PLoS ONE: Hæmmende rolle Small leucin-Rich Proteoglycan biglycan i Blære Cancer

Abstrakt

Baggrund

urotelial blærekræft er den niende mest almindelige kræftform. Trods kirurgisk og kemoterapeutiske behandling er prognosen stadig fattige, når blærekræft udvikler sig til en muskel-invasiv tilstand. Opdagelse af nye diagnostiske markører og patofysiologiske effektorer kan bidrage til at bidrage til nye diagnostiske og terapeutiske muligheder. Den ekstracellulære matrix mikromiljø formet af den ekstracellulære matrix kritisk påvirker tumorcelle og stroma cellefunktioner. Derfor Formålet med denne undersøgelse var at vurdere det fremgår, at de små leucin-rige proteoglycan biglycan i progression af human urothelial blærekræft.

Metoder og Resultater

Til dette formål tumor biopsier af 76 blærekræft patienter med forskellige tumor stadier (pTA, PT1-T4) blev undersøgt med hensyn til biglycan udtryk og korreleret med en langsigtet (10 år) klinisk opfølgning. Interessant nok blev højere biglycan mRNA-ekspression forbundet med højere tumor stadier og muskel invasiv.

I

vitro

knock-down af endogen biglycan i humane urothelial carcinomceller (J82 celler) øget proliferation, hvorimod tilsætning af rekombinant biglycan og overekspression af biglycan hæmmede tumorcelleproliferation. I tråd med denne væksthæmmende effekt af biglycan, transplantation af J82 celler efter knock-down af biglycan resulterede i signifikant øget vækst af subkutane xenotransplantattumorer i nøgne mus

I

vivo

. Endvidere behandling med to anti-proliferative, multi-receptor tyrosinkinaseinhibitorer-sunitinib og sorafenib-kraftigt opreguleret biglycan ekspression. Tilsammen forsøgsdata viser, at høje biglycan ekspression er forbundet med reduceret tumorcelleproliferation. I overensstemmelse, Kaplan-Meier analyse viste højere 10-års overlevelse hos patienter med forhøjet biglycan mRNA ekspression i tumor biopsier.

Konklusion

Som konklusion de nuværende data tyder på, at biglycan er en endogen inhibitor for blærekræft celleproliferation, der er opreguleret som respons på anti-proliferative tyrosinkinaseinhibitorer. Desuden er høj biglycan udtryk forbundet med gunstige prognose

Henvisning:. Niedworok C, Röck K, Kretschmer I, Freudenberger T, Nagy N, Szarvas T, et al. (2013) Hæmmende rolle Small leucin-Rich Proteoglycan biglycan i blærekræft. PLoS ONE 8 (11): e80084. doi: 10,1371 /journal.pone.0080084

Redaktør: Nikos K KARAMANOS, University of Patras, Grækenland

Modtaget: Maj 2, 2013; Accepteret: 9 oktober 2013; Udgivet: November 6, 2013 |

Copyright: © 2013 Niedworok et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev finansieret delvist af den Ifores Programm af universitetets Klinikker Essen (D107-10800, https://www.uni-due.de/med/forschung/forschungsfoerderung/ifores.shtml) og af Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG (FI 682 /4-1; https://gepris.dfg.de/gepris/OCTOPUS/;jsessionid=E43949FD6A49E805D72DE1129F1DB078?context=person displayMode=print findButton=Finden id=1433803 keywords_criterion=Jens+Fischer module=gepris nurProjekteMitAB=false task=showDetail). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

urotelial blærekræft er den niende mest almindelige menneske ondartet kræft med stigende forekomst og udbredelse [1]. Ikke-muskel invasiv blærekræft behandles ved transuretral resektion og adjuverende instillation terapi i tilfælde af høj kvalitet sygdom eller i tilfælde, med flere, ofte tilbagevendende tumorer. Den lav kvalitet non-muskel invasiv sygdom kan udvikle sig til muskel invasiv høj risiko blærekræft. behandlingen af ​​valg for muskel invasiv blærekræft er radikal cystektomi [2,3], som giver stadig kun en lav (~ 50%) 5-års overlevelse. den vigtigste årsag til denne ødelæggende overlevelse er hyppigt forekommende metastatisk progression i disse patienter [6,7]. cisplatin i kombination med gemcitabin repræsenterer den første linje adjuverende behandlingsmulighed for patienter med lokalt fremskreden eller metastatisk blære kræft. Nye kemoterapeutiske strategier, der involverer receptor tyrosinkinasehæmmere, der i øjeblikket undersøges i prækliniske modeller og i kliniske studier [4,5]. Således på trods af de kirurgiske og kemoterapeutiske behandlingsmuligheder Sværhedsgraden af ​​sygdommen og dårlig prognose trang til opdagelsen af ​​nye markører for sygdomsprogression samt nye indsigter i patofysiologien af ​​blærekræft progression.

Til dette formål har vi til formål at undersøge specifikke ændringer i det ekstracellulære micromilieu som defineret af den ekstracellulære matrix (ECM), der er forbundet med progressionen af ​​blærecancer og hvorvidt en specifik biologisk aktivitet kunne tilskrives kandidatmolekyler . ECM er kendt for at påvirke både, tumor og stromaceller med hensyn til deres fænotypiske egenskaber, der er relevante for cancer progression såsom invasion, proliferation og apoptose. Endvidere sammensætningen af ​​ECM micromilieu sandsynligvis en del af den intercellulære kommunikation mellem tumor og stromaceller. Proteoglycaner, nøglekomponenter i ECM, bliver mere og mere relevant for kræft biologi på grund af en overflod af funktioner, der er afgørende for tumor-stroma interaktioner [8]. Proteoglycaner sammensat af en kerne-protein og et glycosaminoglycan kæde, der er genstand for posttranslationelle modifikationer. Både kerneproteiner og glycosaminoglycankæder bidrager til funktionen af ​​proteoglycaner i ECM. Små leucin-rige proteoglycaner (SLRP) er en familie af ekstracellulære proteoglycaner som er karakteriseret ved leucinrige gentagelser i kerneproteinet. SLRP udskilles i det ekstracellulære rum, hvor de interagerer med andre proteiner, herunder vækstfaktorer, cytokiner [9-11] og transmembrane receptorer [12]. Biglycan (BGN) er medlem af SLRP som interagerer med transmembrane receptorer af purinergiske P2X7 type og med toll-like receptor (TLR) 2 og TLR4 [13,14]. Førstnævnte er involveret i aktiveringen af ​​inflammasome, mens sidstnævnte årsag aktivering af det medfødte immunsystem. Disse aktioner attribut immunmodulerende egenskaber BGN, der kunne være relevante for begge, carcinogenese og tumorprogression samt for metastase. Endvidere BGN har vist, at bidrage til collagen netværksdannelse og stabilitet, til fibronectin fibrillogenese, at fibroblast differentiering og foreslås at bidrage til angiogene responser [15-18]. Sammenfattende BGN sandsynligvis modulerer tumorbiologi ved at udføre vigtige kontrolmekanismer, såsom immunreaktioner, matrixopbygning og modulering af vækstfaktoraktivitet. Dette er sandsynligvis opnået ved begge, direkte cellulær signalering fremkaldt af BGN samt ved at udforme mikromiljøet gennem dets virkninger på collagen og fibronectin matrixdannelse.

I tråd med det faktum, at BGN udviser både, hæmmende og fremme virkninger på tumorceller, kontroversielle roller er blevet beskrevet for BGN i forskellige kræftformer. For eksempel i mave- og tarmkræft samt i pancreas adenocarcinom, blev BGN ekspression sig at være korreleret med dårlig prognose [19-21]. På den anden side blev der observeret overekspression af BGN i human pancreascancer og viste sig at inhibere væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller

in vitro

[22]. Endvidere BGN nedregulering var associeret med HER-2 /neu-medieret onkogen transformation, som var kraftigt forbundet med den maligne fænotype af disse celler [23]. Derfor sandsynligvis afhænger af tumortype, stadium og differentiering rolle BGN i tumorudvikling. Derfor disse spørgsmål har, skal behandles specifikt i de forskellige tumor enheder. Endvidere har reaktionsevne BGN til terapeutiske indgreb ikke undersøgt endnu. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere, for første gang udtryk og rolle BGN i patienter med blærekræft.

Materialer og metoder

Tumor prøver

Genekspression analyse udført i frosne vævsprøver af 76 patienter (19x pTA, 15x pT1, 14x PT2, 14x PT3 og 14x pt4), som gennemgik kirurgisk behandling på grund af urotelial blærekræft i Universitetshospitalet i Essen mellem 1990 og 2004. Alle frosne vævsprøver var skåret og farvet med H 0,05. Data vedrørende kliniske resultater fra patientparametre manglede normalfordeling, hvilket indikerer brugen af ​​ikke-parametrisk to-halet Wilcoxon rank sum test (Mann-Whitney) for parrede gruppesammenligninger. Analyse af patientdata overlevelsesdata blev udført ved hjælp af standard Kaplan-Meier-algoritmen (PROC LIFETEST, SAS-PC 9.3, SAS-INSTITUTE, Cary, USA). For optimal separation af grupper med hensyn til relativ BGN ekspression blev variable skærepunkter evalueret og log-rank test p-værdier blev registreret. Optimal adskillelse af to grupper svarende til en minimal p-værdi blev fundet ved en relativ BGN ekspression værdi på 0,09. For multivariabel analyse Cox proportionel risiko regressions modeller blev anvendt. Alle statistiske analyser blev beregnet ved hjælp af IBM SPSS statistisk analyse-software (version 18.0, Chicago, IL, USA).

Etik erklæring

Undersøgelsen protokol og godkendelsesproceduren blev godkendt af den etiske komité på University of Duisburg-Essen, Tyskland og hver patient forudsat et skriftligt informeret samtykke. Projektet var tallet 07-3537 til opbevaring af friske frosne og paraffinized tumor materiale og de relevante kliniske data.

De mus blev udført i overensstemmelse med de regler og standarder for LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, NRW) og den lokale Animal Facility af Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf. Den LANUV godkendte eksperimenterne og bekræftede overholdelse af kvalitetsstandarder. Projektet er identificeret med antallet 87-51.04.2010.A149. Salg

Resultater

BGN mRNA-ekspression i human blærekræft

Først blev prøverne fra 76 patienter med forskellige stadier af blærekræft analyseret med hensyn til BGN mRNA-ekspression og sammenlignet med ekspressionen i raske blærevæv. Interessant nok blev påvist signifikante forskelle i mRNA-ekspressionsniveauer i forhold til tumorindtrængen (figur 1A), klassificering (figur 1 B) og mellemstationer (figur 1C), hvilket antyder øget BGN mRNA i fremskredne stadier af blærekræft. Men på trods af denne positive sammenhæng med tumor staging multivariat analyse afslørede, at BGN mRNA-ekspression niveau (

s

= 0,155) var ikke en selvstændig prognostisk faktor. I modsætning hertil tumor fase (

s

= 0,012) og lymfeknuder (

s

= 0,039) var uafhængige prognostiske faktorer for cancer-specifik overlevelse som forventet (tabel 1). Endvidere var der ingen sammenhæng mellem BGN mRNA-ekspression og tid til fremkomsten af ​​metastaser (

s

= 0,862), sygdomsprogression (

s

= 0,624) eller recidiv (

p

= 0,142). BGN var højere i tumorprøver for hundyr sammenlignet med de for hanner (4,86-fold versus 1,66 gange af kontrol, henholdsvis

s

= 0,003) og hos rygere sammenlignet med de for ikke-rygere (3,40-fold ; rygere 2.01-fold, henholdsvis

s

= 0,008, tabel 2)

BGN mRNA blev undersøgt i 76 patienter med blærecancer med RT-qPCR og sammenlignet med ikke-malign blærevæv. . En signifikant stigning i BGN mRNA-ekspression blev påvist i muskel-invasiv sammenlignet med ikke-invasive tumorer (A) og i høj kvalitet sammenlignet med lav kvalitet tumorer (B). Endvidere BGN mRNA-ekspression korrelerede med stigende tumor stadium (C). n = 76 patienter, *

s

. 0,05, ***

s

= 0,0003

Kræft-specifik overlevelse

Variabler

HR

95% CI

p

Stage (muskel invasive) 1.4881.090-2.0300.012Grade (high-grade) 2.1260.954-4.7400.065Lymphnodes (N +) 2.4001.045-5.5090.039BGN (høj ) 0.9460.876-1.0210.155Table 1. tumor scenen og lymfeknude status er selvstændige prognostiske parametre for blærekræft-specifik overlevelse.

i en multivariat Cox proportional hazard overlevelse regressionsanalyse i n = 76 patienter tumor stadie og lymfeknude status var i stand til at forudsige kræft-specifikke overlevelse uafhængig af andre parametre,

s

-værdier 0,05 blev bestemt som betydelig. CSV Hent CSV

BGN genekspression

P

valuesΣ = 76median (interval) Alder ≤ 65 352,81 (0.06-24.33) 0,847 65 n1.95 (0,06-8,28) Køn Mand 591,66 (0.06-8.28) 0,003 Kvindelige 174,86 (0,16-24,33) Stage Ta 191,00 (0.13-4.01) 0,986 T1 151,06 (0.12-4.26) 0,512 T2 141,30 (0,06-5,53) 0,069 T3 143,78 (0,23-12,62) 0,909 T4 145,21 (0,24-24,33) Ikke-invasive 341,03 (0,12-4,26) 0,004 muskel-invasiv 423,37 (0,06-24,33) Grade G1 130,76 (0,12-4,01) 0,919 G2 271,08 (0,13-4,26) 0,002 G3 363,80 (0,06-24,33) lav kvalitet (G 1-2) 380,97 (0.12-4.26) 0,001 High-grade (G 3) 373,76 (0,06-24,33) Lymfeknude n0 /Nx622.05 (0,06-24,33) 0,196 N 143,66 (0,23 til 15,3) Primer 433,01 (0,12-24,33) 0.883Recurrent 331,44 (0,06-8,08) Rygning ja 422,01 (0,06-24,33) 0,008 ingen 233,40 (0.13-15.28) ukendte 18Table 2. BGN mRNA ekspression niveauer er forhøjede i muskel invasive tumorer, high-grade tumorer, ikke-ryger og kvindelige patienter mellem kønnene.

mRNA genekspression niveauer af n = 76 patienter med blærekræft. Data blev opnået ud fra flash-frosset tumorprøver. Univariate Cox proportional hazard overlevelse regressionsanalyse blev anvendt til dataanalyse, en

s

-værdi 0,05 blev betragtet som signifikant. CSV download CSV

BGN proteinekspression i humane blærecarcinomer

BGN farvning i humane tumorprøver afslørede kun svage signaler i stromavæv af ikke-invasiv Ta og T1 tumorer (Figur 2A). BGN farvningsintensitet steg i muskel-invasiv tumor faser (figur 2B og C). Som forventet, tumor morfologi i overfladiske stadier var magen til normal blære morfologi med en klar differentiering mellem tumorvæv og stromale væv. I højere tumor faser (T4), stromale celler og tumorceller blev sammenblandet og begge celletyper viste association med BGN farvning (figur 2B og C). Men fordi BGN er en udskilt proteoglycan den cellulære kilde ikke kan udledes af immunfarvning af væv. Kvantificering af den positive område fraktion bekræftede den øgede farvning intensitet BGN i muskel-invasiv tumor stadier (T2-4) sammenlignet med ikke-muskel invasiv Ta og T1 stadier (Figur 2D). Desuden blev påvist en korrelation af BGN positive område fraktion og invasivitet af tumoren (

s

= 0,0025, figur 2E).

A – C, BGN immunfarvning blev udført på paraffinindlejrede vævssnit. (A), Ta; (B), T2; (C), T4. (D), kvantitativ billedanalyse af BGN i ikke-invasive tumorer (Ta, T1) og muskel-invasiv tumor faser (T2-T4). (E), korrelation af BGN positive område fraktion med tumor iscenesættelse. n = 5 patient biopsier af hver tumor stadie, ***

s

0,0001, **

s

= 0,0025

antiproliferativ virkning af BGN i. humane blære cancerceller

in vitro

resultaterne fra menneskelig blære kræft prøver foreslog, at BGN udtryk forbundet med tumor progression. For at få mekanistiske indsigt blev potentielle virkninger af BGN på tumor-fænotype undersøgt

in vitro

som beskrevet nedenfor. Først blev et immunblot af secerneret BGN udføres fra konditionerede medier af den humane blærecancer-cellelinie, J82 (figur 3A). Som påvist i prøven af ​​J82 celler uden chondroitinase ABC fordøjelse BGN proteoglycan blev udgivet i relativt små mængder i mediet. Desuden blev BGN core protein påvist i disse prøver også. Som en kontrol for celler, som secernerer store mængder BGN proteoglycan blev immunoblot af konditioneret medium afledt af humane koronare vaskulære glatte muskelceller inkluderet (to baner til venstre). Immunoblotting viste desuden, at rekombinant BGN anvendt i de efterfølgende eksperimenter bestod hovedsagelig af kerneprotein fordi bånd ikke var forskudt med chondroitinase ABC (figur 3A) og kørt ved den typiske størrelse for kerneproteinet. Dernæst blev rekombinant biglycan kerneprotein anvendes i et proliferationsassay (figur 3B). Tilsætningen på 0,26 – 26 nM BGN kerne (0,01-1 ug /ml) forårsagede en dosisafhængig inhibering af celleproliferation i J82-celler (figur 3B). Endelig, for at danne grundlag for en

in vivo

xenograft eksperiment og at optrævle rolle endogene BGN, lentiviral knock-down af BGN blev udført i den menneskelige blærekræft cellelinje, J82. Vigtigere er det, knock-down af BGN forårsagede øget spredning (shBGN 1,39 ± 0,06 gange af kontrol,

s

0,05), som blev vendt ved tilsætning (2,6 nM) af eksogen BGN (0,83-fold af kontrol ± 0,06) (figur 3C). Tilsætningen af ​​exogent BGN til celler transduceret med røræg shRNA forårsagede en tendens til nedsat proliferation. Dernæst blev bestemt proliferation efter overekspression af human BGN. Komplementær til den pro-proliferative virkning efter BGN knock-down, BGN overekspression resulterede i signifikant reduktion af DNA-syntese i sammenligning med den tomme vektor kontrol (oeBGN, 0,50 ± 0,06 gange af kontrol; pCL-1, 1,0 ± 0,09-fold kontrol, figur 3C).

(A) immunblotting af BGN oprenset fra konditionerede medier af humane J82 blærecarcinomceller og af rekombinant BGN plusminus chondroitinase ABC fordøjelse. Som kontrol konditioneret medium fra humane koronare vaskulære muskelceller (CaSMC) glatte blev anvendt, fordi disse celler vides at udskille store mængder af BGN proteoglycan (venstre to baner). Chondroitinase ABC blev påført som yderligere kontrol (højre bane) (B) J82-celler blev inkuberet i lavt serum (2%) med stigende mængder af rekombinant BGN og celleantallet blev bestemt ved FACS-analyse efter 7 dage; n = 3. Repræsentative lys mikroskopiske billeder vises. (C) Humane J82-celler blev enten lentivirally transduceret til knock-down BGN ekspression eller at overudtrykke humant BGN. De respektive kontroller var celler transduceret med røræg shRNA (SCR) eller tom vektor kontrol (PCL-1). Desuden blev rekombinant BGN anvendes. Ni dage efter transduktion, blev proliferation bestemt som påvist ved DNA-syntese. Den BGN knock-down havde en proliferativ virkning, som blev vendt ved tilsætning af rekombinant BGN (2,6 nM = 100 ng /ml). Overekspression af BGN resulterede i reduceret DNA-syntese; n = 5, *

s

0,05.

Knock-down af BGN accelererer J82 xenograft vækst i nøgne mus

J82 celler transduceret med shRNA målrettet BGN og krypteret shRNA blev xenotransplanteret ind nu /nu nøgne mus for at undersøge effekten af BGN nedregulering også

in vivo

. Måling af xenograft tumorvolumen afslørede signifikant forhøjelse af tumorvækst i BGN knock-down-gruppen sammenlignet med kontrolgruppen behandlet med scrambled shRNA 49 dage efter injektion af cellerne (dag 49, shBGN 374.7mm

2 ± 82,8 mm

2, krypteret shRNA 204.2 mm

2 ± 28,5 mm

2, n = 6,

s

0,001, figur 4). Tumorerne var af fast udseende uden nogen tegn på nekrose og kun en af ​​tumorerne i shBGN gruppen blev infiltrere omgivende væv (i dette tilfælde de nederste ribben). Ingen af ​​tumorerne i kontrolgruppen blev infiltrere det omgivende væv. Der var ingen synlig metastatisk vækst af tumorceller i lungerne og leveren, bedømt ved histologi. Næste immunhistokemisk analyse viste, at BGN farvning stadig blev reduceret i den BGN knock-down gruppe (BGN fraktion positive område i shBGN gruppe 10,82 ± 2,3% og 25,25 ± 2,4% i scrambled shRNA kontrolgruppe) efter 7 uger (figur 5 A-C). Vigtigere er det, i overensstemmelse med

in vitro

data vist i figur 3, blev proliferation af tumorceller steg efter BGN knock-down som påvist ved Ki67-farvning sammenlignet med kontrol (Ki67 positiv område fraktion i shBGN gruppe 16,68 ± 2,1 % og 7,18 ± 1,2% i scrambled shRNA kontrolgruppen,

s

= 0,005, figur 5D-F). Tumor vaskularisering blev ikke påvirket, hvilket fremgår af CD31-farvning (figur 5G-I).

Efter knock-down af BGN i humane J82 celler

i

vitro

de transducerede celler blev injiceret bilateralt i flankerne af nøgne mus og tumorvækst blev fulgt over en periode på 7 uger. Som følge heraf tumorvolumen var signifikant højere efter anvendelse af J82-celler transduceret med shRNA målretning BGN sammenlignet med scrambled kontrol (375 mm

2 vs. 204 mm

2); n = 6, ***

s

0,001.

De xenotransplantattumorer blev høstet efter 7 uger og behandles for immunfarvning og morfologisk analyse. BGN immunfarvning og billedanalyse afslørede faldt BGN ekspression sammenlignet med scrambled kontrol (A, B). Fraktionen område i BGN positiv farvning var 25,3% i kontroller versus 10,8% i xenotransplantattumorer afledt fra shBGN celler, n = 6, **

s

= 0,0087 (C). Dernæst blev den proliferative indeks vurderet ved hjælp af Ki67-antigenet. Sammenlignet med kontrol (D) den procentdel af fraktionen område i Ki67-positive celler blev signifikant forhøjet i tumorer sammensat af shBGN transducerede J82 celler (E, F; 7,2% vs. 16,7%, n = 6, **

p

= 0,005). (GI) middelværdien mikrokar densitet (MVD) som bestemt ved CD31 immunfarvning blev ikke påvirket i xenotransplantattumorer, n = 6.

Multi-receptor tyrosinkinaseinhibitorer inducerer BGN

in vivo

in vitro

data beskrevet ovenfor kraftigt antydet, at BGN er en vækst-hæmmer i humane blære cancerceller. Op til dato ingen terapeutiske modulatorer af BGN udtryk i kræft er blevet beskrevet. Derfor blev virkningen af ​​små molekyler receptor tyrosinkinaseinhibitorer på BGN ekspression undersøgt. Til dette formål multi-receptor-tyrosinkinase-inhibitorer, sorafenib og sunitinib, blev anvendt i koncentrationer, der vides at inhibere proliferation af cancerceller, herunder blærekræft (J82) celler [30-32]. Cell morfologi blev ikke påvirket inden 24 timers behandling med sorafenib og sunitinib. Af note, behandling med sorafenib (10 uM) og sunitinib (1 uM) resulterede i en stærk opregulering af BGN mRNA-ekspression efter 24 timer (figur 6A).