgt op efter de forsøgsprotokoller og gav skriftligt informeret samtykke enten fra patienterne eller deres juridiske repræsentanter. Denne undersøgelse var i overensstemmelse med de etiske principper i Helsinki-deklarationen (Seoul, 2008) og blev godkendt af universitet i Göttingen Etiske Komité i Göttingen, Tyskland (ansøgning nummer 20/9/95, 9/8/08).

Konstatering af før og efter terapeutisk tumorbiopsier

Tumor biopsier blev indsamlet forud for præoperativ CRT under de diagnostiske procedurer. Brug af typiske biopsi pincet biopsier gav på størrelse med et knappenålshoved. Efter operationen residual tumor blev taget fra resektion prøver. På grund af tumorregression hele tumoren region blev indlejret og blev senere vurderet af patologen. Mutationen status blev vurderet i formalinfikserede-paraffinindlejrede (FFPE) vævsprøver (4% buffered formalin) fra præ-terapeutiske tumor biopsier og post-terapeutiske resektion prøver.

Tumor DNA-forberedelse og isolering

FFPE slides fra præ-terapeutiske og resektion prøver var selvstændigt og blændet revurderes af to erfarne gastrointestinal patolog (JK, PS). Tumorregression grading (TRG) blev vurderet i procent af regression efter Dworak Grading [19]. I uharmoniske tilfælde blev slides revurderet af både patologer og en endelig beslutning blev taget. Vi har tilføjet de respektive tumor regression kvaliteter og relevante kliniske data for de pretherapeutic biopsier for alle patientprøver i tabel 1. mikrodissektion for tumor celle berigelse at opnå et indhold på 70-80% blev udført manuelt. Teknikken blev udført som for nylig rapporteret af Hunt og kolleger [20]. Kort fortalt blev FFPE vævssnit afparaffineret og farvet med hæmatoxylin. Repræsentative tumorområder blev identificeret under anvendelse af et mikroskop ved en 40 gange forstørrelse. Dissektion udførtes med en spids kirurgisk kniv. Tumorvæv blev overført til et rør og DNA-ekstraktion blev udført derefter ved anvendelse af Qiagen AllPrep DNA /RNA FFPE Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge fabrikantens instruktioner.

Mutation Analysis

Primer extension Method snapshot ™ analysen.

Primer forlængelse metode blev anvendt til at analysere kendte hot-spot

KRAS

mutationer i endetarmskræft [21] som beskrevet tidligere [22] . Kort fortalt blev regioner af hotspot mutationer i kodonerne 12, 13, 61 og 146 amplificeret ved multiplex-PCR under anvendelse af Qiagen Multiplex Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) med konstant 20 ng indført DNA. Denne samlede start DNA blev bevaret også for følsomhed test, hvorved DNA med enkelt kendt

KRAS

mutationer blev fortyndet med DNA huser vildtype konfiguration på den angivne

KRAS

loci. Derfor, for at otte blandinger med 100, 50, 40, 30, 20, 10, 1 og 0% af mutant-holdigt DNA pr hvert af de fire interrogerede mutationer blev fremstillet før underkastelse multiplex PCR. Efter reje alkalisk fosfatase og Escherichia coli exonuclease I (USB, Staufen, Tyskland) behandling specifikke primere binder støder op til de potentielle mutation steder blev anvendt og forlænget ved fluorescens-mærket dideoxynukleotid hjælp af snapshot ™ Multiplex Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). GeneScan ™ 120 LIZ

® Size Standard blev anvendt som en intern DNA dimensionering stige for kapillær elektroforese (3100 Genetic Analyzer, aplied Biosystems, Foster City, CA, USA). Resultater blev analyseret med GeneScan ™ Analyse Version 3.5.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Primer Extension teknik har tidligere vist sig at være en gyldig teknik til at identificere mutationer eller polymorfismer [23, 24].

I tilfælde af afvigende resultater for KRAS mutation test vi reevalueres følsomheden med TheraScreen® KRAS testsystem.

TheraScreen® RAS Test.

The KRAS

Pyro Kit 24, V1 (Qiagen, Hilden, Tyskland) (dække mutationer i

KRAS

codon 12 , 13, og 61 af den menneskelige

KRAS

gen) og

RAS

Extension Pyro Kit 24, V1 (Qiagen, Hilden, Tyskland) (dække mutationer i

KRAS

codon 59, 61, 117 og 146 af den menneskelige

KRAS

gen) er blevet gennemført for validering detektion af mutationer af

KRAS

gen i genomisk DNA af rektal cancer eksemplar. Den PyroMark Q24 MDx platform platform er blevet brugt til at køre TheraScreen® analysen med Softwaren Q24, Version 2.0.7 med følgende plugins,

KRAS

PlugIn v1.2.0 og

RAS

Extention PlugIn v .1.2.1.2.

Vi forstærkede områder af interesse i det ekstraherede DNA ved anvendelse af primere i

KRAS

Pyro assay (QIAGEN, Hilden, Tyskland). Vi efterfølgende immobiliseret, vasket og denatureret de forstærkede produkter ved hjælp af vakuum arbejdsstation og udsat disse produkter til pyrosekventering bruge PyroMark Q24 Pyrosequencer (QIAGEN, Hilden, Tyskland) til at detektere og kvantificere de

KRAS

mutationer. Indledende DNA input til hver prøve var 100 ng.

cellelinjer.

Følgende humane kolorektale cancer cellelinjer huser angivet, adskiller

KRAS

mutation er blevet brugt til forsøgene beskrevet i dette manuskript: DLD1 (ATCC CCL-221) for G13D, SW1116 (ATCC CCL-233) til G12A, LS174T (ATCC CCL-188) for G12D, og ​​SKCO1 (ATCC HTB-39) til G12V. Som en negativ kontrol blev vildtype-KRAS genomisk DNA opnået fra den humane fibroblastcellelinie BJ (ATCC: CRL-2522). Alle cellelinjer er blevet købt fra ATCC (Manassas, Virginia, USA).

Resultater

Behandling af patienter, der lider lokalt avanceret endetarmskræft (UICC stadium II og III) omfatter neoadjuverende kemostråleterapi, resektion og adjuverende kemoterapi. I vores undersøgelse 32 (68,1%) mænd og 15 (31,9%) kvindelige patienter modtog neoadjuverende CRT efterfulgt af kirurgisk resektion og adjuverende kemoterapi (figur 1). Neoadjuverende CRT inkluderet bestråling af præsakrale plads med en samlet dosis på 50,4 Gy (enkelt dosis på 1,8 Gy) ledsaget af enten 5-fluoruracil (n = 24; 51,1%) eller en kombination af en intravenøs infusion af oxaliplatin og en kontinuerlig infusion af 5-fluorouracil (n = 23; 48,9%). Inden 4 til 6 uger efter afslutning af neoadjuverende CRT primær tumor resektion blev gennemført, herunder fuldstændig mesorectal excision efterfulgt af adjuverende kemoterapi.

KRAS

mutation status blev bestemt PCR-baseret snapshot ™ teknik fra biopsier opnået ved indeks rektoskopi og fra resektion prøver som vist i figur 1.

Primer Extension Metode Assay Nøjagtighed

En af de store faldgruber i PCR-baseret detektion af genomisk mutation repræsenterer følsomheden detektionsgrænse og kvaliteten af ​​anvendte primere i amplifikationstrinnet. For at vurdere vores primer, der anvendes vi humane kolorektale kræft cellelinjer huser forskellige genomisk

KRAS

mutationer. For at vurdere detektionsgrænse primerforlængelse assayet vi simulerede eventuel forurening af tumorceller med fibroblaster. Netop, vi brugte fire etablerede cellelinjer som model for en af ​​de betragtede KRAS-mutationer: DLD1 for G13D, SW1116 for G12A, LS174T for G12D, og ​​SKCO1 for G12V. For vildtype

KRAS

status genomisk den human fibroblast cellelinje BJ var ansat. Genomisk DNA fra hver af de fire tumorcellelinier blev seriefortyndet med den BJ linje og underkastes amplifikation ved PCR efterfulgt af snapshot ™ assay til. evaluere følsomhed af denne procedure. Derfor bestemte vi signalstyrken, dvs. arealet under kurverne (AUC), af toppe, der repræsenterer enten vildtype eller mutant

KRAS

allel i de forberedte serielle fortyndinger af positiv og negativ kontrol og beregnet en parvis forholdet mellem tilsvarende toppe (figur 2).

for alle

KRAS

mutation varianter, kunne vi vise, at det ansøgte snapshot ™ teknik repræsenterer en pålidelig test assay. Specifik

KRAS

mutationer G13D og G12A kunne detekteres pålideligt op til en kontaminerende fortynding med 90% fibroblast-DNA, nemlig G12D endda op til 99% og af G12V op til 80% demonstrerer høj følsomhed og klart antyder dette metode er i stand til at opdage alle betragtede

KRAS

mutationer i Mikrodissekterede biopsier og resektion eksemplar. Endvidere i alle testprøver korrekt opnåede vi den forventede

KRAS

mutation variant er defineret af den anvendte cancercellelinie.

I hvert tilfælde signalintensiteten repræsenteret AUC (areal under kurven ) af toppen detekteres i elektroferogram for mutanten (AUCmut) i forhold til vildtype (AUCwt) allel blev beregnet. Dette forhold blev hver henvist til prøve indeholdende 100% indført DNA af cancercellelinie med den respektive mutation (indstillet til 1,0). En regression linje blev beregnet med determinationskoefficienten (r

2) angivet. Hver serie blev vurderet tre gange uafhængigt med standardafvigelsen for hver fortynding betegnet som fejlsøjler.

KRAS

status mellem præ-terapeutiske biopsier

versus

tilsvarende post-terapeutisk resekteres specimen

KRAS

mutation status biopsier opnået ved indekset rektoskopi og tilsvarende resektion prøver efter kemo- og stråleterapi og efterfølgende resektion blev undersøgt i 47 patienter (Fig 1). I 20 ud af disse 47 patienter (42,6%) påviste vi en mutation i enten exon 2, 3 eller 4 (figur 3). De fleste af disse mutationer (12/20) påvirket codon 35. afvigelse på

KRAS

mutation status i prøver opnået ved indekset rektoskopi og i prøver fra de tilsvarende patienter efter CRT blev fundet i seks patienter (12,8% ) ved hjælp af snapshot ™ analysen. Alle af dem viste en

KRAS

mutation i den præ-terapeutisk biopsi, men blev bestemt til at være vildtype hvis analyse blev udført på et repræsentativt væv blok af de resektion eksemplar.

de afvigende sonder blev revurderet med en ekstra test system ved at bruge TheraScreen® KRAS-analysen. Ved hjælp af denne ekstra test assay, fire ud af de seks prøver afslørede en samstemmende KRAS mutation i prøverne opnået ved indekset rektoskopi og i de matchede resektion eksemplar. De resterende to tilfælde ikke kunne være blevet revurderet da ingen DNA var tilgængelig for reevaluering (tabel 2). Derudover TheraScreen® KRAS-analysen afslørede samme KRAS mutation i prøver fra indeks rektoskopi og kirurgisk resektion som Lad os foreslå disse resultater er pålidelige.

intratumoral heterogenitet inden biopsier fra indeks rektoskopi og kirurgisk resektion prøver

et potentielt problem i fastsættelsen af ​​

KRAS

mutation status ved at indsamle en enkelt biopsi repræsenterer fejlen prøvetagning. Denne faldgrube i diagnosen er baseret på den antagelse, at forskellige kloner af tumorceller eksisterer i solide tumorer huser potentielle heterogenitet i

KRAS

mutationer. For at vurdere betydningen af ​​intratumoral heterogenitet mellem flere biopsier i tumoren,

KRAS

mutation status blev vurderet i flere biopsier opnået ved indekset rektoskopi samt i tumorblokke fra kirurgisk resektion eksemplar. Til denne analyse kun sager med mere end én vævsprøve (biopsier fra indeks rektoskopi: range 2-5 biopsier per patient, kirurgisk resektion prøver: 3-5 væv blokke per patient) blev inkluderet (Fig 4)

.

i gennemsnit vi fået tre biopsier på indekset rektoskopi og udsat disse prøver for

KRAS

analyse. Kun i en enkelt patient, vi fandt uharmoniske resultater for

KRAS

test i to forskellige biopsier fra samme tumor analyseret af snapshot ™ analysen. En prøve viste en G12V mutation og den anden

KRAS

wild-tpye status. Disse to disharmoniske DNA-prøver blev henvist til TheraScreen® KRAS test. Desværre analysen mislykkedes, da der ikke toppe kunne detekteres. Til re-test ikke tilstrækkelig DNA mængde var til rådighed.

På grund af den høje tumorregression induceret af præoperativ CRT den intratumoral heterogenitet i kirurgisk resektion prøven kunne kun vurderes i en delmængde af 12 patienter, for hvem mere end en tumor-bærende blok var tilgængelig (gennemsnit på 4,2 blokke /patient). I seks ud af 12 patienter fandt vi en homogen

KRAS

status sammenligne mindst to blokke ved hjælp af snapshot ™ analysen. I de øvrige 6 patienter opdaget vi afvigende resultater for

KRAS

mutation status (tabel 3). Efter revurdering med TheraScreen®

KRAS

test kunne vi igen bekræfte præcis det

KRAS

mutationer, der blev konstateret i den forudgående biopsi af snapshot ™ analysen. Efter korrektion af uharmoniske data alle tumorblokke viste en homogen

KRAS

status.

Diskussion

Som det vigtigste resultat af denne undersøgelse i endetarmskræft synes der at være nogen tilsyneladende heterogenitet i

KRAS

mutation status. Det gælder udtaget fra tumorer ved samme lejlighed og for prøver konstaterede før og efter CRT. Denne analyse er baseret på et stort antal præ- og posttherapeutic prøver og repræsenterer derfor en sjælden datasæt. Givet en følsom påvisningsmetode i forhold til mængderne af levedygtige tumorceller, bestemmelse af

KRAS

mutation status kan udføres pålideligt i tumorprøver af præ-terapeutisk biopsi opnået ved indekset rektoskopi såvel i resekterede prøver efter neoadjuverende kemostråleterapi. Med hensyn til de præ-terapeutiske prøver naive for radio- og kemoterapi vises snapshot ™ assay at levere en pålidelig detektering værktøj, især hvis flere biopsier analyseres for at minimere risikoen for falsk-negative resultater. De overordnede antal af

KRAS

-mutated tumorer i den præ-terapeutiske biopsier af 43% (20/47) matches temmelig meget aktuelle litteratur data i dette nummer. Desuden er fordelingen af ​​de enkelte mutationer observerede var også meget i tråd med det hidtil rapporteret [25, 26]. Det gør os overbeviste om, at øjebliksbilledet ™ analysen giver pålidelige resultater i de præ-terapeutiske prøver, dvs. når et tilstrækkeligt antal levedygtige tumorceller er til stede. Med hensyn til prøver taget ved kemo- og stråleterapi, vores undersøgelse tyder på, at der bør foretrækkes en bestemt følsom metode ligesom FDA-godkendte Pyro TheraScreen® kit.

Vores resultater underbygger resultater fra Ondrejka et al. [14], som fandt ikke nogen uoverensstemmelse, når

KRAS

status i 17 patienter med endetarmskræft blev vurderet før og efter neoadjuverende CRT. De første resultater af næste generations sekventering og kvantitative analyser viser

KRAS

mutationer i det store flertal af neoplastiske celler [27]. I en undersøgelse for nylig offentliggjort af Demes et al. [15] i to ud af 25 patienter en afvigende

KRAS

status i prøver opnået før og efter blev opdaget terapi. Da de to teknikker, der anvendes (sekventering og Snapshot ™) er meget relateret det kan antages, at følsomheden i denne undersøgelse var sammenlignelig med snapshot ™ teknik vores undersøgelse og kan have undladt at identificere mutationer i meget nedbrudte prøver. Denne antagelse er i overensstemmelse med Boissière-Michot et al. [16], der for nylig påpeget, at især i endetarmskræft efter CRT falsk negativ påvisning af

KRAS

mutation status udgør et relevant problem muligvis kan føre til alvorlig pligtforsømmelse. Dette refererer til tekniske spørgsmål som en anden vigtigt resultat af denne undersøgelse.

de snapshot ™ analysen synes at have en god følsomhed at opdage

KRAS

mutationer i levende væv (dvs. præ-terapeutiske biopsier ) denne teknik ikke tilstrækkeligt registrerer muteret loci ved neoadjuverende CRT. Den mest sandsynlige forklaring er en massiv terapi-provokeret henfald af tumorceller. Inflammatoriske og stromale reaktioner resultere i en betydelig forøgelse af ikke-muterede celler i tumorområdet således “fortynding” de tilbageværende maligne celler. Anvendelsen af ​​en meget følsom teknik til mutationsanalyse afslørede fejlagtigt observerede ændringer. Dette er i overensstemmelse med en undersøgelse foretaget af Gonzalez de Castro D et al. have sammenlignet følsomhed Sanger sekventering, hvor snapshot ™ teknik er faktisk baseret, med cobas, TheraScreen og massiv parallel pyrosekventering [28] I tilfælde af lave fraktioner af mutant DNA Sanger sekventering var mindre følsom end de andre undersøgte metoder.

Boissière-Michot et al. [16] foreslog, at højere følsomhed kan opnås ved laser mikrodissektion og brugen af ​​TheraScreen® assay. I den foreliggende undersøgelse kan vi vise, at manuel mikrodissektion synes at være tilstrækkeligt til at indsamle tilstrækkelige mængder af tumorceller til DNA-analyse. Dette kan være relevant for klinisk praksis, især i mindre specialiserede centre, hvor laser mikrodissektion af tumorvæv er ikke ofte tilgængelig.

Som påpeget data om

KRAS

status test er stadig sjældent at vurdere den sande hastighed på afvigende tilfælde. Ved at tilføje heri største patient kohorte og analysere

KRAS

status i forskellige præ-terapeutiske biopsier fra samme tumor vi kan tilføje ekstra tillid til den kliniske praksis med

KRAS

test i endetarmskræft. Desuden er vi enige med Boissière-Michot et al. [16], at den type teknik, der anvendes til afprøvning skal udføres i henhold til den tilgængelige tumorvæv og finansielle ressourcer er af betydning, hvis indledende tumorvæv er af mindre kvantitet eller kvalitet. Dette er vigtigt, da patienter, der får anti-EGFR-behandling har en

KRAS

mutation lider unødige bivirkninger [29].

Konklusioner

Sammenfattende vores resultater indikerer pålidelig vurdering af

KRAS

mutation status til terapeutiske beslutninger i præ-terapeutiske biopsier samt i post-terapeutisk resterende tumorvæv. Uoverensstemmelse kan være en meget sjælden begivenhed og er praktisk ignorable. Snapshot ™ assay kan anvendes omkostningseffektivt for mutationsanalyse af tumor prøver med et højt tumor celleindhold, mens mere følsomme og dyre test bør forbeholdes resultatløse sager og for prøver med en lav mængde af tumorceller som dem efter CRT.