PLoS ONE: Unormal proteinglycosylering og Aktiveret PI3K /Akt /mTOR Pathway: Rolle i Blære Cancer Prognose og målrettet Therapeutics

Abstrakt

Muskel invasiv blærekræft (MIBC, scene ≥T2) er generelt forbundet med dårlig prognose , som udgør den næsthyppigste dødsårsag blandt urogenitale tumorer. På grund af høje molekylære heterogenitet betydelige variationer i den naturlige historie og sygdom resultatet er blevet observeret. Dette har også forsinket indførelsen af ​​personlige lægemidler, hvilket gør fremskredent stadium blærekræft næsten et forældreløst sygdom i form af behandling. Ændrede protein glycosylering oversat af ekspressionen af ​​sialyl-Tn-antigenet (STN) og dens precursor Tn samt aktiveringen af ​​PI3K /Akt /mTOR pathway er cancerassocierede begivenheder, der kan indeholde potentiale for patienten lagdeling og styret terapi. Derfor blev en retrospektiv design, 96 blæretumorer af forskellige stadier (Ta, T1-T4) screenet for stn og phosphorylerede former af Akt (Pakt), mTOR (pmTOR), S6 (PS6) og PTEN, relateret til aktivering af PI3K /Akt /mTOR pathway. I vores serie udtryk for Tn var residual og var ikke knyttet til scenen eller resultat, mens STN var statisk højere i MIBC når sammenlignet med ikke-muskel invasive tumorer (p = 0,001) og tilhørende faldt cancer-specifik overlevelse (log rank p = 0,024). Omvendt PI3K /Akt /mTOR pathway mellemprodukter viste en ligelig fordeling mellem ikke-muskel invasiv blærekræft (NMIBC) og MIBC og ikke forbinder med kræft-specif overlevelse (CSS) i nogen af ​​disse grupper. Men overekspression af Pakt, pmTOR og /eller PS6 tilladt at diskriminere STN-positive fremskredent stadium blæretumorer står værste CSS (p = 0,027). Desuden afslørede multivariat Cox regressionsanalyse, at overekspression af PI3K /Akt /mTOR pathway proteiner i STN + MIBC uafhængigt var forbundet med ca. 6 gange risiko for død ved cancer (p = 0,039). Mus bærende fremskredent stadium kemisk inducerede blæretumorer efterligner den histologiske og molekylære beskaffenhed af humane tumorer blev derefter administreret med mTOR-inhibitor sirolimus (rapamycin). Dette faldt antallet af invasive læsioner og parallelt hermed ekspressionen af ​​stn og også PS6, nedstrøms effektor af PI3K /Akt /mTOR pathway. Afslutningsvis blev STN fundet at være markør for dårlig prognose i blærekræft, og i kombination med PI3K /Akt /mTOR pathway evaluering, rummer potentiale til at forbedre lagdeling af scenen sygdom. Dyreforsøg tyder på, at mTOR pathway hæmning kunne være en potentiel terapeutisk tilgang for denne specifikke undertype af MIBC

Henvisning:. Costa C, Pereira S, Lima L, Peixoto A, Fernandes E, Neves D, et al. (2015) Unormal proteinglycosylering og Aktiveret PI3K /Akt /mTOR Pathway: Rolle i Blære Cancer Prognose og målrettede Therapeutics. PLoS ONE 10 (11): e0141253. doi: 10,1371 /journal.pone.0141253

Redaktør: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), SPANIEN

Modtaget: Juli 28, 2015; Accepteret: 6 oktober 2015; Udgivet: November 16, 2015

Copyright: © 2015 Costa et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den portugisiske Foundation for Science and Technology (FCT) postdocstipendier SFRH /BPD /66288/2009 (José Alexandre Ferreira), SFRH /BPD /101.827 /2014 ( Luis Lima), SFRH /BPD /85462/2012 (Rui Gil da Costa) og ph.d.-stipendier SFRH /BD /103.571 /2014 (Elisabete Fernandes) og SFRH /BD /111.242 /2015 (Andreia Peixoto). FCT er medfinansieret af Den Europæiske Socialfond (ESF) under menneskelige potentiale Operation Programme (POPH) fra nationale strategiske referenceramme (NSR). Forfatterne anerkender også økonomisk støtte fra ICBAS-UP (Céu Costa og Sofia Pereira) og den portugisiske sammenslutning af Urology /Pfizer præmie 2013. finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af . manuskript

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er den anden mest dødbringende uro-genital tumor og præsenterer betydeligt dårligere prognose på

muscularis propria

invasion [1]. Ca. 20-30% af de nydiagnosticerede tilfælde er muskel invasive blære kræft (MIBC; T2-T4 etaper), mens 50% er ikke-muskel invasive blæretumorer (NMIBC) med stort potentiale til fremskridt til invasion. MIBC behandling omfatter cystektomi og (neo) adjuverende cisplatin-baseret kemoterapi [2]. Dog kan observeres betydelige variationer i den naturlige historie af sygdommen og reaktioner på behandling mellem tumorer med identiske histologiske træk, hvilket afspejler deres høje molekylære heterogenitet [3]. Desuden ca. 50% af tilfældene udvikle metastaser inden for 5 år, opfordrede identifikation af biomarkører til at hjælpe prognosticering og udvikling af mere effektive målrettede lægemidler [4].

For at imødekomme dette behov, vi har for nylig behandlet udtrykket af cancerassocieret sialyl-Tn-antigenet (STN) på en lille prospektiv række uselekterede blærecancerpatienter [5]. STN er en unormal post-translationel modifikation, der resulterer fra en for tidlig stop i celle-membran-proteiner

O

-glycosylation ved sialylering af Tn-antigenet (fig 1A). I blæretumorer, STN det var hovedsageligt til stede i tilfælde, fremskredent stadium, mens fraværende fra de fleste low-grade NMIBC [5]. Desuden var det ikke udtrykkes ved normal urothelium, der betegner en cancer-specifikke karakter [5]. Undersøgelser

in vitro

viste, at stn udtryk begavet blære cancerceller med høj invasion kapacitet [5] og en immunotolerogenic fænotype, potentielt begunstige formidling sygdom [6]. Ændringer i celleoverfladeprotein glycosylering har være impliceret i aktiveringen af ​​intracellulære onkogene signalveje [7], herunder phosphoinositid-3-kinase (PI3K) /Akt-signalvejen [8], som menes at spille en kritisk rolle i blæren cancerudvikling . Disse indledende bemærkninger støtter hypotesen om, at STN udtryk kan spille en central rolle i udfald sygdom, som berettiger en dybere undersøgelse. Flere undersøgelser viser også, at Tn-antigenet, som er et forstadium til STN, kan også impliceret i onkogene begivenheder [7]; men intet er kendt om udtryk for denne glycan i blæretumorer.

A) Repræsentation af membranprotein

O

-glycosylation med vægt på STN udtryk ved kræftceller. Dette er en yderst reguleret proces af afgørende betydning for proteinstabilitet og funktion. Kort beskrevet nysyntetiserede proteiner er

O

-glycosylated i Golgi-apparatet ved ppGalNAcTs-medieret tilsætning af GaINAc-delen til Ser /Thr-rester. Dette stammer Tn-antigenet (GaINAc-O-Ser /Thr-protein backbone), hvilket er den enkleste O-glycan. I normale celler Disse kæder er forlænget gennem den sekventielle tilføjelse af andre sukkerarter først ved CGALT-1 og derefter andre enzymer. Det kulminerer i meget komplekse, heterogene og aflange glycaner ofte afsluttet med ABO eller Lewis blod gruppe relaterede antigener (venstre tegning). I kræftceller Tn-antigenet straks sialylerede af ST6GalNAc.I, stammer STN antigen (Neu5Ac-GaINAc-O-Ser /Thr-protein backbone), og derved hæmme yderligere kæde forlængelse (højre tegning). Ekspressionen af ​​STN ved celleoverfladen påvirker celle-celleadhæsion og cancerceller anerkendelse, begunstige motilitet, invasion og immun escape. B) Skematisk fremstilling af PI3K /Akt /mTOR pathway, som er ubikvitært aktiveres i blæretumorer. Dette er en særdeles konserveret pathway hovedsageligt reguleret af en lang række ekstracellulære signaler, herunder mitogene vækstfaktorer, hormoner, næringsstoffer, cellulære energiniveauer og stresstilstande. Disse signaler aktiverer tyrosin receptorkinaser der rekrutterer PI3K, som katalyserer omdannelsen af ​​membranbundne PIP2 til PIP3. Derefter Akt og PDK-1 aktiveres ved binding til PIP3. PTEN fortrinsvis dephosphorylerer PIP3, inhibering signalering progression. Fuld Akt aktivering kræver dobbelt-phosphorylering ved PDK-1 selv og PDK-2 (ikke vist). Akt phosphorylerer mTOR direkte eller kan også inaktivere TSC1 /TSC2 kompleks, inhibering mTOR inaktivering. mTORC1 udløser cellevækst og proliferation med phosphorylering eukaryote oversættelse regulatorer, blandt disse p70S6 kinase (p70S6K eller S6K1), som til gengæld, phosphorylerer det ribosomale protein S6 (PS6), og den eukaryote translationsinitiering faktor 4E-bindende protein 1 (4E-BP1 ). For proteinet mTOR at aktivere sin signaleringskaskade, skal den danne rapamycinet-sensitive ternære kompleks mTORC1. Key PI3K /Akt /mTOR-pathway proteiner Pakt, pmTOR og PS6 udforsket i dette studeret, er fremhævet med orange cirkler.

phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) /Akt og pattedyrs mål for rapamycin (mTOR) veje er forbundet med hinanden signalering kaskader afgørende for blære cellevækst og overlevelse (fig 1B). PI3K /Akt /mTOR eller mTOR pathway integrerer en mangfoldighed af ekstracellulære signaler til regulering nedstrøms signalering og proteinsyntese, hvilket i sidste ende fører til en konkurrencedygtig vækstfordel, metastatisk kompetence, angiogenese, og terapi resistens [9]. Den signaleringskaskade begynder med PI3K-aktivering i cellemembranen efterfulgt af serin /threonin-kinase Akt cellemembran translokation og aktivering. Den bedst undersøgte nedstrøms substrat af Akt er serin /threonin-kinase mTOR, hvis nedstrøms effektor er S6-kinase-1 (S6K1). Især har en delmængde af mTOR pathway ændringer blevet vist at forekomme i blærecancer, såsom mutationer i

PIK3CA

gen, som kulminerer med øget mTOR signal- og blære cancerceller resistens over for apoptose [10]. Desuden farmakologisk eller biokemisk hæmning af PI3K pathway drastisk reduceret den invasive kapacitet blære cancercellelinier. Endvidere over halvdelen af ​​primære humane blæretumorer foreliggende høj Akt phosphorylering og den afvigende aktivering af denne pathway er blevet foreslået, at bidrage til invasion [11]. En anden begivenhed påvirker mTOR pathway aktivering i blæretumorer indebærer tab af tumor suppressor PTEN (phosphatase og tensin homolog slettet på kromosom ti) -funktionen [12]. PTEN undertrykker normalt aktivering af PI3K /Akt /mTOR pathway antagoniserende PI3K og forhindre aktivering af Akt og PDK-1. PTEN fungerer også til at regulere kemotaksi og cellemotilitet og dermed fremme tumorinvasion [13]. Sammenfattende er der beviser, at en omfattende evaluering af PI3K /Akt /mTOR pathway associerede proteiner kan holde et betydeligt potentiale for værdi for patienten lagdeling. Desuden har mange prækliniske og kliniske undersøgelser støtter, at mTOR-hæmmere, såsom sirolimus (rapamycin) og deres derivater kan forbedre kræftbehandlingen [13,14].

Baseret på disse observationer hypotese vi, at Tn og /eller STN kan virker synergistisk med mTOR pathway at drive blærekræft progression. Som sådan har vi afsat på at evaluere ekspressionen af ​​stn og proteiner associeret med aktiveringen af ​​PI3K /Akt /mTOR pathway aktivering i blæretumorer på forskellige stadier. Vi forventer, at kombinationen af ​​ekstracellulære og intracellulære onkogene begivenheder kan forbedre patientens lagdeling og give indsigt til nye lægemidler. Derudover har vi estimeret effekten af ​​sirolimus i kemisk inducerede urothelial tumorer i mus, forudse oprettelsen af ​​et rationale for mere effektive blære kræftmedicin.

Materialer og metoder

Etik Statement

Dette arbejde indebærer oplevelser i tumor prøver fra patienter diagnosticeret med blærekræft i den portugisiske Insitute of Oncology Porto. Alle procedurer blev udført efter patientens skriftligt informeret samtykke og godkendt af den etiske komité portugisiske Institut for Onkologi-Porto. Alle klinisk-patologisk oplysninger blev indhentet fra patienternes kliniske optegnelser.

Det indebærer også dyreforsøg. Alle procedurer, der involverer dyr blev udført i overensstemmelse med den europæiske direktiv 2010/63 /EU. I løbet af denne undersøgelse blev dyrene fodret

ad libitum

med standardiseret mad (Tecklad Global Diet, Harlan, Spanien). Følgende protokol blev godkendt af det portugisiske etiske komité for dyreforsøg (Direção Geral de Veterinaria, Godkendelse nr. 520/000/000/2003). Alle mus, der anvendes i forsøget, blev akklimatiseret i en uge under rutinemæssige laboratorieforhold, før du starter forsøgene. De blev anbragt tilfældigt i grupper på 4-5 i plast bure, med hårdt træ chips til strøelse. Dyrene blev holdt i et rum med en kontrolleret temperatur på 23 ± 2 ° C, en 12-timers lys /mørke-cyklus og 55 ± 5% fugtighed. Dyrenes drikkevand løsninger blev ændret en gang om ugen eller tidligere, hvis det er nødvendigt, og mængden beruset blev registreret. Ugentlig fødeindtagelse blev også bemærket. Alle mus blev overvåget gennem hele eksperimentet for tegn på lidelse og tab af kropsvægt. Dyrene blev aflivet med 0,4% natriumpentobarbital (1 ml /kg, intraperitoneal).

Population

Denne undersøgelse blev udført i en retrospektiv serie af 96 formalinfikserede paraffinindlejrede blæretumorer opnået fra arkiverede paraffinblokke på det portugisiske Institut for Onkologi-Porto (IPOP), Portugal. Blære tumorer blev udvundet fra 82 mænd og 14 kvinder i alderen fra 38 til 92 år (median af 69,5 år), indrømmede og behandles på IPOP mellem 2005 og 2007. Fyrre syv af de undersøgte tumorer blev histologisk klassificeret som NMBIC (Ta og T1) og 49 som invasive læsioner (T2-T4). Seksten var lav kvalitet og 80 var høj kvalitet tumorer, ifølge 2004 WHO indplaceringskriterier de. Endvidere carcinom

in situ

(CIS) blev fundet samtidigt i 20,8% af patienterne. Den gennemsnitlige opfølgningstid periode var 45 måneder (1-134 måneder). Cystektomi blev udført i 64 patienter (66,7%), mens de andre 32 (33,3%) blev forelagt transuretral resektion. Lymphadenectomy blev udført i ca. 47% af patienterne og fra dem 37% fremlagt metastase. Halvtreds fire (56,3%) tumorer var primær og 42 (43,7%) var tilbagevendende tumorer. Fra de tilbagevendende tumorer, 38% havde ingen forudgående behandling, 27% blev behandlet med Mitomicin C, 11% med BCG og 19% blev forelagt begge behandlinger. Desuden 5% af disse patienter blev behandlet med neoadjuverende kemoterapi før cystektomi. Tabel 1 opsummerer de klinisk-patologisk information.

Kræft-specifik overlevelse (CSS) blev defineret som perioden mellem fjernelsen svulsten ved operation og enten patient død ved cancer eller den sidste opfølgende oplysninger. Alle procedurer blev udført efter patientens informerede samtykke og godkendt af den etiske komité i IPO-Porto. Alle klinisk-patologisk oplysninger blev indhentet fra patienternes kliniske optegnelser.

Immunhistokemi

De udtryk for stn antigen, dens forløber Tn, og phosphorylerede former af Akt (Pakt), mTOR (pmTOR), S6 ( PS6) og PTEN i blæretumorer blev tilgået ved immunhistokemi under anvendelse af avidin /streptavidin peroxidase metode, som beskrevet af Ferreira et al. [5]. Oplysninger om de primære antistoffer og fortyndinger anvendes i denne undersøgelse er opsummeret i tabel 2. Immunoreaktivitet blev afsløret under anvendelse af diaminobenzidin (DAB, Thermo Scientific LabVision) som kromogen og snit blev modfarvet med Harris ‘hematoxylin. Negative kontroller blev udført ved at erstatte det primære antistof med 5% bovint serumalbumin (BSA). Positive kontroller blev kendte positive væv for antigenerne under studiet.

Immunhistokemi scoring af humane tumorer

De immunfarvet sektioner blev vurderet dobbelt-blindt ved lysmikroskopi af to uafhængige observatører (CC og SP) og valideret af en erfaren patolog (TA). Uoverensstemmelse aflæsninger blev re-analyseret ved hjælp af en dobbelt-ledes mikroskop (Olympus BX46, Olympus), og konsensus blev nået. En semi-kvantitativ tilgang blev etableret for at score den immunhistokemiske mærkning baseret på omfanget og intensiteten af ​​farvning.

I betragtning af den mangel på Tn og STN i den sunde urothelium [5], tumorer blev klassificeret som positive for disse antigener når blev observeret membran og /eller cytoplasmatisk immunoreaktivitet i mere end 5% af tumoren, som beskrevet af Ferreira et al. [5,15]. Pakt, pmTOR, PS6 og PTEN udtryk blev scoret efter farvningen intensitet (svag-1 point, moderat-2 point, stærkt-3 point) ganget med procentdelen af ​​positive celler (0-5% -0 point; 5 -25% -1 point; 25-50% -2 points; 50-75% -3 points; 75-100% -4 point). Baseret på den foreslået af Nishikawa et al klassificering. [16], tumorer med en score 6 blev anset negative, mens dem med en score≥6 var klassificeret som positive (overekspression). Pakt blev evalueret baseret på nuklear immunoreaktivitet, pmTOR og PS6 baseret på cytoplasmatisk udtryk og PTEN på både cytoplasmatisk og nuklear farvning, som foreslået af andre publikationer [17,18].

Dyreforsøg med sirolimus og immunhistokemi scoring

Histologiske sektioner af Prægning Kontrol Region (ICR) mus der bærer N-butyl-N- (4-hydroxybutyl) nitrosamin (BBN) -induceret blære læsioner, som følge af vores tidligere arbejde om virkningen af ​​sirolimus på blærekræft [19 ], blev valgt til denne undersøgelse. Kort fortalt, fire uger gamle ICR-mus (25g; Harlan, Barcelona, ​​Spanien) blev tilfældigt fordelt i fire grupper, som beskrevet detaljeret i en tidligere publikation [18]. Gruppe 1 (n = 6) indeholdt mus udsat for 0,05% BBN i 12 uger efterfulgt af ledningsvand i 8 uger (dvs. 20 uger). Gruppe 2 (n = 7) inkluderet mus behandlet med 0,05% BBN opløsning i tolv uger, opretholdt med normal postevand til anden uge, administreret intraperitonealt med mTOR-inhibitor sirolimus (1,5 mg /kg; Wyeth) i fem dage om ugen i seks i træk uger, dvs. indtil den 19

th uge, efterfulgt af en anden uge af postevand (i alt 20 uger). Gruppe 3 (n = 6) indeholdt mus udsat for 0,05% BBN i 12 uger efterfulgt af ledningsvand i 11 uger (i alt 23 uger). Gruppe 4 (n = 7) inkluderet mus behandlet med 0,05% BBN og sirolimus, som beskrevet for gruppe 2, men med en eksponering for postevand bagefter på 3 uger (i alt 23 uger). Gruppe 3 og 4 blev skabt for at vurdere muligheden for sene tilbagefald og /eller molekylære ændringer som følge af forlænget overlevelse. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med den europæiske direktiv 2010/63 /EU. I løbet af denne undersøgelse blev dyrene fodret

ad libitum

med standardiseret mad (Tecklad Global Diet, Harlan, Spanien). De histologiske forandringer som følge af disse forsøg omfattede både præneoplastiske og neoplastiske læsioner med invasive potentiale og invasive tumorer, som beskrevet i detaljer af Oliveira et al. [18]. Heri blev læsioner af høje invasive potentiale og muskel invasive tumorer screenet for stn og PS6 ved immunhistokemi, som beskrevet detaljeret for humane tumorer, eftersom de anvendte antistoffer er reaktive mod både human og mus. Både intensiteten og udvidelsen af ​​immunfarvning blev taget i betragtning at score ekspressionen af ​​antigenerne, som beskrevet i det foregående afsnit. Blæren læsioner og immunfarvning blev vurderet dobbelt-blindt af to uafhængige observatører (CC og SP) og valideret af en erfaren veterinær patolog (RMGC).

Statistisk analyse

Statistisk dataanalyse blev udført med IBM Statistisk Package for Social Sciences-SPSS til Windows (version 20.0). Chi-square-analyse blev anvendt til at sammenligne kategoriske variable. Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev anvendt til at vurdere sammenhængen mellem stn ekspression og cancer-specifik overlevelse (CSS) og blev sammenlignet under anvendelse log-rank test. Endvidere blev multivariat Cox regressionsanalyse udført for at vurdere den individuelle virkning af de evaluerede markører på patientens overlevelse og tilpasse sig potentielle confoundere (variabler, der kan påvirke CSS af NMIBC og MIBC patienter). Sammenhængen mellem PI3K /Akt /mTOR pathway molekyler blev udført ved hjælp af Spearman rho test.

Resultater

Altered proteinglycosylering, oversat af ekspression af STN antigenet og dens forløber Tn, PI3K /Akt /mTOR pathway molekyler (Pakt, pmTOR, PS6), og PTEN inaktivering, er vigtigste træk ved blæretumorer. Heri har vi afsat til en omfattende analyse af disse molekylære ændringer i en række patienter blærekræft på forskellige stadier af sygdommen, forudse biomarkører for dårlig cancer-specifik overlevelse.

Vores datasæt er komponeret af 47 NMIBC og 49 MIBC patienter, som viste i tabel 1. Ifølge figur 2, NMIBC præsenteret en højere kræft-specifik overlevelse (CSS, betyder CSS: 119 måneder) end MIBC patienter (gennemsnitlig CSS: 43 måneder log rank, p 0,001). Disse resultater viste, at vores serie afspejlede det naturlige forløb af sygdom og fremhævede den betydeligt lavere CSS af MIBC forhold til NMIBC sager. Derfor blev særlig interesse sat i identifikationen af ​​biomarkører for sent stadium sygdom baseret på en sammenligning mellem NMIBC og MIBC.

Kaplan-Meier analyse viser CSS af NMIBC (Ta og T1) og s af MIBC (T2 , T3 og T4). Sammenligning udføres ved log-rank test (p 0,001); + censureret NMIBC patienter; ⧫ censureret MIBC patienter.

Tn og STN antigen udtryk i blærekræft

Tn-antigenet blev observeret hos ca. 10% af NMBC og MIBC (tabel 2) og dens udtryk var residual , ikke overstiger 5% af tumorområdet og uden defineret mønster. På den anden side blev STN antigen påvises hos ca. 60% af de undersøgte blæretumorer, hvilket er i overensstemmelse med vores tidligere resultater [5]. Antigenet blev overvejende udtrykkes ved cellemembranen, skønt også kunne observeres cytoplasmatisk farvning. STN antigen præsenteret en fokal udtryk, der ikke overstiger 30% af tumorområdet for størstedelen af ​​de positive tilfælde, uanset deres histologisk oprindelse. STN blev hovedsageligt udtrykt af dedifferentierede celler i tumorer, der viser

lamina propria

(T1, 60%) og

muscularis propria

(≥ T2, ca. 60-90%) invasion; omvendt procentdelen af ​​positive Ta var lavere end 30% (

s Restaurant 0,001, Fig 3A). Selv uden statistisk signifikans, i Ta-tumorer STN positive celler var hovedsageligt til stede i overfladiske tumor lag væk fra skibene. Omvendt blev STN positive celler i T1 tumorer (Fig 3B) observerede ledsagende og /eller invadere det basale lag (Fig 3B), medens i MIBC disse celler var for det meste fundet i invasionen fronter (Fig 3b) og invaderende og /eller inde i fartøjer, der tyder på en rolle i formidlingen invasion og sygdom. Styrkelse disse observationer, tilstedeværelsen af ​​stn antigen var statistisk højere i MIBC forhold til NMIBC (

s

= 0,001, tabel 3).

(A) Fordeling af STN negative og positive tumorer sammen de forskellige stadier af blærekræft; (B) Repræsentative billeder af stn farvning i NMIBC og MIBC. Venstre-NMIBC viser en overvægt af STN-positive celler i de overfladiske lag, væk fra fibrovaskulær støtte; Bemærk fartøjer uden positive celler. Højre-MIBC viser invasionen front med stn positivt farvede celler; Bemærk positive STN urothelial celler i karrene (pil), hvilket tyder på mulige involvering i metastase.

PI3K /Akt /mTOR pathway i blærekræft

Evalueringen af ​​PI3K /Akt /mTOR /S6 vej blev gjort ved hjælp af antistoffer for aktive phosphorylerede former af Akt (Pakt), mTOR (pmTOR), og S6 (PS6). PTEN, der har en negativ regulerer Akt signalering, blev også evalueret.

Pakt blev fundet både i cytoplasmaet og kernen. I NMIBC tilfælde blev der observeret flere områder med forskellig intensitet udtryk (figur 4A), der angiver en heterogen mønster, der ikke var tydelig i MIBC (Fig 4B). Endvidere stromale celler af MIBC positive tilfælde udviste forbedret farvningsintensitet hovedsagelig i områderne tæt på tumoren. pmTOR immunoreaktivitet var cytoplasmatisk og i lejlighedsvise tilfælde, kernekraft. I urothelium med tilsyneladende normal histologi pmTOR udtryk var begrænset til overfladiske cellelag. I NMIBC pmTOR ekspression var jævnt fordelt over de adskillige lag af urothelial celler, selv om der var en mere intens farvning i de overfladiske lag (Fig 4C). Desuden blev flere områder med variabel farvningsintensitet observeret, betegner en heterogen udtryk. I MIBC positive tilfælde, pmTOR udtryk var omdrejningspunkt og heterogen (Fig 4D). PS6 immunoreaktivitet var overvejende cytoplasmatisk. I NMIBC PS6 ekspression blev observeret i alle de overfladiske lag, både i paraply og differentierede celler (Fig 4E). Immunoreaktiviteten af ​​PS6 varierede tværs tumorcellerne. I MIBC præsenterede PS6 en diffus udtryk i hele tumoren, være mere til stede i basal og mitotiske celler (Fig 4F). Flere positive tilfælde præsenteres øget PS6 farvningsintensitet i invasionen foran samt PS6 udtryk i tumor infiltrerer lymfocytter og endothelceller.

A og B) Pakt nukleare og cytoplasmatisk udtryk i NMIBC (A) og MIBC (B) . I NMIBC tilfælde præsenterede Pakt en heterogen mønster med områder med forskellig intensitet i udtrykket. I MIBC, stromale celler især i de områder tæt på tumoren viste højere udtryk. C og D) pmTOR cytoplasmatisk ekspression i NMIBC (C) og MIBC (D). I NMIBC blev pmTOR udtryk på tværs af flere lag, selv om der var en mere intens farvning i de overfladiske dem. I MIBC positive tilfælde pmTOR udtryk var omdrejningspunkt. E og F) PS6 cytoplasmatisk ekspression i NMIBC (E) og MIBC (F). I NMIBC blev observeret PS6 ekspression i alle de overfladiske lag i både paraply og differentierede celler. I MIBC immunoreaktiviteten var diffus, men mere til stede i basal og mitotiske celler. PS6 ekspression var højere i invasionen foran og i tumorinfiltrerende lymfocytter og endotelceller. G og H) PTEN cytoplasmatiske og nukleare udtryk i NMIBC (G) og MIBC (H). PTEN udtryk var højere i NMIBC forhold til MIBC.

Under hensyntagen til udvidelsen af ​​farvning og dens intensitet, 62/94 (66%), 33/96 (34%) og 45/95 ( 47%) af blæretumorer blev betragtet som positive for Pakt, pmTOR og PS6 hhv. En Spearman rho test viste, at Pakt, pmTOR, PS6 udtryk signifikant sammenhængende (P 0,05) uanset tumorens stadie, således i overensstemmelse med en fuldt aktiv pathway. På trods histologiske forskelle, disse markører præsenterede en ligelig fordeling mellem NMIBC og MIBC og kunne ikke være forbundet med muskel invasion (tabel 3).

På den anden side, 37/92 (40%) af tumorer blev betragtet som positive for PTEN. PTEN blev udtrykt i cytoplasmaet og kernen af ​​de samme celler imidlertid med lavere udvidelse af ekspression i MIBC (33%, Fig 4G) sammenlignet med NMIBC (83%, fig 4H). Desuden blev PTEN-negative fænotype signifikant associeret med muskel invasion (Ta og T1; p 0,001, tabel 3)., Som kan bidrage til at opretholde et aktivt PI3K /Akt /mTOR /S6 pathway i disse tilfælde

Tn, STN, PI3K /Akt /mTOR pathway og kræft-specifik overlevelse

blev brugt en Kaplan-Meier analyse for at vurdere sammenhængen mellem de adresserede biomarkører og kræft-specifikke overlevelse af patienter. Vi observerede, at patienter, der bærer STN udtrykkende tumorer havde en lavere CSS, uanset deres fase (p = 0,024, Fig 5A). Dette blev også observeret ved evaluering NMIBC alene (p = 0,020, Fig 5B). Endnu vigtigere er, blandt NMIBC, STN udtrykker T1 tumorer præsenteret lavere CSS end negative tumorer (p 0,05). Desuden multivariat Cox regressionsanalyse justeret for potentielle konfoundere, nemlig alder, køn, scene, kvalitet, gentagelse status, tilstedeværelse af samtidig CIS blev udført. Vi fandt, at STN er en uafhængig prognostisk markør for værste CSS (HR = 11,836; 95% CI: [1,063-131,7]; p = 0,044). Kontrast til STN, positive Tn, Pakt, pmTOR og PS6 tumorer viste ingen forskelle i CSS i forhold til negative læsioner, uanset deres scene. Vi har også observeret, at patienter, der huser PTEN-negative tumorer havde lavere CSS (p = 0,015, figur 6). Flere undersøgelser er nødvendige for at afgøre, om den manglende undertrykkende effekt af PTEN løbet PI3K /Akt /mTOR kan forklare disse fund

Kaplan-Meier analyse, der viser sammenhængen mellem stn og CSS i:. (A) alle undersøgte blærecancerpatienter; (B) NMIBC patienter. Sammenligning udføres ved log-rank test (A: p = 0,024; B: p = 0,020); + censureret STN negative tumorer; ⧫ censureret STN positive tumorer.

Kaplan-Meier analyse, der viser effekten i CSS af PTEN udtryk i alle undersøgte patienter blærekræft. Sammenligning udføres ved log-rank test (p = 0,013); + censureret PTEN negative tumorer; ⧫ censureret PTEN positive tumorer.

Baseret på disse observationer og har til formål at forbedre den prognostiske værdi af STN i forbindelse med sene stadie sygdom (MIBC), har vi omfattende integreret oplysningerne fra stn og PI3K /Akt /mTOR pathway biomarkører. Ifølge fig 7, indførelse af PI3K /Akt /mTOR pathway molekyler tilladt at diskriminere STN positive MIBC tumorer med værste CSS (p = 0,027). Endvidere multivariat Cox regressionsanalyse (indstillet til alder, stadium, gentagelse status, tilstedeværelse af samtidig CIS og metastase) afslørede, at tilstedeværelsen af ​​PI3K /Akt /mTOR pathway molekyler i STN + MIBC uafhængigt er associeret med ca. 6-fold risikoen for dødsfald med cancer (HR = 5,662; 95% CI: [1,093 til 29,323]; p = 0,039). Disse observationer antyder, for første gang, at kombinationen af ​​stn og mTOR pathway biomarkører kan holde potentiale til at forbedre lagdeling af avancerede fase blæretumorer; dog bekræftelse i større serier er obligatorisk

Kaplan-Meier analyse, der viser sammenhængen mellem Pakt, pmTOR og PS6 udtryk i CSS af STN positive tumorer MIBC:. Sammenligning udført af log-rank test (p = 0,027); + censurerede Pakt og pmTOR og PS6 negative tumorer; ⧫ censureret Pakt og /eller pmTOR og /eller PS6 positive tumorer.

Hæmning af PI3K /Akt /mTOR pathway i dyremodeller

BBN-inducerede mus blæretumorer efterligne histologi og molekylær karakter af menneskelige kræftformer [20,21], blev screenet for stn og PS6, downstream effektor af mTOR pathway. Vi observerede ingen stn ekspression i den sunde mus urothelium, i overensstemmelse med tidligere observationer for en sund human blære [5].