PLoS ONE: Modulation af Leptin Receptor medierer tumorvækst og Migration af kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Fedme er blevet impliceret som en væsentlig risikofaktor for udvikling af kræft i bugspytkirtlen. I indstillingen af ​​fedme, er en systemisk kronisk inflammatorisk respons karakteriseret ved ændringer i produktionen og udskillelsen af ​​en bred vifte af vækstfaktorer. Leptin er et hormon, hvis niveau stiger drastisk i serum hos overvægtige patienter. Diæt med højt fedtindhold induceret fedme hos mus fører til en samlet øget kropsvægt, pancreas vægt, serum leptin, og pancreasvæv leptin niveauer. Her rapporterer vi bidrag fedme og leptin til bugspytkirtlen vækst kræft udnytte en

in vivo

ortotopisk murine bugspytkirtelkræft model, hvilket resulterede i øget tumor spredning med samtidig øget tumor byrde i kosten inducerede fede mus i forhold til lean mus . Humane og murine pancreas cancer cellelinjer viste sig at udtrykke den korte og den lange form af leptin-receptoren og funktionelt reagerede på leptin induceret aktivering ved øget phosphorylering af AKT473. In vitro leptin stimulering forøget cellulær migration, som blev blokeret ved tilsætning af en PI3K-inhibitor. In vivo, udtynding af leptin-receptoren gennem shRNA knockdown delvist ophævet øget ortotopisk tumorvækst hos overvægtige mus. Disse resultater tyder på, at leptin bidrager til pancreas tumor vækst gennem aktivering af PI3K /AKT-vejen, som fremmer pancreas tumor celle migration

Henvisning:. Mendonsa AM, Chalfant MC, Gorden LD, VanSaun MN (2015) Modulation af den leptin Receptor medierer tumorvækst og Migration af bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 10 (4): e0126686. doi: 10,1371 /journal.pone.0126686

Academic Redaktør: Jose G. Trevino, University of Florida, USA

Modtaget: Oktober 17, 2014 Accepteret: April 7, 2015; Udgivet: April 28, 2015

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information fil

Finansiering: Forskning blev støttet af 2010 i bugspytkirtlen Cancer Action Network-AACR Career Development Award, Grant Number 10-20-25-VANS og NIH # 5U01CA143072 ydet støtte løn for AMM, MCC, MNV, og LG. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

fedme og diabetes er blevet vist at være uafhængige risikofaktorer for udvikling af en række epiteliale cancere, herunder pancreas adenocarcinom. På verdensplan har fedme steget i et hidtil uset hastighed i det seneste årti [1]. Fedme kompliceres af det metaboliske syndrom og type 2 diabetes mellitus er sædvanligvis comorbide betingelser [2]. Det er blevet foreslået, at diabetes kan være knyttet til udviklingen og progressionen af ​​pancreascancer som 80% af patienter med pancreascancer oplever en form for diabetes eller ændret insulinfølsomhed [3]. Body mass index (BMI) og en 10 cm forøgelse taljemål billede en øget relativ risiko på 1,11 for forekomst af pancreascancer [4]. Yderligere er murine modeller vist vigtigheden af ​​kost på udviklingen af ​​pancreascancer [5, 6].

Kronisk fedme fører til ændringer i produktionen og udskillelsen af ​​adipokiner, cytokinerne udskilles af fedtvæv [ ,,,0],7-12]. Leptin er et sådant adipokine som er dramatisk forøget i de overvægtige patienter [8, 9]. Leptin, typisk kendt for sin evne til at regulere energiforbrug og mæthed [13], binder til multiple isoformer af leptin (ob; fede) receptor. Den korte form af receptoren vides at signalere gennem PI3K /AKT pathway mens den lange form af leptin-receptoren er kendt for at signalere gennem JAK-STAT pathway og inducere phosphorylering af STAT3 [14-16]. Øget leptin er blevet rapporteret i undergrupper af kræftpatienter og demonstreret at stimulere proliferation af tyktarmskræft celler, brystkræft celle migration, gliom migration og invasion, samt væksten i cholangiocarcinoma celler

in vitro

. [17-21]

rolle leptin og leptin receptor signalering i bugspytkirtlen udvikling kræft og progression forbliver dårligt defineret. Tidlige undersøgelser viste at

in vitro

behandling af pankreatiske cancerceller med lave niveauer af leptin inducerede et fald i metabolisk aktivitet [22].

In vitro Salg undersøgelser viste vækst og metastase af et murint pankreatisk cancercellelinie viste sig at blive forøget i genetisk fede mus forårsaget af tab af leptin eller tab af den lange isoform af leptin-receptoren [23]. Tumoral adipocytter blev også vist sig at være positivt korreleret med spredning af kræft i bugspytkirtlen xenografter implanteret i fede mus [24]. Derudover blev ikke-alkoholiske fede bugspytkirtlen sygdom (NAFPD) og steatopancreatitis fundet repræsenterer en potentielt væsentlig risikofaktor for menneskers bugspytkirtelkræft [25].

For at forstå, om tumor udtryk for leptin receptorer reguleret væksten af ​​pancreascancer i indstillingen af ​​fedme, vi orthotopisk injiceret bugspytkirtelkræftceller hos magre og fede mus anvender interferens RNA teknologi til at udtømme leptin receptor fra pankreatiske cancerceller. Resultaterne viser, at leptin receptor udtryk potenserer pancreas tumorvækst uafhængig af tumorcelleproliferation.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med vejledningen for den Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health og godkendelsen af ​​Vanderbilt Institutional Animal Care og brug Udvalg /Office of Animal Welfare Assurance (M /12/277). Animal boliger og pleje var i overensstemmelse med et akkrediteret laboratorium dyr facilitet. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med godkendte metoder til at reducere antallet af dyr og eventuelle dyr ubehag.

Mus og kost Manipulation

Otte uger gamle C57BL /6J hanmus blev opnået fra Jackson Research Laboratorier, adskilt i passende bure og fodret enten en mager kost på 13,5% fedt (5001, LabDiet: 13.5% kalorier fra fedt, 58% fra kulhydrater, og 28,5% fra protein) eller fodret en fedme inducerer kost på 42% fedt “DIO , kost-induceret fedme “(TD.88137, Harlan Teklad: 42% kalorier fra fedt, 42,7% fra kulhydrater, og 15,2% fra protein) ad libitum. Kropsvægt og total pancreas vægt blev målt efter tre måneder på diæt. Plasma blev opsamlet fra mus og leptin niveauer blev vurderet gennem en muse specifik Quantikine assay ifølge producentens protokol (R CRL-1420, CRL-1469, EF- referencelaboratoriet 1687). Luciferase mærkede cellelinjer blev frembragt ved at inficere cellelinjerne med en kommerciel lentiviral titer for ildflue-luciferase (Genecopoeia, LPP-Fluc-LV105-025 indeholdende 1×10

8 TU /ml). Ikke-inficerede celler blev elimineret efter tilsætning af puromycin (10 ug /ml, Sigma). Luciferase ekspression blev bekræftet for hver linje gennem One-Glo-analyse (Pierce).

Realtime PCR-analyse

RNA blev ekstraheret fra hver cellelinje ved anvendelse af en kombineret Qiazol ekstraktion og Qiagen RNeasy mini kit oprensning. Et mikrogram af total RNA blev revers transkriberet under anvendelse af de høj kapacitet cDNA revers transkription kit (Applied Biosystems). Real-time PCR blev udført under anvendelse af specifikke primere for den murine leptin receptor; QT00154133, QT01045380, og QT01045373 (Qiagen) i kombination med iQ SYBR green Supermix kit (Bio-Rad) ifølge fabrikantens instruktioner i en CFX96 real time PCR detection system (Bio-Rad). Hver udskrift i hver prøve blev analyseret tre gange, og fold-change forhold mellem eksperimentelle og kontrolprøver for hvert gen, der anvendes i analysen, blev beregnet ved hjælp af 18S niveauer som reference. Human leptin receptor kvantitative primere var som følger for en fælles region af leptin receptor (frem: 5’TTGTGCCAGTAATTATTTCCTCTT, revers: 5’CACACCAAAGAATGAAAAAGCTAT), den korte form af leptin-receptor (frem: 5’TTCCTGGGCACAAGGACTTA, revers: 5’GCTCCAAAAGAAGAGGACCA) og den lange form af leptin receptor (frem: 5’TTCCTGGGCACAAGGACTTA, revers: 5’TTTGTGTCCCTGGGTACTTGA). Humane leptin receptor primere til RT-PCR anvendes en fælles fremadrettet primer 5’CGTGCAGTCACTCAGTGCTTA og reverse primere til påvisning af korte formular 5’TTTGTGTCCCTGGGTACTTGA eller den lange form 5’GCTCCAAAAGAAGAGGACCA. Kontrol primere til human beta actin var frem 5’GAGCACAGAGCCTCGCCTTT og omvendt 5’ATCCTTCTGACCCATGCCCA.

Edu proliferationsanalysen

Proliferation blev vurderet ved brug af en edu flowcytometrisk-baseret analyse. Kort fortalt, 1×10

5-celler blev udpladet i hver brønd i en plade med 24 og fastgøres natten. Celler blev derefter serumudsultet i 8 timer, efterfulgt af egnede behandlinger i yderligere 24 timer. Edu blev tilsat til dyrkningsmediet på 25 pM i løbet af de sidste 3 timer af behandlingen til inkorporering. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev cellerne frigjort med trypsin /EDTA og derefter vasket med PEB (PBS /2 mM EDTA /1% BSA). Celler blev fikseret med 2% bufret formalin i 30 minutter ved stuetemperatur, centrifugeret ved 300 x g, aspireret, og derefter skyllet i PBS indeholdende 1% BSA. Celler blev permeabiliseret ved tilsætning af 0,25% Triton i 15 minutter, pelleteret ved 450xg, og derefter vasket med PBS /BSA og pelleteret igen. Celler blev mærket i en reaktionsblanding indeholdende 150 mM Tris pH 8,5, 1,5 mM CuSO4, 10 mM 647-azid, og 100 mM ascorbinsyre (tilsat i rækkefølge) i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Reaktionen blev standset ved 5 ganges tilsætning af PEB buffer. Celler blev mærket med 1 ug /ml propidiumiodid og pelleteret ved 450xg. Celler blev resuspenderet i 250 pi PEB og kvantificeres derefter ved flowcytometri på en Accuri C6 cytometer. Cellerne blev gated af SSC vs FSC og målt for procentdelen af ​​PI positive celler i Edu-647 positive værdi gate.

Migration assay

Cell migration blev vurderet ved en ridse assay. Bugspytkirtelkræftceller (2,5 x 10

5 celler /brønd) blev podet i komplette medier og tilladt at adhærere natten over og nå konfluens. Ved Confluence celler blev serumudsultet i 8 timer. Celler blev derefter ridset med en pipettespids for at frembringe et sår uden celler og medium blev ændret til de passende behandlingsbetingelser. Leptin blev indgivet med 250 ng /ml med og uden tilsætning af LY294002 (20pM, Sigma) og dyrket i yderligere 24 timer ved 37 ° C i 5% CO

2. Den ridse bredde blev registreret umiddelbart efter bunden og igen ved 24 timer efter bunden. Den ridse bredde blev beregnet ved tre positioner i hver brønd og udtrykt som et gennemsnit og derefter målt i fire forsøg.

Western Analyse

Lysater fra kræft i bugspytkirtlen cellelinjer blev indsamlet i iskold RIPA buffer (50 mM Tris pH 7,4, 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 10 mM NaF, 1 mM Na

3VO

4, 0,5% natriumdeoxycholat og 1% Triton X-100) med bredspektret komplet mini protease inhibitor cocktail (Roche) samt phosphatase inhibitor cocktail (Cell Signaling, 5870S). Lysater blev kortvarigt lydbehandlet, centrifugeret ved 10000xg i 15 minutter og total proteinkoncentration i supernatanten blev målt via BCA proteinanalyse (Pierce). Kontrol lysat COLO 320DM blev opnået fra Santa Cruz (sc-2226). 25μgs af lysater blev separeret via SDS-PAGE, overført til nitrocellulose, blokeret med 3% BSA og derefter blottet med primært antistof: LepR (SantaCruz (K-20), sc-1835 1: 250 og (H-300) sc-8325 1: 250), pAKT473 (Cell Signaling, 4060S 1: 1000), takt (Cell Signaling, 4821S 1: 1000), pSTAT3 (Cell Signaling, 9145L 1: 1000), tSTAT3 (Abcam, ab5073 1: 1000), pAMPK ( Abcam, Ab133448 1: 1000), tAMPK (Cell Signaling, 2603S 1: 1000), og Actin (Abgent, AM1829b 1: 3000). Passende sekundære antistoffer konjugeret til IR680 og IR800 (Rockland 1: 10000) blev anvendt sammen med Odyssey Billedindsamling og densitometrisk analyse (Li-Cor Biosciences). Densitometri for Pakt blev sammenlignet med Takt niveauer og pSTAT3 blev sammenlignet med tSTAT3 niveau, som blev derefter sammenlignet med den tidspunkterne nul eller forældrekontrol. Densitometri for kontrol- og leptin receptor knockdown linjer blev sammenlignet med actin og derefter normaliseret til forældrenes niveauer.

shRNAmir Knockdown

Lentivirale titre blev produceret fra GIPZ vektorkonstruktioner fra flere regioner i murine leptin receptor ( V2LMM 70.436 og V2LMM 190.793, ThermoScientific) eller til en kontrol vektor (RHS4480) under anvendelse af Trans-Lentiviral emballage ifølge fabrikantens protokol (Open Biosystems). Lentivirale titer supernatanter blev koncentreret under anvendelse Lenti-Pac koncentration opløsning og 2.5×10

5 bugspytkirtelkræftceller blev transduceret i overensstemmelse med producentens anbefalede protokol (Genecopoeia). Efter transduktion blev positive celler isoleret under 10 ug /ml puromycin selektion og bekræftet visuelt for GFP-ekspression. Derudover knockdown blev bekræftet for mRNA via qPCR og for protein via Western blot-analyse.

Resultater Salg

Kost induceret fedme bidrager til pancreas adipositas

Det er tidligere blevet rapporteret, at forbruget af en diæt med højt fedtindhold fører til fedme, insulinresistens og forhøjet leptin niveauer ved atten uger gamle i mus [29]. Det har endvidere vist sig, at human pancreas sig selv er underlagt fedtinfiltration, identificeret som fede pancreatisk sygdom [25]. For at bestemme om kost induceret fedme kan resultere i fedtinfiltration af den murine pancreas blev mus holdt på en diæt med højt fedtindhold i tre måneder. Dyrene udviste en dramatisk stigning i total legemsvægt samt pancreas vægt i kosten inducerede fede (DIO) mus (Fig 1A og 1B). Gennemsnitlig fast og tør pancreas vægt for lean mus blev 0.221g sammenlignet med 0,325 g for fede mus. Histologisk undersøgelse af pancreas fra lean og kost induceret fede mus viste tilstedeværelse af både interpancreatic og intrapankreatiske fedtvæv i DIO mus (Fig 1C og 1D). Antallet af adipocytter pr mm

2 af acinære væv samt størrelsen af ​​de peripancreatic adipocytter blev øget betydeligt i DIO bugspytkirtlen (Fig 1E og 1F). Desuden har vi bestemt musene havde en 20 dobling (gennemsnit for lean blev 3.155ng /ml og DIO blev 60.156ng /ml) i plasma leptin niveauer efter tolv uger på diæt (Fig 1G). Normale leptin niveauer findes normalt på 1-10ng /ml i humant serum og 10-50ng /ml hos overvægtige patienter [30]. I indstillingen af ​​forøget pankreatisk fedtvæv, blev fundet de relative vævsniveauer af leptin i bugspytkirtlen til at øges i DIO pancreas sammenlignet med lean pancreas (fig 1H).

Mus blev holdt på en 42% diæt med højt fedtindhold i 3 måneder for at inducere fedme. DIO-mus opnået signifikant mere total legemsvægt (A) såvel som pancreas vægt (B). Histologisk analyse af totalt pancreas fra Lean (C) sammenlignet med DIO-mus (D) viste akkumulering af interpancreatic (hvid pil) og intrapankreatiske (sorte pilespidser) adipose i DIO bugspytkirtlen. Det samlede antal intrapankreatiske adipocytter (E) såvel som størrelsen af ​​peripancreatic adipocytter (F) var større hos DIO bugspytkirtlen. Leptin niveauer blev forøget i både plasmaprøver og pancreasvæv af fede mus (G). Scale barer er 100 um.

Kost inducerede fedme stiger ortotopisk pancreas tumorvækst

Fedme er en væsentlig risikofaktor for mange kræftformer og har vist sig at forstærke deres vækst i mus [5, 31, 32]. For at undersøge om kost induceret fedme var tilstrækkelig til at forøge væksten af ​​pancreascancer

in vivo

, vi anvendt en murin syngen ortotopisk pancreascancer model. Vi har tidligere vist, at kost-induceret fedme øget antallet af levermetastaser i en milt indsprøjtning model for tyktarmskræft metastaser i fastsættelsen af ​​fedtlever sygdom [33]. Ved hjælp af en EL-Kras model er det blevet påvist, at fedme tilbøjelige C57BL /6J mus fodret omega-6 fedt har en tidligere debut og en øget hyppighed af Panin, pancreas intraepitelialneoplasi, læsioner [5]. Derfor vi postuleret, at kost-induceret fedme og udvikling af NAFPD i mus også kan øge væksten af ​​pancreascancer. C57BL /6J-mus blev anbragt på en diæt med højt fedtindhold i tre måneder for at inducere fedme. Panc02 pancreasadenocarcinom celler blev derefter injiceret orthotopisk i halen i bugspytkirtlen og overvåges for vækst. In vivo primær tumorvækst blev overvåget ved anvendelse bioluminescens (IVIS) imaging analyse i kombination med luciferase- mærkede Panc02 celler (fig 2A). Panc02 tumorer orthotopisk implanteret i kosten inducerede fede mus viste en signifikant stigning i den samlede fotonflux efter ni dages vækst og en fortsat vækst over tid, mens tumorer i lean mus viste langsom vækst i samme periode (figur 2B). Ex vivo analyse på 28 dage efter injektion bekræftede større tumorvækst i kosten inducerede fede mus i forhold til de magre mus beregnet som total tumor vægt (fig 2C). ARIOL scanning med beregningsmæssig analyse viste også en øget tumor område i fede mus (Fig 2D). Endpoint tumorer blev farvet for spredning markør Ki67 og viste signifikant øget tumorcelleproliferation i DIO mus sammenlignet med lean mus (Fig 2E).

Bioluminescens afslørede øget vækst over tid i DIO mus sammenlignet med lean mus (A) . Total flux fra luciferase imaging var statistisk forskellig fra Day09 efter ortotopisk tumorcelleinjektion (B). Endpoint tumorvægt (C) såvel som tumor-området (D) blev forøget væsentligt i de DIO mus. Proliferation bedømmes ved Ki67-farvning var forøget i DIO tumorer i forhold til at læne tumorer (E). Radiance zonekort skala er x10

5 p /sek /cm

2 /sr. Statistisk analyse af Mann-Whitney p. 0,0079 (*)

bugspytkirtelkræft cellelinjer udtrykker funktionelle leptin receptorer

Undersøgelser har vist, at pancreas p-celler udtrykker funktionel leptin receptorer [ ,,,0],34], men de receptor ekspressionsniveauerne og funktion i bugspytkirtelkræft er ikke blevet behandlet. For at bestemme om bugspytkirtelkræftceller udtrykt leptin receptorer, isolerede vi RNA og protein fra flere humane og murine bugspytkirtelkræft cellelinjer. Western blot-analyse blev udført for at bestemme den relative proteinniveau for leptin receptorer i vores panel af pancreascancer cellelinier. Både den korte isoform (LR-kort), og den lange form (LR-Long) var til stede i bugspytkirtelkræft cellelinjer, men den lange form i humane linier blev kun svagt opdaget ved hjælp af K-20 antistof (Fig 3A) Tilstedeværelse af lang leptin receptor isoform blev desuden bekræftet ved hjælp af H-300-antistof (S1B fig). Begge former blev desuden påvist gennem PCR-analyse i murine samt humane cellelinjer (Fig 3B og 3C og S1A Fig). Cellelinier blev behandlet med eksogent leptin ved 5 ng /ml, 50 ng /ml, og 250 ng /ml for at bestemme omfanget af Pakt og pSTAT3 aktivering. Western-analyse kombineret med densitometri, viste, at leptin induceret aktivering af Pakt-S473 i Panc02 og Panc1 linjer, men ikke i MiaPaCa-cellelinie (figur 3D). Leptin induceret aktivering af Pakt blev yderligere undertrykt af PI3K-inhibitoren LY294002 på 30 og 60 minutter (Fig 3e). Leptin stimuleret pSTAT3 i den humane Panc1 cellelinie med stigende koncentration, selv om lavere koncentrationer var mere effektivt inducerer pSTAT3 i den murine Panc02 linje og i MiaPaCa2 cellelinjer (fig 3D). Disse resultater viser, at bugspytkirtelkræftceller udtrykker funktionel leptin receptor, men ligand stimulation af enten Pakt eller pSTAT3 er afhængig af typen af ​​pankreatisk cancercellelinie.

Western og real-time qPCR analyse verificerede leptin receptorekspression for lange og korte former af leptin-receptoren i murine og humane pancreatiske cellelinjer (A, B, C). Vestlige anlayis viste stimulering af kræft i bugspytkirtlen cellelinjer med leptin fører til phosphorylering af AKT i Panc02 og Panc1 cellelinier og til phosphorylering af STAT3 (D). Tilsætning af PI3K /AKT-inhibitor LY294002 var i stand til at blokere leptin induceret fosforylering af Pakt men påvirkede ikke leptin induceret pSTAT3 aktivering i Panc1 cellelinje. Densitometrisk analyse blev anvendt til at kvantificere mængden af ​​pSTAT3 og Pakt forhold til de samlede niveauer for hvert protein og derefter normaliseret til nul tidspunkterne.

Leptin stimulerer proliferation af murine bugspytkirtelkræftceller

Leptin har vist sig at stimulere proliferation i en række cancercellelinier [21, 35-38]. Den øgede niveau af leptin i plasma samt bugspytkirtlen væv foreslog, at leptin kan være involveret i pancreas tumorvækst. Aktivering af Pakt eller pStat3 er blevet associeret med leptin-induceret proliferation, overlevelse, immuntolerance og invasion i cancerceller [35, 36, 39-42]. I modsætning til flere undersøgelser, som viser aktivering af proliferation i cancerceller upon leptin stimulering blev behandlingen af ​​MiaPaCa eller Panc1 celler med leptin rapporteret at forårsage et fald i deres metaboliske aktivitet via en MTT assay [22]. På grund af den øgede Pakt og pSTAT3 observeret i vores studier med leptin behandlinger, vi var interesseret i at bestemme, hvor leptin stimulation ændret spredning af kræft i bugspytkirtlen cellelinjer. Edu inkorporering analyser blev udført for at bestemme, om leptin sker spredning af kræft i bugspytkirtlen celler (Fig 4A). Leptin stimulering viste en betydelig stigning i proliferation via Edu inkorporering for den murine Panc02 cellelinie og den humane Panc1 cellelinie ved alle testede koncentrationer, men det ændrede ikke proliferation i MiaPaCa cellelinien til enhver testede koncentration.

leptin stimulering ved 5, 50, og 250 ng /ml forårsagede en stigning i spredningen vurderes gennem Edu inkorporering i murine Panc02 og human Panc1 cellelinjer, men ikke ændre proliferation i humane MiaPaCa celler (A). Leptin stimulering forårsagede en stigning i migration registreret som afstand migreret til Panc02 og Panc1 celler vurderes gennem bunden assay, der blev blokeret af PI3K-inhibitor LY294002 (B). Statistisk analyse af * ANOVA p 0,0001, og ** T-test af p. 0,05

Leptin øger migration af bugspytkirtelkræftceller

Bortset fra spredning, leptin har også blevet vist at forøge den vandrende kapacitet af cancerceller [18, 19, 43, 44]. Histologisk analyse af tumorer i fede mus viste en høj grad af tumorcelle-infiltration ind i peri-pancreas adipøst i DIO mus sammenlignet med den magre mus (data ikke vist). Dette antydede, at de bugspytkirtelkræftceller kan reagere med forbedret motilitet og migration til cytokiner eller adipokiner frigivet af fedtvæv. For at bestemme om leptin derudover kan virke som en vandrende faktor for bugspytkirtelkræftceller vi udførte scratch analyser. Scratch assays viste, at leptin signifikant øget migration af både Panc02 samt Panc1 celler in vitro (Fig 4B), mens MiaPaCa celler ikke viste vandrende aktivering som reaktion på leptin. Tilsætning af PI3K /AKT-inhibitor LY294002 blokeret leptin induceret migrering af bugspytkirtelkræftceller.

Knockdown af leptin receptor

For at bestemme bidraget fra leptin-receptoren til bugspytkirtlen vækst kræft i fede mus vi slået ned ekspressionen af ​​leptin-receptoren under anvendelse lentiviral shRNAmir baserede teknikker i den murine Panc02 cellelinie. Vi var i stand til at opnå en betydelig reduktion i RNA-ekspression af både de lange og de korte former af leptin-receptoren under anvendelse af to forskellige shRNAmir konstruktionerne, LRKD1 og LRKD2 (Fig 5A). Proteinanalyse via western blot og densitometrisk analyse bekræftede knockdown virkning med begge konstruktioner (Fig 5B). Derudover knockdown af leptin-receptoren tillægges også et fald i aktiveringen niveauer af Pakt og pSTAT3 (Fig 5B). Brug af en Edu baseret proliferation assay var vi i stand til at vise, at de Knockdown linjer havde en lavere basal proliferativ sats i serum frit medium (Fig 5C). Stimulering af både forældre og kontrol shRNA Panc02 celler med leptin inducerede en stigning i spredning, som ikke forekommer i LRKD1 eller LRKD2 Panc02 celler (Fig 5D).

Lange og korte leptin receptor RNA-niveauer målt ved realtime PCR-analyse blev begge væsentligt reduceret anvendelse af to forskellige shRNAmir lentivirale titere i Panc02 cellelinje (A). Vestlige og densitometrisk analyse bekræftede leptin receptor knockdown samt nedsat aktivering af Pakt (B). Basal proliferation blev signifikant reduceret i både LRKD1 og LRKD2 Knockdown cellelinjer ved dyrkning i serumfri betingelser (C). Stimulering med leptin ved 50 ng /ml inducerede proliferation i parentale og kontrolceller men inducerede ikke proliferation (procent ændring i forhold til ubehandlede) på en af ​​Knockdown cellelinjer sammenlignet med forældre- eller kontrol shRNA (D). Statistisk analyse ved ANOVA * betegner p 0,014 korte, s 0,0023 lang, s 0,0003 almindelig (A); ANOVA p 0,0008 (C) .; ANOVA p 0,0001 (D). * P. 0,05 i C, D

Knockdown af leptin-receptoren ophæver DIO associeret tumorvækst

leptinreceptor knockdown Panc02 celler blev anvendt til at bestemme, om in vivo pancreas ortotopisk tumor vækst stigning observeret hos overvægtige mus skyldes øget leptin signalering i DIO mus. Leptin receptor knockdown Panc02 cellelinjer blev injiceret orthotopisk i lean og DIO pancreas. Efter otteogtyve dages vækst, blev mus aflivet, og tumorerne blev opsamlet og vejet. Begge de leptin receptor knockdown linier viste nedsat tumorvægte i DIO mus, men viste kun LRKD2 en statistisk formindsket tumorvægt sammenlignet med den parentale eller kontrol- shRNA Panc02 cellelinier dyrket i DIO mus (Fig 6A). Knockdown tumorer i magre mus var ikke signifikant forskellige fra hinanden. Proliferation af tumorer fra LRKD2 blev sammenlignet med parentale tumorer at bestemme antallet af Ki67-positive celler, hvilket viste samme niveauer af proliferation i vildtype DIO tumorer sammenlignet med leptin receptor knockdown DIO tumorer (Fig 6B). Derfor gjorde forskellen i tumorvækst ikke korrelerer med tumorcelleproliferation.

Panc02 celler med leptin receptor knockdown varianter LRKD1 og LRKD2 blev orthotopisk injiceret i lean og DIO mus. (A) Forskelle mellem forældrenes (P), kontrol shRNA (C), og Knockdown varianter var ikke statistisk forskellige når sammenligninger mellem kontrol og Knockdown tumorer i lean mus. Leptin receptor knockdown variant LRKD2 viste en signifikant nedsat tumorvægt i DIO mus sammenlignet med de parentale og kontrol tumorer i DIO mus. (ANOVA p 0,0001, * p 0,05). (B) Vurdering af tumorcelleproliferation gennem Ki67 farvning var ikke forskellig mellem kontrol DIO tumorer sammenlignet med LRKD2 DIO tumorer, men var signifikant mellem magre og DIO tumorer (ANOVA p 0,0004, * p 0,05).

diskussion

Fedme og ændringer i kosten sammensætning er blevet rapporteret at påvirke væksten og indtræden af ​​pancreascancer i multiple murine modeller [5, 6]. Denne undersøgelse viser, at kost-induceret fedme korrelerer med udviklingen af ​​en fed bugspytkirtlen og at fedme potentierer væksten af ​​pancreascancer. Kost induceret fedme korreleret med en øget spredning af orthotopisk implanterede pancreas tumorceller

in vivo

. Desuden blev fedtholdige pancreas sygdom vist at være associeret med øget forekomst af lymfeknudemetastaser [45]. Vigtigt er det, nogle af de konstaterede risikofaktorer forbundet med kræft i bugspytkirtlen er fedme, kronisk pancreatitis og diabetes [46]. Vores resultater er i overensstemmelse med den generelle enighed om, at fedme er en medvirkende faktor til øget bugspytkirtlen kræft vækst og tilbyde en medvirkende mekanisme for øget tumorvækst medieret af leptin inducerede ændringer i STAT3 og /eller PI3K-AKT signalering.

Fedme