PLoS ONE: Antagonisme af miR-21 Vender Epithelial-Mesenchymale Transition og Cancer Stem Cell Fænotype gennem AKT /ERK1 /2 Inaktivering ved målretning PTEN

Abstrakt

Baggrund

Akkumulerende beviser foreslået, at epitelial -mesenchymal overgang (EMT) og cancer stamceller (CSC) egenskaber, som begge bidrager til tumor invasion og metastase, er indbyrdes med miR-21. MIR-21 er en af ​​de vigtige microRNA’er forbundet med tumorprogression og metastase, men de molekylære mekanismer, der ligger EMT og CSC fænotype under MIR-21 bidrager til migration og invasion af brystkræftceller mangler at blive belyst.

Metode /vigtigste resultater

i denne undersøgelse blev MDA-MB-231 /anti-miR-21 celler er oprettet ved transficerede HSA-miR-21 antagomir i brystkræft MDA-MB-231 celler. EMT blev bedømt ved ændringerne af mesenchymal cellemarkører (N-cadherin, vimentin, og alpha-SMA), epitelcelle markør (E-cadherin), samt kapacitet cellemigration og invasion; CSC fænotype blev målt ved anvendelse ændringerne i CSC overflademarkører (ALDH1 og CD44), og kapaciteten af ​​sphereforming (mammospheres). Vi fandt, at antagonisme af miR-21 omvendt EMT og CSC fænotype, ledsaget med PTEN opregulering og AKT /ERK1 /2 inaktivering. Interessant, nedregulering af PTEN af siPTEN undertrykt virkningerne af miR-21 antagomir om EMT og CSC fænotype, der bekræfter, at PTEN er et mål for miR-21 vende EMT og CSC fænotype. De hæmmere af PI3K-AKT og ERK1 /2-veje, LY294002 og U0126, både betydeligt undertrykt EMT og CSC fænotype, der indikerer, at AKT og ERK1 /2 veje er nødvendige for miR-21 medierende EMT og CSC fænotype.

konklusioner /betydning

som konklusion, vores resultater viste, at antagonisme af miR-21 vender EMT og CSC fænotype gennem målrettet PTEN via inaktivering af AKT og ERK1 /2-veje, og viste en ny mekanisme, som kan aflaste maligne biologiske adfærd af brystkræft

Henvisning:. Han M, Liu M, Wang Y, Chen X, Xu J, Sun Y, et al. (2012) Antagonisme af miR-21 Vender Epithelial-Mesenchymale Transition og Cancer Stem Cell Fænotype gennem AKT /ERK1 /2 Inaktivering ved målretning PTEN. PLoS ONE 7 (6): e39520. doi: 10,1371 /journal.pone.0039520

Redaktør: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Forskningscenter, Saudi-Arabien

Modtaget: 26 september, 2011; Accepteret: 26 maj 2012; Udgivet: 25 juni, 2012 |

Copyright: © 2012 Han et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC 81.072.147, NSFC 31.171.336), Natural Science Foundation of Chongqing Science Teknologi Kommissionen, Kina. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial-mesenkymale overgang (EMT) er forbundet med øget aggressivitet og metastase i carcinomer, herunder brystkræft, da det tillader celler at migrere og invadere omkringliggende spørgsmål og flygte ind i blodbanen, på vej til oprettelse metastaser. Når disse metastatiske celler nå deres destination, kan de gennemgå mesenchymal- epitelial overgang (MET) at etablere sekundære tumorer, hvilket resulterer i kræft spreder og behandlingssvigt [1] – [3]. På det molekylære niveau, celler, der undergår EMT mod en mere mesenchymal fænotype involverer tab eller sænket ekspression af epitel markører, såsom E-cadherin, og forøget ekspression af mesenchymale markører, såsom N-cadherin, vimentin, og alpha-SMA [2] [4], [5]. Der er undersøgelser antydet, at EMT i brystkræft er tæt knyttet til de basale-lignende fænotype brystkræft subgruppe og kræft stamceller (CSCS) [6] – [8].

CSCS forventes at være kritiske førere af tumorprogression grundet CSC karakteristika, herunder selvfornyelse kapacitet, grænseløs proliferativ potentiale og metastase potentiale, hvilket tyder på, at målrette CSC karakteristika ville sandsynligvis fjerne CSCS som er de “frø” af tumor tilbagefald og metastaser. Selvom CSC hypotese antyder, at tumorer kan opstå fra stamceller /progenitorceller, undersøgelser fra mange laboratorier vist, at EMT kan udstyre celler, som besidder CSC kendetegn samt en mere motile invasiv fænotype [7] – [10]. Tidligere undersøgelser er blevet bekræftet, at brystkræft indeholder et CSC-rum [11] – [13], der kan beriges med oprensning aldehyddehydrogenase 1 (ALDH1) -positive celler [13], eller CD44

+ /CD24

– /lave celler [11] ved at sortere, og også ved at rense sphereforming celler (mammospheres) fra forældrenes celler [12]. Der er undersøgelser viste, at EMT fænotype er højest i CD44

+ /CD24

– /lav brystkræft CSCS (7), og CSCS beriget fra bryst tumorer og metastatisk bryst pleuraekssudat udtrykkelige markører svarende til celler, der har undergået en EMT [7], [14]. Tilsvarende er EMT og CSC markører også ofte forbundet med brystkræft, der har en tilbøjelighed til metastase, såsom basal-lignende fænotype brystkræft undergruppe [15] og metaplastiske [16] brystkræft.

MikroRNA’er (miRNA) er en familie af små ikke-kodende RNA-molekyler, der regulerer genekspression ved baseparring til 3′-UTR af mål-mRNA. For nylig har en række miRNA vist sig at spille kritiske roller i progressionen og metastase af human malignitet [17], [18], herunder brystcancer. MIR-21 er en af ​​de første miRNA påvist i det humane genom, som også er et af miRNA vides at være opreguleret i alle typer af humane maligniteter [19]. Nylige undersøgelser viste, at flere tumorsuppressorer herunder fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom ti (PTEN) [20], tumorsuppressorgen tropomyosin 1 (TPM1) [21], programmeret celledød 4 (PDCD4) [22], maspin [23] , og matrixmetalloproteinaser hæmmere RECK og TIMP3 [24] var mål for miR-21, hvilket tyder på, at miR-21 er et vigtigt onkogene miRNA som er nært knyttet til tumorvækst og metastase.

der er undersøgelser viste, at miR -21 er en vigtig del af den cellulære signalering kredsløb, der regulerer EMT-programmet [25] – [27], samt associerede virksomheder med CSC signaturer [26], [28], hvilket tyder på, at miR-21 spiller en central rolle i proces med EMT og erhvervelse af CSC egenskaber, som i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse [29], men de underliggende mekanismer er fortsat uklare.

Nylige undersøgelser har vist, at miR-21 stiger tumorcelleproliferation, migration og invasion gennem målretning PTEN [20], et tumorsuppressorgen, der er en antagonist af phosphatidylinotidol 3-kinase (PI3K) ved at fjerne 3′-UTR phosphat af phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphat (PIP3). Men den rolle, PTEN i MIR-21 inducerende EMT og CSC fænotype er endnu ikke klarlagt. Det er velkendt, at PTEN negativt regulerer PI3K-proteinkinase B (AKT) pathway [30] og mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) /ekstracellulært signal reguleret kinase1 /2 (ERK1 /2) pathway [31], samt både AKT og ERK1 /2 veje blev anset for at være relevante for vedligeholdelsen af ​​EMT og CSC egenskaber [32] – [36]

Disse resultater tyder stærkt på, at miR-21 måske via AKT og ERK1 /2 veje. ved at målrette PTEN regulere EMT og CSC fænotype. I den foreliggende undersøgelse har vi vist, at antagonisme af MIR-21reversed EMT overensstemmelse med CSC fænotype via AKT og ERK1 /2 veje ved at målrette PTEN, indikerer en molekylær pathway, som kunne lindre de maligne biologiske opførsler af brystkræft.

Resultater

Transficerede HSA-miR-21 Antagomir Nedsat Expression af miR-21 i MDA-MB-231 celler

for at undersøge, om HSA-miR-21 antagomir kan formindske ekspressionen af ​​miR -21, blev HSA-mIR-21 antagomir eller dens negativ kontrol transficeret i MDA-MB-231-celler i 48 timer, derefter den relative ekspression af mIR-21 blev målt ved real time RT-PCR. Den relative udtryk for miR-21 var 0,10711 ± 0,01272 i MDA-MB-231 /anti-miR-21 celler, som i væsentlig grad var nedreguleret, som sammenlignes med 1,07862 ± 0,09722 negative kontrolgrupper (p = 0,0015;. Fig 1A ). Resultaterne antydede, at HSA-MIR-21 antagomir kunne formindske ekspressionen af ​​MIR-21 i MDA-MB-231-celler.

MDA-MB-231-celler blev transficeret med HSA-MIR-21 antagomir eller hsa- mIR-21 antagomir kontrol ved en slutkoncentration på 50 nmol i 48 timer. (A) MDA-MB-231-celler blev behandlet med HSA-MIR-21 antagomir faldt ekspressionen af ​​MIR-21, sammenlignet med kontrolgrupper (n1 = n2 = 3; p = 0,0015), ved real-time RT-PCR analyse. (BE) mRNA niveauer af mesenchymale biomarkører (N-cadherin, vimentin og alfa-SMA) og epithelial biomarkør (E-cadherin) i MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler og MDA-MB-231 /kontrol celler , målt ved real-time RT-PCR-analyse. De realtid RT-PCR reaktioner blev udført i et 20 pi reaktionsvolumen i tre eksemplarer, samtidigt. (F, G) De relative proteinniveauer af EMT markører i angivne celler blev vist ved Western blot-analyse, og båndene blev semi-kvantitativt ved brug ImageJ software. Beta-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. (H, I) De vandrende og invasive egenskaber angivne celler blev testet i migration og invasion assay i Transwell skær. Trængte celler blev talt og analyseret i histogrammet. Data repræsenterer mindst tre forsøg gennemført in triplo. (* Angiver p 0,05;

★ angiver p 0,001).

Antagonisme af miR-21 Tilbageført EMT, samt Nedsat Migration og Invasion i MDA-MB-231 celler

for at undersøge virkningerne af tvungen antagonisme af mIR-21 om EMT processen med MDA-MB-231-celler, den relative mRNA og protein ekspression af mesenchymale fænotype celle biomarkører (N-cadherin, vimentin, og alpha-SMA) og epithelial fænotype celle biomarkør (E-cadherin) i MDA-MB-231 /anti-mIR-21-celler og tilsvarende kontrolceller blev målt. Antagonisme af MIR-21 faldt de relative mRNA-niveauer af N-cadherin, vimentin, og alpha-SMA (p = 0,0038, p = 0,0018, og p = 0,0023, fig. Figur 1B, C, D), mens forøgede relative mRNA-niveauet af E-cadherin (p = 0,0017;. figur 1E) i MDA-MB-231 /anti-mIR-21-celler, i sammenligning med tilsvarende kontrolceller, ved real time RT-PCR-analyse. Resultaterne antydede, at antagonisme af MIR-21 kunne formindske mRNA ekspression af mesenchymale fænotype celle biomarkører, mens forøge mRNA-ekspression af epitelial fænotype celle biomarkør. Resultaterne fra Western blot-analyse viste, at de relative proteinniveauer af N-cadherin, vimentin, og alpha-SMA blev nedreguleret signifikant (p = 0,0003, p = 0,0026, og p = 0,04, fig. Figur 1F, G) , medens den af ​​E-cadherin blev opreguleret signifikant (p = 0,0053;. figur 1F, G) i MDA-MB-231 /anti-mIR-21-celler, i sammenligning med kontrolceller. Resultaterne antydede, at antagonisme af MIR-21 kunne formindske protein ekspression af mesenchymale fænotype celle biomarkører, mens øge den for epitelial fænotype celle biomarkør. Disse resultater viste klart, at antagonisme af miR-21 kunne vende den EMT, bygger på hæmmer EMT fænotypiske biomarkører. Funktionelt, den relative migreret og invaderede celleantal af MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler var signifikant lavere end negativ kontrol (p 0,0001, s 0,0001, fig. Figur 1H, I), foreslog, at antagonisme af miR-21 kan reducere celle migration og invasion i MDA-MB-231 celler, hvilket yderligere understreges funktionen af ​​miR-21 i invasionen og metastase af brystkræftceller.

Antagonisme af miR-21 Tilbageført CSC Fænotype i MDA-MB-231 celler

for at undersøge effekten af ​​antagonisme af miR-21 på CSC fænotype i MDA-MB-231 celler, andelen af ​​celler med ALDH1

+ (ALDH

lyse ) og CD44

+ /CD24

– /lav i MDA-MB-231 /anti-miR-21 celler og negativ kontrol celler blev målt. Procentdelen af ​​celler med ALDH1

+ i MDA-MB-231 /anti-miR-21 celler var 0,85

±

0,092, betydeligt mindre end 2,323 ± 0,315 negative kontrolgrupper (p = 0,0051; Fig . 2A, B), ved ALDEFLUOR assay; procentdelen af ​​celler med CD44

+ /CD24

– /lav i MDA-MB-231 /anti-MIR-21cells var 0,543 ± 0,129, også signifikant lavere end 4,807 ± 1,062 i kontrolgrupperne (p = 0,0094; fig. 2C, D), ved FACS-analyse. Disse resultater antydede, at antagonisme af miR-21 kunne sænke brystkræft CSC andel, som udtrykker CSC overflade biomarkører ALDH1

+ og CD44

+ /CD24

– /lav. Desuden den relative mRNA og protein ekspression af ALDH1 og CD44 i MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler og kontrolceller blev også målt. De relative mRNA niveauer af ALDH1 og CD44 i MDA-MB-231 /anti-miR-21 celler blev faldt betydeligt i forhold til kontrolgrupper (p = 0,0039, p = 0,0034, henholdsvis;. Figur 2E, F), som vurderet af real time RT-PCR-analyse, som foreslog, at antagonisme af miR-21 kunne formindske mRNA ekspressionen af ​​ALDH1 og CD44. Proteinet ekspression af ALDH1 og CD44 blev også reduceret tilsvarende (p = 0,0002, p = 0,0005, fig. Figur 2G, H), ved Western blot-analyse, antydede, at antagonisme af MIR-21 kunne formindske protein ekspression af ALDH1 og CD44 . Disse resultater viste, at antagonisme af miR-21 kunne vende CSC fænotype i MDA-MB-231 celler, hvilket yderligere foreslået, at miR-21 kunne inddrage i reguleringen af ​​CSC egenskaber. Mere interessant er mammosphere nummer i MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler var signifikant ringere med kontrolgrupper (p = 0,0017;. Fig 2I, J), indikerede, at antagonisme af MIR-21 kan nedsætte dannelsen af ​​mammospheres, som yderligere foreslået, at miR-21 kunne regulere CSC karakteristika, herunder kapacitet selvfornyelse og clonogenicity.

(A, B) ALDH1 enzymatisk aktivitet (ALDH

lyst) i etablerede brystkræft MDA-MB -231 /anti-mIR-21-celler og MDA-MB-231 /kontrolceller (n1 = n2 = 3) blev påvist under anvendelse af ALDEFLUOR assay. (C, D) Den CD44

+ /CD24

– /lav fænotype i angivne celler (n1 = n2 = 3) blev påvist ved FACS-analyse. (E, F) De relative mRNA-niveauer af ALDH1 og CD44 blev opdaget af real time RT-PCR-analyse. (G, H) De relative proteinniveauer af ALDH1 og CD44 blev påvist ved Western blot analyse. Beta-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. (I, J) Antallet af mammospheres fra 1000 MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler eller MDA-MB-231 /kontrolceller blev talt under mikroskop. Alle data repræsenterer mindst tre forsøg gennemført in triplo. (* Angiver p 0,05;

★ angiver p 0,001).

Antagonisme af miR-21 induceret Over-ekspressionen af ​​PTEN

Nylige undersøgelser har vist, at miR- 21 øget celleproliferation, migration og invasion gennem modulering tumorsuppressorgen PTEN [20], men forbliver rolle PTEN i mIR-21 regulerer tumor EMT og CSC fænotype at blive belyst. At undersøge, om antagonisme af miR-21 regulerer PTEN udtryk, blev mRNA og protein niveauer af PTEN målt ved real time RT-PCR-analyse og Western blot analyse, hhv. Som forventet både mRNA og protein ekspression af PTEN i MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler var stærkt opreguleret, sammenlignet med kontrolgrupper (p = 0,003, p = 0,0437, fig. Fig 3A, B, D). Disse resultater viste, at antagonisme af MIR-21 kunne opregulere ekspressionen af ​​PTEN.

(A) Ektopisk ekspression af PTEN-mRNA i MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler og MDA-MB- 231 /kontrol celler blev verificeret ved realtid RT-PCR assay (p = 0,003). (B, C, D) Protein niveauer af PTEN, p-AKT, AKT, p-ERK1 /2, og ERK1 /2 i angivne celler blev detekteret ved Western blot-analyse, og båndene blev semi-kvantitativt ved brug ImageJ software. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (* Angiver p 0,05)

Antagonisme af miR-21 Inaktiveret AKT og ERK1 /2

AKT og ERK1 /2 er to store signalveje i reguleringen celleproliferation, migration. og overlevelse, og begge blev også reguleret af PTEN, men roller AKT og ERK1 /2 veje i miR-21 regulerer tumor EMT og CSC fænotype mangler at blive belyst. Til bestemmelse af signalmolekyler, der involverer i antagonisme af MIR-21 vende EMT og CSC fænotype, protein niveauer af phosphoryleret AKT (p-AKT) og AKT, phosphoryleret ERK1 /2 (p-ERK1 /2) og ERK1 /2 var målt ved Western blot-analyse. Protein- niveauerne af p-AKT og p-ERK1 /2 i MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler var stærkt reduceret sammenlignet med kontrolgrupper (p = 0,0173, p = 0,0126, henholdsvis, fig 3C, D. ), bekræftede, at antagonisme af miR-21 kunne undertrykke AKT og ERK1 /2-aktivering i færd med at vende EMT og CSC fænotype.

Re-ekspressionen af ​​miR-21 induceret EMT og CSC fænotype, ledsaget med Downs-udtryk af PTEN samt Aktivering af AKT og ERK1 /2

for yderligere at bekræfte rolle miR-21 i reguleringen tumor EMT og CSC fænotype, HSA-miR-21 efterligner eller efterligner negativ kontrol blev transficeret ind etableret MDA-MB-231 /anti-mIR-21-celler. Ekspressionen af ​​MIR-21 steg til mere end 22-fold efter HSA-MIR-21 efterligner behandlet, sammenlignet med den negative kontrol (p = 0,0037;. Figur 4A) viste, at HSA-MIR-21 efterligner transfektion kunne øge relative ekspression af mIR-21.

Etablerede MDA-MB-231 /anti-mIR-21-celler blev transficeret med HSA-mIR-21 efterligner ved en koncentration på 40 nmol i 72 timer. (A) MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler blev behandlet med HSA-MIR-21 efterligner forhøjede ekspressionen af ​​MIR-21, sammenlignet med kontrolgrupper (n1 = n2 = 3; p = 0,00373), efter real-time RT-PCR-analyse. (BF) Protein niveauer af mesenchymale markører (N-cadherin, vimentin og alpha-SMA) (B), epitelial markør (E-cadherin) (B), CSC markører (ALDH1 og CD44) (C), PTEN (D), p-AKT og AKT (E), samt p-ERK1 /2 og ERK1 /2 (E) i angivne celler blev målt ved Western blot-analyse, og båndene blev semi-kvantificeres ved hjælp ImageJ software (F). Beta-actin eller GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (* Angiver p 0,05;

★ angiver p 0,001).

For at undersøge om tvungen re-ekspressionen af ​​miR-21 kan fremkalde EMT og CSC fænotype, nedregulere ekspressionen af ​​PTEN samt aktivere AKT og ERK1 /2-pathways, protein ekspression af EMT biomarkører (N-cadherin, vimentin, a-SMA, og E-cadherin), CSC markører (ALDH1 og CD44), PTEN, p-AKT, AKT , p-ERK1 /2, og ERK1 /2 blev målt ved Western blot-assay. Sammenlignet med de negative kontrolgrupper, tvungen re-ekspression af MIR-21 øgede protein ekspression af N-cadherin, vimentin, a-SMA, ALDH1 og CD44 (p = 0,0136, p = 0,0397, p = 0,0067, p = 0,0002 og p = 0,0006, fig. figur 4B, C, F), medens faldt ekspressionen af ​​E-cadherin (p = 0,0014;. figur 4B, F), foreslog, at re-ekspression af mIR-21 kunne inducere EMT og CSC fænotype i etablerede MDA-MB-231 /anti-mIR-21-celler. I mellemtiden, re-ekspression af MIR-21 faldt ekspressionen af ​​PTEN (p = 0,0081;. Figur 4D, F), viste, at re-ekspression af MIR-21 kunne påvirke ekspressionen af ​​MIR-21 direkte mål i cellerne. Endvidere re-ekspression af MIR-21 steg også ekspressionen af ​​p-AKT og p-ERK1 /2 i cellerne (p = 0,0008, p = 0,0022, henholdsvis;. Figur 4E, F), indikerede, at re-ekspression af miR-21 kunne aktivere AKT og ERK1 /2 veje. Disse resultater understøttes at miR-21 kunne regulere EMT og CSC fænotype, og ledsage med ændringer af PTEN og AKT /ERK1 /2 veje.

MIR-21 Målrettet PTEN vende EMT og CSC Fænotype

for at bestemme om udtømning af PTEN kan blokere mIR-21 antagomir vende EMT og CSC fænotype, siPTEN eller kontrol SsiPTEN blev transficeret i MDA-MB-231-celler. Efter 24 timer blev cellerne transficeret med MIR-21 antagomir eller negativ kontrol, og derefter EMT og CSC fænotype blev undersøgt som beskrevet ovenfor. Vi fandt, at siPTEN signifikant nedregulerede ekspressionen af ​​PTEN (p = 0,002;. Figur 5A, E), sammenlignet med SsiPTEN grupper. Overensstemmelse med virkningerne af MIR-21 antagomir på EMT og CSC fænotype i MDA-MB-231 celler (figur 1 og figur 2..), Antagonisme af MIR-21 også omvendt EMT (N-cadherin, p = 0,0025; vimentin, p = 0,0025; alpha-SMA, p = 0,0003; E-cadherin, p = 0,0308;. figur 5B, E) og CSC fænotype (ALDH1, p = 0,0014, CD44, p = 0,002;. figur 5C, E) i MDA -MB-231 /SsiPTEN celler (

SsiPTEN + miRNA antagomir negative kontrolgrupper vs. SsiPTEN + miR-21 antagomir grupper

); udtømning af PTEN af siPTEN blokeret miR-21-antagomir-vende EMT (N-cadherin, p = 0,0172, vimentin, p = 0,0113; alpha-SMA, p = 0,0015; E-cadherin, p = 0,016;. figur 5B, E ) og CSC fænotype (ALDH1, p = 0,0042, CD44, p = 0,0004;. figur 5C, E) (

SsiPTEN + miR-21 antagomir grupper vs. siPTEN + miR-21 antagomir grupper

). Disse resultater antydede, at udtømning af PTEN kunne blokere miR-21-antagomir -reversing EMT og CSC fænotype, hvilket yderligere foreslået, at antagonisme af miR-21 kunne målrette PTEN at vende EMT og CSC fænotype. Desuden, udtømning af PTEN aktiveret miR-21-antagomir-blokerende AKT og ERK1 /2 veje (p-AKT, s 0,0001; p-ERK1 /2, p = 0,0037;. Figur 5D, E) (

SsiPTEN + miR-21 antagomir grupper vs. siPTEN + miR-21 antagomir grupper

), viste, at AKT og ERK1 /2 veje er nedstrøms veje for PTEN i reguleringen EMT og CSC fænotype.

. MDA-MB-231-celler blev transficeret med siPTEN eller krypterede kontrol SsiPTEN ved en slutkoncentration på 50 nmol i 24 timer. Derefter blev cellerne transficeret med HSA-MIR-21 antagomir eller negativ kontrol ved en slutkoncentration på 50 nmol i 72 timer. Celler blev trypsinbehandlet, og de relative proteinniveauer af PTEN (A), EMT markører (B), CSC overflademarkører (C), p-AKT og AKT (D), samt p-ERK og ERK (D) blev målt og semi-kvantificeres (E) som nævnt før. De repræsentative propper fra behandlinger af SsiPTEN plus miR-21 antagomir kontrol, SsiPTEN plus miR-21 antagomir, og siPTEN plus miR-21 antagomir blev vist på billedet. Beta-actin eller GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (* Angiver p 0,05;

★ indikerer p 0,001).

MIR-21 Reguleret EMT og CSC Fænotype, samt Cell Proliferation gennem AKT og ERK1 /2 Veje

for yderligere at undersøge roller AKT og ERK1 /2 veje i miR-21 regulerer EMT og CSC fænotype, blev MDA-MB-231 /anti-MIR-21-celler transficeret med miR-21 efterligner i en koncentration på 40 nmol i 72 timer og derefter blev cellerne behandlet med LY294002 (inhibitoren af ​​PI3K-AKT) ved 20 umol /l eller U0126 (inhibitoren af ​​ERK1 /2) ved 10 umol /l i 24 timer. Vi bekræftede, at LY294002 behandling blokerede re-ekspressionen af ​​miR-21 inducerer AKT aktivering (p 0,0001;. Figur 6A, E), mens U0126 behandling afskaffet re-ekspressionen af ​​miR-21 inducerer ERK1 /2-aktivering (p 0,0001; Fig . 6A, E). Mere interessant, blev re-ekspression af MIR-21 inducerende EMT og CSC fænotype inhiberet af LY294002 (N-cadherin, p = 0,0005; vimentin, p = 0,0005; alpha-SMA, p = 0,0008; E-cadherin, p = 0,0002; ALDH1, s 0,0001, CD44, s 0,0001;. figur 6B, C, E) eller U0126 (N-cadherin, s 0,0001, vimentin, p = 0,0005; alpha-SMA, p = 0,0004; E-cadherin, s = 0,0003, ALDH1, s 0,0001, CD44, p = 0,0005;. figur 6B, C, E) i cellerne, viste, at både AKT og ERK1 /2 veje er kræver for miR-21 til at inducere EMT og CSC fænotype, som yderligere foreslået, at AKT og ERK1 /2 veje er to parallelle nedstrøms veje for miR-21 til regulering EMT og CSC fænotype. Desuden både LY294002 og U0126 har ingen dokumenteret effekt på PTEN (p = 0,1208, p = 0,4361, henholdsvis;. Figur 6D, E)., Hvilket også understøttes, at AKT og ERK1 /2 veje er nedstrøms veje for PTEN

Etablerede MDA-MB-231 /anti-mIR-21-celler blev transficeret med HSA-mIR-21 efterligner ved en koncentration på 40 nmol i 72 timer. Derefter blev cellerne trypsiniseret, og behandlet med LY294002 (20 pmol /l) eller U0126 (10 pmol /l) i 24 timer. (AE) De relative proteinniveauer af p-AKT og AKT (A), p-ERK og ERK (A), EMT markører (B), CSC overflademarkører (C), samt PTEN (D) fra blank kontrol, LY294002, og U0126 behandlingsgrupper blev vist, og semi-kvantificeres (E) som nævnt før. Beta-actin eller GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (* Angiver p 0,05;

★ angiver p 0,001;

▴ indikerer p 0,05). . (F) Virkningerne af antagonisme af miR-21, re-ekspressionen af ​​miR-21, LY294002, og U0126 om celledeling ved celletælling (A

vs

B, p = 0,0077; B + C

vs

B + D, p = 0,0091;. B + D

vs

B + D + E, p = 0,0109;.. B + D

vs

B + D + F, p = 0,0031).

Udover at verificere roller AKT og ERK1 /2 veje i mIR-21 regulerer celleproliferation i de celler, der er nævnt ovenfor, cellevæksten numre af celler blev beregnet ved 0, 12, 24, 36, 48, 60 og 72 timer efter behandling af celletal. Vi fandt, at tvungen antagonisme af MIR-21 faldt celleproliferation i MDA-MB-231-celler (p = 0,0077;. Figur 6F), mens re-ekspression af MIR-21 forhøjet celleproliferation i MDA-MB-231 /anti-miR -21 celler, under 0-72 timer (p = 0,0091;. figur 6F). Resultaterne antydede, at MIR-21 kunne regulere cellepropagering til en vis grad i MDA-MB-231-celler. I mellemtiden blev både AKT og ERK1 /2 hæmninger nedsat celleproliferation (p = 0,0109, p = 0,0031, henholdsvis;. Figur 6F)., Som foreslog, at reguleringen af ​​AKT eller ERK1 /2 knyttet til ændringer i celledeling

diskussion

miRNA er kodende små RNA, der kan virke som onkogener eller tumorsuppressorgener [37], [38]. Voksende beviser viste, at miR-21 overekspression detekteres i forskellige former for menneskelige kræftformer, herunder brystkræft, og er forbundet med EMT [25] – [27] og CSC egenskaber [26], [28]. Men de direkte roller og centrale molekylære mekanismer i MIR-21 i regulering af brystkræft EMT og CSC fænotype er endnu ikke klarlagt. I denne undersøgelse fandt vi, at antagonisme af MIR-21 i MDA-MB-231-celler vendt EMT og CSC fænotype, opreguleret ekspression af PTEN, samt inaktiveret AKT og ERK1 /2-veje. Resultaterne viste, at antagonisme af MIR-21 er tilstrækkelig til at vende EMT og CSC fænotype gennem modulering af ekspressionen af ​​PTEN og AKT /ERK1 /2-veje, giver nogle direkte bevis og molekylære mekanismer, som MIR-21 er i stand til at regulere EMT og CSC fænotype .

for at undersøge betydningen af ​​miR-21 i reguleringen EMT og CSC fænotype af brystkræftceller, antagomir af miR-21, som specifikt kan binde sig til og hæmme endogene miR-21 molekyler, eller dens negative kontrol oligomer , blev transficeret i MDA-MB-231-celler. Den antagomir faldt 90% af endogen MIR-21-ekspression i cellerne (fig. 1A). Interessant, blev den relative EMT og CSC fænotype vendes ved antagonisme af miR-21 (fig 1B-G,.. Figur 2A-J), som i overensstemmelse med miR-21 indebærer at fremme EMT og (eller) CSC fænotype i bugspytkirtelkræftceller [26], [28], skjoldbruskkirtel carcinomaceller [27], og vores tidligere studere i MCF-7 celler [29]. Ledsaget med resultaterne, antagonisme af MIR-21 signifikant øget ekspression af PTEN (fig. 3A, B, D), samt nedsat AKT og ERK1 /2-aktivering (fig. 3C, D). Disse resultater viste, at MIR-21 spiller en vigtig rolle ved mediering af EMT og CSC fænotype, ledsage ved at regulere ekspressionen af ​​PTEN, samt AKT og ERK1 /2-aktivering.

Dernæst undersøgte vi de underliggende mekanismer og relative signalmolekyler i antagonisme af mIR-21 vende EMT og CSC fænotype. I overensstemmelse med den, MIR-21 undertrykker funktionen af ​​tumor suppressor PTEN ekspression ved at binde til sin 3′-UTR [20], vi bevist, at antagonisme af MIR-21 opreguleret PTEN ekspression (fig. 3A, B, D). Som forventet, PTEN ned-udtryk især blokeret miR-21-vende EMT og CSC fænotype (fig. 5B, C, E), bekræftede, at antagonisme af miR-21 udstiller sin rolle dels ved at fremme PTEN udtryk, og inddrivelse af PTEN udtryk ville reducere dens funktion af tumor suppressor.

endvidere har vi også fundet, at re-ekspression af mIR-21 ved mIR-21 efterligner førte til aktivering af Akt og ERK1 /2-pathways (fig. 4E, F) . Mere interessant, behandledes cellerne med PI3K-AKT eller ERK1 /2-inhibitor (LY294002 eller U0126), forbudt MIR-21 efterligner genvinde EMT og CSC fænotype (Fig. 6B, C, E). Resultaterne antydede, at virkningerne af AKT og (eller) ERK1 /2 på miR-21-regulerende EMT og CSC fænotype, i overensstemmelse med at AKT og (eller) ERK1 /2-veje er nødvendige for at fremme EMT og (eller) CSC fænotype i brystcancer MCF-7 celler [32], bryst epiteliale celler [33], [34], coloncancer-celler [35], cervicale cancerceller [32] og ovariecarcinomer celler [36].

sammenfattende vores resultater viste, at antagonisme af mIR-21 reverserer EMT og CSC fænotype gennem AKT og ERK1 /2 veje inaktivering ved at inducere PTEN ekspression i MDA-MB-231-celler (fig. 7). Denne undersøgelse viste en direkte rolle og ny mekanisme af miR-21 i inversing EMT og CSC fænotype, og oplysningerne kan være nyttigt at udvikle en ny terapi til behandling af brystkræft i fremtiden.

Antagonisme af miR- 21 kunne inaktivere AKT og ERK1 /2 veje formentlig gennem PTEN opregulering, og til sidst vende EMT og CSC fænotype i MDA-MB-231 celler.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

Menneskelig har-miR-21 (MIMAT0000076) antagomir og negativ kontrol, efterligner og negative kontrol blev købt fra Ribobio (Guangzhou, Kina). PCR primere blev syntetiseret af Sangon Biotech (Shanghai, Kina). Real time RT-PCR assay-kits blev købt fra Takara (Dalian, Kina). Specifikke siPTEN rækkehuse og scramble kontrol siRNA sekvens (SsiPTEN) blev købt fra Ribobio. LY294002 og U0126 blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Lipofectamine ™ 2000 indkøbt fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). ALDEFLUOR® Kit blev købt fra Aldagen (Durham, NC, USA). Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket anti-CD44-antistof og phycoerythrin (PE) -mærket anti-CD24-antistof blev købt hos BioLegend (San Diego, CA, USA). Primære antistoffer, herunder kanin antihuman E-cadherin antistof (nr: BS1098; Bioworlde, St. Louis, MO, USA), N-cadherin antistof (nr: BS2224, Bioworlde), vimentin antistof (nr: BS1776, Bioworlde), alpha-SMA antistof (No: ab5694, Abcam, Cambridge, UK), ALDH1 antistof (No: ab51028, Abcam), CD44-antistof (No: BA0321, Boster, Wuhan, Kina), PTEN antistof (No: BS1304, Bioworlde), AKT antistof (