Abstrakt
epitelovariecancer (EOC) er den mest dødbringende af alle gynækologiske kræftformer, og omfatter forskellige histologiske undertyper, der har specifikke genetiske og væv-of-oprindelse forskelle. Æggestokkene klar celle carcinom (OCCC) udgør ca. 10% af tilfældene, og er blevet betegnet en stress lydhør kræft. OCCC er karakteriseret ved forøget ekspression af oxidativt stress og glycolyse-relaterede gener. I den foreliggende undersøgelse, vi hypotese, at bioenergetic profilering entydigt kan skelne OCCC fra andre EOC histologiske undertyper. Brug af et ekstracellulært flux analysator, OCCC linjer (ES-2, TOV-21-G) blev vist at være yderst metabolisk aktiv, med høj oxygenforbrugshastighed (OCR) og høj ekstracellulær forsuring rate (ECAR), indikerer øget mitokondriel oxidativ phosphorylering og glycolytisk sats hhv. En høj bioenergetik profil var forbundet med cellelinierne evne til at danne forankringsuafhængig sfæroider. I betragtning af deres høje glycolytiske og mitokondriel aktivitet, OCCC celler udviste stærk følsomhed over for 2-deoxy-D-glucose og Rotenone vækstinhibering, selv om dette kemosensitivitet profil ikke var specifik for kun OCCC celler. Bioenergetic profilering identificerede også en ikke-OCCC cellelinie, OVCA420, at have alvorligt kompromitteret mitokondriefunktionen, baseret på lav OCR og mangel på stimulation af maksimal respiration efter anvendelse af den afkobler FCCP. Dette var ledsaget af mitokondrie morfologi ændringer indikerer forbedret fission, forøget ekspression af mitokondrielle fission protein Drp1, et tab af mitokondrie membran potentiale og afhængighed af glykolyse. Vigtigt er, var dette tab af mitokondriefunktion ledsaget af manglende evne OVCA420 celler til at klare hypoxisk stress, og en kompromitteret evne til at stabilisere HIF-1α som respons på 1% O
2 hypoxi. Denne viden kan være nødvendigt for forskere planlægger at udnytte denne cellelinie til yderligere undersøgelser af metabolisme og hypoxi, og foreslår, at ændrede mitokondrie fission dynamik repræsenterer en fænotype af en delpopulation af EOCs
Henvisning:. Dier U, Shin DH , Hemachandra LPMP, Uusitalo LM, Hempel N (2014) bioenergetic Analyse af kræft i æggestokkene cellelinier: Profilering af histologiske subtyper og Identifikation af en mitokondrier-Defekt Cell line. PLoS ONE 9 (5): e98479. doi: 10,1371 /journal.pone.0098479
Redaktør: Jianhua Zhang, University of Alabama i Birmingham, USA
Modtaget: Januar 7, 2014 Accepteret: Maj 2, 2014 Udgivet: 23. maj 2014
Copyright: © 2014 Dier et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) giver R00CA143229 fra National Cancer Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
kræft i æggestokkene er stadig en af de dødeligste kræftformer hos kvinder, med en lille forbedring i den samlede overlevelse rapporteret over de sidste tre årtier. Det har vist sig, at ovariecancer er en bred betegnelse for en række forskellige sygdomme, deler det samme anatomiske placering inden den intraperitoneale (IP) hulrum. De fem undertyper af epitelial ovariecancer (EOC) afviger betydeligt i deres væv af oprindelse, genomiske markører og afhængighed af forskellige pro-tumorigen celle signalveje [1] – [3]. High-grade serøs ovariecancer (SOC) er den mest almindelige histologiske subtype og kendetegnet ved høj frekvens i TP53 mutationer, genomisk ustabilitet og som værende af æggelederen oprindelse [3], [4]. Æggestokkene klare celle carcinomer (OCCC) udgør ca. 10% af EOC sager i de vestlige befolkninger (op til 25% i de asiatiske populationer) [5]. OCCCs synes at bestå af heterogene subpopulationer udviser forskellige grader af genomiske aberrationer [6]. Den mest almindelige er forbundet med AT-rige interagerende domæne indeholdende protein 1A (ARID1A mutation -50%) [7], [8] og den PI3K pathway (PTEN tab ~ 40% [9], PIK3CA mutation [10]; AKT2 amplifikation [5]). ARID1A mutationer har tilladt forskere til at knytte tidlige OCCC læsioner med endometrioide væv og endometriose cyster [8], [11].
Mens der er betydelige forskelle i genomiske afvigelser mellem de enkelte OCCC prøve, Yamaguchi og kolleger har for nylig rapporteret en genekspression signatur, der entydigt forbundet med OCCC [12]. Især denne undersøgelse bekræftede andre rapporter, at OCCC er kendetegnet som en stress lydhør kræft [12] – [14]. Høj ekspression af antioxidant enzymer og gener associeret med glucosemetabolisme er også almindelige [12], [15]. Dette udtryk profil menes at repræsentere tilpasninger af OCCC mod stressfaktorer i tumormikromiljøet, herunder frit jern induceret redox stress og inflammation [16]. Nogle af disse ekspressionsvektorer ændringer er ligeledes observeret i endometriske cyster, hvilket yderligere antyder, at dette repræsenterer forstadie væv af OCCC [12].
Mens tidligt stadium OCCC patienter har generelt en bedre overlevelsesrate end tidlige stadie SOC patienter, stadium III og IV OCCC er forbundet med dårlig overlevelse. Desuden mindre end 10% af tilbagevendende OCCC reagerer på behandling, og denne histologisk subtype har været forbundet med høj cisplatin-resistens [5]. I betragtning af, at der er betydelige forskelle i OCCC genom og udtryk profil i forhold til SOC, er der behov for yderligere at forstå de molekylære mekanismer, som driver OCCC tumorigenese og progression til at skræddersy lægemidler for denne særlige histologisk undertype. Eftersom OCCCs er kendetegnet ved høj ekspression af mediatorer af den glycolytiske vej er formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge, om OCCC cellelinier også signifikant forskellige i deres bioenergetik profil sammenlignet med andre EOC celler i kultur. Brug levende celle målinger af ilt forbrug og ekstracellulær forsuring, var vi i stand til at fastslå, at OCCC cellelinjer er meget metabolisk. Desuden denne analyse afslørede et SOC cellelinje med defekt mitokondrie-funktion, der manifesterer sig i et underskud i hypoksisk respons af disse celler.
Materialer og metoder
cellelinier
OVCA420, OVCA429, OVCA433, DOV-13 og NOSE007 celler blev generøst leveret af Dr. Susan K. Murphy (Duke University) og dyrket i RPMI1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS). OVCA420, OVCA429, OVCA433, DOV-13 celler blev oprindeligt isoleret fra æggestokkene kræft patient ascites [17], [18]. NIHOVCAR3 celler (nævnt her som OVCAR3) og æggestokkene klar celle karcinom cellelinjer ES-2 og TOV-21-G blev købt fra ATCC. ES-2 celler blev dyrket i Modified McCoys 5a medium med 10% FBS. TOV-21-G-celler blev dyrket i en 01:01 blanding af MCDB 105 indeholdende 1,5 g /l natriumbicarbonat og Medium 199 indeholdende 2,2 g /l natriumbicarbonat, med 15% føtalt bovint serum. OVCAR3 celler blev holdt i RPMI1640 indeholdende 0,01 mg /ml bovint insulin og 20% FBS. Glutamin og Glucose afsavn blev udført ved hjælp af MP Biomedicals RPMI 1640 Medium, 1X Liq., W /o L-Glutamin og glukose.
bioenergetic Analyse af Oxygen Consumption Rate (OCR) og ekstracellulær Forsuring Rate (ECAR)
The Seahorse XF24
3 Ekstracellulær Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA) blev anvendt til at vurdere bioenergetic fænotyper af æggestokkene kræft cellelinjer. De ekstracellulære Flux Analyzer muliggør samtidig levende celler måling af oxygenforbrugshastigheden (OCR), en indikator for mitochondrial respiration, og ekstracellulære forsuringshastighed (ECAR), en indikator for netto proton tab under glycolyse. Forud for starten af eksperimentet blev celler jævnt podet (40.000 celler /brønd; efter optimering af celle såning nummer) i XF24 celledyrkningspladen og lov til at fæstne i 24 timer. Celledyrkningsmedier blev erstattet med XF medier (Seahorse Bioscience), mangler natriumbicarbonat og FBS efter forudgående vask med XF medier. Celler blev anbragt i et ikke-CO
2 37 ° C inkubator i 1 time før start af eksperimentet. OCR og ECAR blev målt over en 3 minutters periode, efterfulgt af 3 min blanding og re-oxygenering af medierne. Tre basale målinger rente blev taget før injektion af farmakologiske manipulatorer af mitochondriale respiratoriske kæde proteiner, også kendt som den mitokondriske stresstest. Flere bioenergetik parametre kan udledes ved at overvåge OCR svar på disse forbindelser [19]. Efter oprettelsen af en basal OCR læsning, er oligomycin A anvendes til at hæmme proton (H +) flyde gennem ATP syntase væsentlige blokerer alle ATP-linked iltforbrug. Maksimal respiration kan initieres ved at eksponere celler til carbonyl cyanid-ptrifluoromethoxyphenyl hydrazon (FCCP), som er en ionofor, der transporterer H + tværs mitokondriemembranen fører til kollaps af membranpotentiale og hurtig forbrug af O
2. Antimycin forhindrer mitokondriel respiration ved at blokere kompleks III (ubiquinon: Cytochrom B-C-kompleks). ATP syntase inhibering blev opnået ved at injicere 1 uM oligomycin A (Sigma), som blev efterfulgt af injektion af 750 nM FCCP (Sigma) til måling af maksimal OCR. Dette blev efterfulgt af tilsætning af 1 pM Antimycin A (Sigma) til at lukke alle mitokondrielle respiration. Tre målinger af OCR /ECAR blev opnået efter injektion af hvert lægemiddel og medikamentkoncentrationer optimeret på cellelinier forud for eksperimenter. OCR og ECAR aflæsninger blev normaliseret til total proteinniveauer (BCA protein assay, Pierce) i hver brønd. Hver cellelinje blev repræsenteret i 5 brønde pr eksperiment og kopiere forsøg udført mindst tre gange. Basal respiration blev afledt ved at subtrahere den tredje OCR læsning, efter antimycin desuden fra den tredje basal OCR læsning. Respiratorisk stat tilsyneladende, en angivelse af den mitokondriske respiratorisk tilstand, blev beregnet ved anvendelse: 4- (Basal OCR-Oligo OCR) /(FCCP OCR-Oligo OCR) [20]. Før påbegyndelse af disse eksperimenter dosisresponskurver (100 nM-3 uM) blev udført for at fastslå koncentrationen af FCCP nødvendig for at opnå maksimal OCR. Alle cellelinier reagerede ved at opnå et plateau af maksimal OCR på 750 nM FCCP, med hæmning af OCR observeret ved 3 pM i nogle cellelinjer (OVCA429, Ovca433, OVCAR3, ES-2). OVCA420 celler reagerede ikke på FCCP ved nogen af de testede koncentrationer
Fast tid semi kvantitativ RT-PCR
Efter RNA isolation. (RNeasy Mini Kit, Qiagen) og revers transskription hjælp iScript cDNA Synthesis (BioRad), tidstro semikvantitativ RT-PCR blev udført på et Applied Biosystems 7500 real Time PCR variator, under anvendelse iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Følgende primerpar blev anvendt til semikvantitativ real time RT-PCR-analyse: HNF-1β sense: 5′-GCCCACACACCACTTACTTCG-3 ‘; HNF-1β antisense, 5’-GTCCGTCAGGTAAGCAGGGAC-3 ‘[21]. GLUT-1 sense 5’-CATCCTTATTGCCCAGGTGTTT-3 ‘; GLUT-1 antisense 5’-GAAGACGACACTGAGCAGCAGA-3 ‘[22]. Data blev analyseret ved hjælp af den komparative CT-metoden med værdier normaliseret til p-actin niveauer, og udtrykkes i forhold til niveauer i NOSE007 celler.
Sfæroide Formation Assay
Ovariecancer cellelinier blev udsået (1000 celler /godt) i 96 godt rund bund ultralave vedhæftning (ULA) plader (Corning) og overvåges for klumpformet aggregatdannelse op til dag 9 under normale dyrkningsbetingelser (fuldt suppleret medier, 37 ° C, 21% O
2, 5 % CO
2).
Cell levedygtighed assays
Lige antal af celler blev podet i plader med 96 brønde og cellelevedygtighed som reaktion på kemoterapeutiske midler målt efter 72 timers lægemiddelbehandling med indikeret doser. Cellelevedygtighed blev vurderet ved krystalviolet-optagelse. Kort beskrevet blev celler farvet med krystalviolet i 10 minutter, efterfulgt af vask i PBS og H
2O. Krystalviolet farvestof blev frigivet fra celler ved anvendelse 30% eddikesyre og absorbansen måles ved 590 nm under anvendelse af en SpectraMax Paradigm Molecular Devices mikropladelæser. Cellelevedygtighed blev udtrykt som procent levedygtighed i forhold til ikke-behandlede celler. Cisplatin (cis-Diamineplatinum (II) dichlorid), paclitaxel og 2-deoxy-D-glucose (2-DG) blev indkøbt fra Sigma. Rotenon blev opnået fra Søhest Biosciences.
Mitotracker farvning
Celler dyrket på dækglas blev inkuberet med 250 nM Mitotracker Red CMX ROS (Life Technologies) i 15 minutter, efterfulgt af vask i PBS og fiksering med 4% paraformaldehyd. Prøverne blev monteret på dias ved hjælp Prolong Guld /DAPI (Life Technologies) og filmede med en eVOSfl AMG LED-baserede fluorescerende mikroskop (100x olie nedsænkning mål).
mtDNA /nDNA forholdet real time RT-PCR
til kvantificering mitokondrier DNA (mtDNA) og nuklear DNA (nDNA) totalt DNA fra ovariecancerceller blev ekstraheret under anvendelse AllPrep DNA /RNA /Protein Mini Kit (Qiagen), som blev fortyndet til en endelig koncentration på 10 ng /pl. For at kvantificere den relative mtDNA: nDNA forholdet følgende primere blev anvendt; 16S rRNA-genet fra mitokondrie (mt) DNA (sense: 5′-CCAAACCCACTCCACCTTAC-3 ‘; antisense: 5′-TCATCTTTCCCTTGCGGTA-3′); 18S rRNA af nukleart (n) DNA (sense: 5’-AGAAACGGCTACCACATCCA-3 ‘, antisense: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3’) [23], [24]. CT-værdier for mt16S og n18S blev opnået efter Real time PCR af 50 ng total DNA under anvendelse iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad), ved en annealingstemperatur på 59 ° C.
mitokondriemembranen potentiel
mitochondriemembranpotential blev målt under anvendelse JC-1 farvestof (5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodid; Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev celler inkuberet med 10 pg /ml JC-1 farvestof i 15 min og fluorescens billeder taget med et 20 x objektiv. Forholdet mellem rød fluorescens JC-1 aggregater og grønne JC-1-monomerer blev målt ved anvendelse billede J, følgende billede baggrund korrektion.
Clonogenicity
Celler blev podet (100 celler /brønd) i en 6 brønds plade og dyrkes i 10 dage under normale dyrkningsbetingelser (21% O
2) eller hypoxi (1% O
2, Biospherix hypoxisk kammer). Clonogenicity blev vurderet ved farvning kolonier med krystalviolet og antallet af kolonier tælles ved hjælp Billede J og data udtrykt som cellulær overlevelse fraktion.
Immunoblotting
Cellelinjer blev dyrket i 10 cm retter til sub-sammenløb og lyseret i RIPA-buffer (+ proteasehæmmere), efterfulgt af elektroforese på 4-12% SDS-PAGE geler (Bio-Rad). Efter western overførsel blev membraner undersøgt med primær Anti-Drp1 antistof (Millipore) eller GAPDH (Applied Biosystems-Life Technologies) natten over i 5% fedtfri mælk /TBS, 0,1% Tween20. Efter sekundær antistof inkubation blots blev visualiseret ved hjælp af Femto eller Pico chemiluminescens substrat (Thermo Scientific). For HIF-1α analyse blev celler dyrket under hypoxiske betingelser (1% O
2) i to timer. Celler blev straks lyseret i 2x SDS-prøvebuffer og ens mængder indlæst på SDS-PAGE (4-12%, Bio-Rad) efterfulgt af western transfer og immunoblotting for HIF-1α og β-actin loading kontrol. Anti-HIF-1α antistof blev købt fra BD Transduction Laboratories og β-actin antistof fra Applied Biosystems-Life Technologies.
data og statistiske analyser
Alle data er repræsentative for mindst tre replikere eksperimenter. Billede J blev anvendt til at kvantificere relative fluorescens og måle klumpformet arealstørrelse. Alle data er repræsenteret som middelværdi ± standardfejl på middelværdien. Statistisk data analyse (ANOVA med Tukey indlæg test, eller T-test) blev udført ved hjælp af GraphPad Prism Software (v6), og data anses for signifikant ved p . 0,05
Resultater
Respiratory Profile af kræft i æggestokkene cellelinier
for at karakterisere bioenergetik profil æggestokkene kræftcellelinjer vi udnyttet en ekstracellulær flux analysator til at bestemme levende celle iltforbrug sats (OCR) og ekstracellulær forsuring sats (ECAR; Seahorse Bioscience). To OCCC cellelinjer, ES-2 og TOV-21-G, blev sammenlignet med ikke-OCCC EOC cellelinier (OVCA420, OVCA429, OVCA433, Dov-13, OVCAR3) og en normal ovarie overflade epitelial cellelinje (NOSE007).
Figur 1A viser OCR af cellelinier som reaktion på forbindelser anvendt i den mitokondriske stresstest over tid. Basal og ATP-afhængige OCR aflæsninger viste, at de fleste af de testede cancercellelinier, med undtagelse af OVCA420 celler, havde signifikant højere OCR forhold til en normal ovarie overflade epitelial cellelinje (NOSE007, fig 1B 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 statistisk signifikant sammenlignet med NOSE007; # p 0,05, ## p 0,01, ### p 0,001, #### p 0,0001 statistisk signifikant sammenlignet med OVCA420). OCCC cellelinjer er fremhævet i sort og en normal epitelial cellelinje i hvidt. G. Gennemsnitlig Respiratory stat
Tilsyneladende blev beregnet ud fra 3-4 replikative forsøg med:. 4- (Basal OCR-Oligo OCR) /(FCCP OCR-Oligo OCR)
Mens alle kræftceller klart havde høj mitokondrie respiration i forhold til NOSE007 celler vi ikke observere en signifikant forskel i respiratoriske parametre mellem OCCC celler og andre æggestokkene kræftceller, hvilket tyder på, at mitokondrie iltforbrug profil ikke skelner ovariecancer histologiske undertyper. Men ved hjælp af denne metode var vi i stand til at identificere OVCA420 celler som havende mangelfuld mitokondriefunktionen, indikeret ved lav basal OCR og manglende reaktion på FCCP.
OCCC celler har høj ekstracellulær forsuring rate
Samtidig måling OCR, ekstracellulær flux analyse giver mulighed for vurdering af ekstracellulær forsuring sats (ECAR) af kulturmedier. Dette betragtes som en indirekte analyse af den glycolytiske sats af celler [19]. OCCC cellelinier ES-2 og TOV-21-G vist høj basal ECAR, hvorimod andre cellelinie havde lavere ECAR, ligner NOSE007 (figur 2A). Oligomycin A blev anvendt til at stimulere maksimal ECAR, der lukker ned ATP-afhængige OCR, effektivt skiftende stofskifte fra oxidativ fosforylering til glykolysen (figur 2B). Forskellen mellem maksimal og basale ECAR anses den glycolytiske reservekapacitet af celler (figur 2C). OVCA420 celler, som viste defekte mitokondrier respiration (figur 1), havde også lav glykolytisk reservekapacitet, hvilket indikerer disse celler opererer tæt på deres maksimale glykolytisk sats som en erstatning for tab af OCR. Dette tyder på en afhængighed af glycolyse af OVCA420 celler. Den normale epitelcellelinie NOSE007 viste den laveste glycolytiske reserve, hvilket antyder, at deres evne til glykolyse er lavere end for de andre cancercellelinjer.
A. Basal ECAR niveauer blev målt under anvendelse af et ekstracellulært flux analysator (Seahorse Bioscience). B. Maksimal ECAR blev stimuleret ved tilsætning af 1 pM oligomycin A. C. glykolytisk reservekapacitet blev beregnet som forskellen mellem maksimal og basal OCR. Data fra en replikativ eksperiment er vist (n = 5, ANOVA, Tukey post test * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 statistisk signifikant sammenlignet med NOSE007; # p 0,01, ### p. 0,001 statistisk signifikant sammenlignet med OVCA420)
bioenergetik profil
for at opnå en bedre samlet billede af bioenergetik profil de ovarian cancer cellelinjer undersøgt vi plottet basal ECAR mod mitokondrie OCR (figur 3A). Dette viste klart, hvordan de forskellige cellelinier falder i adskillige bioenergetik kategorier. Vi fandt 3 forskellige grupper af cellulære bioenergetik profiler. OCCC celler TOV-21-G og ES-2 klart repræsenterer meget energiske celler med høj respiration og glykolyse. OVCAR3 celler på samme måde viste dette mønster. OVCA433, OVCA429 og DOV-13 havde en mere aerob fænotype, mens NOSE007 og OVCA420 celler var de mindst energiske celler, med både lav OCR og ECAR. Det skal bemærkes, at i modsætning til OCR, de ECAR målingerne var mere variabel mellem eksperimentelle dage, som var særlig tydeligt for OVCAR3 og DOV-13 cellelinier (figur 3A). Interessant, de mere aerobe celler OVCA433, OVCA429 og DOV-13 havde en relativ høj glykolytisk reserve, hvilket tyder på, at disse celler er i stand til at rampe op deres glykolytisk aktivitet, når det er nødvendigt, som det kan være tilfældet under hypoxiske betingelser (figur 3B). ES-2 celler udviste de laveste reservekapacitet, hvilket indikerer, at denne cellelinie kan operere tæt på sin maksimale respiratoriske og glycolytiske kapacitet under normale dyrkningsbetingelser (figur 3B). Når man overvejer både OCR og ECAR parametre, vores data tyder på, at OCCC celler er meget energisk, bygger på både oxidative phosphorylering og glykolyse at opfylde deres energibehov. Dog kan respiratoriske og glycolytiske profiler ikke være tilstrækkeligt at differentiere OCCC celler fra andre histologiske undertyper, som OVCAR3 celler deler lignende bioenergetik karakteristika.
A. Plotning Basal ECAR og OCR-niveauer giver en snap-shot af bioenergetik profiler af æggestokkene kræft cellelinjer undersøgt. OCCC cellelinier ES-2 og TOV-21-G samt OVCAR3 celler udviser høj glykolyse og oxidativ phosphorylering og klassificeres derfor som yderst energiske celler. B. Plotting glykolytisk Reserve mod Respiratory reserve tyder på, at nogle celler synes at være operere tæt på maksimal hastighed, som ES-2-celler, mens andre har høj respiratorisk reserve (NOSE007) eller høj glykolytisk Reserve (DOV-13, OVCA429). OCCC cellelinjer er mærket som sorte trekanter, andre EOC cellelinjer som grå cirkler (OVCA420 som cirkel med X), og de normale epiteliale cellelinjer NOSE007 som en hvid firkant. Data i A og C repræsenterer gennemsnittet af gennemsnitlige OCR og ECAR aflæsninger 3-4 eksperimentelle replikater C. Sfæroide dannelse korrelerer med bioenergetic underskrift æggestokkene cancerceller. Celler blev podet i ULA plader og størrelse (areal af sfæroide aggregat i pixel) afbildet (n = 6).
Evnen til at overleve som forankringsuafhængig sfæroid aggregat spiller en stor rolle i den transcoelomic rute af ovariecancer metastase gennem IP hulrum. Vi vurderede derfor, om en høj bioenergetik profil giver en fordel i klumpformet dannelse og overlevelse. Interessant højenergiske celler, ES-2, TOV-21-G og OVCAR3 var i stand til at danne og opretholde store sfæroide aggregater når podet på vedhæftede overflader ultralave (figur 3C). Mens OCCC sphæroider fortsatte med at stige i størrelse, OVCAR3 aggregater begyndte at opdele på dag 9. Celler med en mere aerob fænotype var enten ude af stand til at danne sfæroider (Dov-13), eller at opretholde aggregater under forankringsuafhængige vækstbetingelser uden dag 4 (OVCA429 OVCA433). NOSE007 og OVCA420 var i stand til at danne meget små sfæroide aggregater, som ikke øger i størrelse og begyndte at gå i opløsning efter dag 4 og dag 9 hhv. Disse data indikerer, at en høj bioenergetik signatur (høj OCR og ECAR) kan være forbundet med evnen til at danne sfæroider, potentielt medvirken anoikis-modstand og forankringsuafhængig celleproliferation.
Forholdet mellem Bioenergetik til kemosensitivitet profiler
Da identifikationen af forskellige bioenergetik underskrifter i vores sæt af æggestokkene kræft cellelinjer, vi ønskede at udforske, om dette er prædiktiv for cellelinie respons på kemoterapeutika. Cisplatin og paclitaxel er almindeligt anvendte midler til behandling af ovariecancer. Udviklingen af resistens over for Cisplatin er et fælles træk for kræft i æggestokkene og OCCC er blevet karakteriseret som en meget cisplatin-resistente histologisk undertype. Derfor var det overraskende at se et kraftigt fald i cellelevedygtighed i ES-2 og TOV-21-G-celler som respons på denne forbindelse (figur 4A). OVCA429 og OVCA433 celler havde den største respons på paclitaxel, efterfulgt af ES-2 og TOV-21G-celler (figur 4B). Der var imidlertid ikke noget klart mønster forbundet med cisplatin og paclitaxel følsomhed og bioenergetik fænotype.
Celler blev behandlet med angivne doser for 72A. Cisplatin, B. Paclitaxel, C. 2-deoxyglucose (2-DG), D. Resveratrol, E. Metformin, F. rotenon, og G. kombinationsbehandling af lavdosis Rotenone (R; 0,1 uM) og 2-DG (2 mM). Data fra en replikativ eksperiment er vist (n = 5-6, A-F: ANOVA, Tukey post test * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, **** p 0,0001 signifikant mindre cellelevedygtighed sammenlignet med NOSE007 ved samme koncentration behandling; G: t-test, statistisk signifikant sammenlignet med hver cellelinje behandling med rotenon alene [* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001, *** * p 0,0001], eller 2-DG alene [# p 0,05, ## p 0,01, ### p 0,001, #### p 0,0001]). Stjernerne fremhæve OVCA420 celler, som har defekte mitokondrier åndedræt. H. Ekspression af GLUT-1 og HNF-1β besked i Æggestokkræftceller, som bedømt ved semikvantitativ real time RT-PCR. Expression var korreleret til niveauer i NOSE007 celler (n = 3; ND = ingen målbar signal registreret).
I betragtning af den høje ECAR observeret i OCCC celler, var det ikke overraskende, at ES-2 og TOV-21-G-celler viste højeste respons på den glycolytiske inhibitor 2-deoxy-D-glucose (2-DG, figur 4C). OVCAR3 celler var mere resistente over for 2-DG, der kan støttes af deres høje variabilitet i ECAR aflæsninger (figur 3A). OVCAR3 celler udviste også lidt højere åndedrætsfunktion end OCCC cellelinier (figur 1 i), som kan indebære, at disse celler er i stand til at rampe op deres oxidative fosforylering som reaktion på glycolyse nedlukning mere effektivt. Alternative manipulatorer af glycolyse, herunder Resveratrol og metformin i lignende cellelevedygtighed profiler som opnået ved 2-DG (figur 4D & E). NOSE007, DOV-13 og OVCAR3 celler var generelt mere modstandsdygtige over for disse forbindelser. Som forventet, OVCA420 celler var modtagelige for glykolysen hæmning af 2-DG, Resveratrol og Metformin, men dette var ikke markant forskellig fra OVCA429 eller OVCA433 celler.
I forhold til NOSE007 celler, OVCA429, OVCA433, og OCCC celle lines ES-2 og TOV-21-G-celler havde en betydelig reduktion i cellelevedygtighed som reaktion på mitokondrie-inhibitoren Rotenone (Figur 4F). Dette kan være forbundet med deres store afhængighed af mitokondriel respiration, som er særlig tydelig for OVCA429 og OVCA433 celler. NOSE007 og DOV13 celler, som havde en samlet lavere OCR profil var mindre følsomme over for mitokondrisk inhibering med rotenon i en dosis på 1 uM. Interessant, dette mønster af rotenon følsomhed var parallel med paclitaxel (figur 4B), hvilket antyder, at Paclitaxel kan have stærkere aktivitet på celler med forøget mitokondriel respiration. Udover mediere mikrotubulus-afhængige effekter har Paclitaxel blevet vist at fremkalde dens apoptotiske virkninger
via
mitokondrierne [25] – [27]. Behovet for funktionel mitokondrier i fremkalde Paclitaxel toksicitet blev også fremhævet af manglen på OVCA420 reaktion på dette stof. Celler med øget følsomhed over for 2-DG, blev mere effektivt målrettet ved kombinationsbehandling af lav dosis 2-DG (2 mM) og Rotenon (100 nM), med højeste drab observeret i i OVCA420, OVCA429, OVCA433 og de to OCCC cellelinjer ES-2 og TOV-21-G (figur 4G).
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.