PLoS ONE: omvendt forhold mellem progesteron receptor og Myc i endometriecancer

Abstrakt

Endometriecancer, den mest almindelige gynækologiske malignitet, er et hormonelt reguleret sygdom. Reaktion på progestin terapi positivt korrelerer med hormon receptor udtryk, især progesteron receptor (PR). Men mange avancerede tumorer mister PR-ekspression. Vi har for nylig rapporteret, at effekten af ​​progestin terapi kan blive forbedret betydeligt ved at kombinere progestin med epigenetiske modulatorer, som vi udtrykket “molekylært forbedret progestin terapi.” Hvad forblev uklart var virkningsmekanismen og hvis østrogen receptor α (ERa-), princippet inducer af PR, er nødvendig for at genoprette funktionel udtryk for PR via molekylært forbedret progestin terapi. Derfor har vi modelleret avancerede endometrie tumorer, der har mistet både ERa og PR udtryk ved at generere ERa-null endometriecancer cellelinjer. CRISPR-Cas9 teknologi blev anvendt til at slette ERa på det genomiske niveau. Vore data viser, at behandling med en histondeacetylaseinhibitor (HDACi) var tilstrækkelig til at genoprette funktionel PR-ekspression, selv i celler blottet for ERa. Vores undersøgelser viste også, at HDACi behandlingsresultater i markant nedregulering af onkogen Myc. Vi konstaterede, at PR er en negativ transkriptionel regulator af Myc i endometriecancer i nærvær eller fravær af ERa, hvilket er i modsætning til studier i brystcancerceller. Først østrogen stimulation augmented PR udtryk og faldt Myc i endometriecancer cellelinjer. For det andet, endnu progesteron øget PR aktivitet afstumpet Myc mRNA og proteinekspression. Endelig overekspression af PR ved adenoviral transduktion i ERa-nul endometrial cancerceller signifikant nedsat ekspression af Myc og Myc-regulerede gener. Analyse af databasen Cancer Genome Atlas (TCGA) af endometrie tumorer identificeret en omvendt korrelation mellem PR og Myc mRNA-niveauer, med en tilsvarende negativ korrelation mellem PR og Myc nedstrøms transkriptionelle mål SRD5A1, CDK2 og CCNB1. Tilsammen udgør disse data viser en tidligere uventede omvendt forhold mellem tumor suppressor PR og onkogen Myc i endometriecancer

Henvisning:. Kavlashvili T, Jia Y, Dai D, Meng X, Thiel KW, Leslie KK, et al. (2016) omvendt forhold mellem progesteron receptor og Myc i endometriecancer. PLoS ONE 11 (2): e0148912. doi: 10,1371 /journal.pone.0148912

Redaktør: Wei Xu, University of Wisconsin – Madison, UNITED STATES

Modtaget: Januar 5, 2016 Accepteret: 24 Jan 2016; Publiceret: 9 feb 2016

Copyright: © 2016 Kavlashvili et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af American Cancer Society Institutional Research Grant (SY) og NIH R01CA99908 og R01CA184101 (KKL), Institut for Obstetrik og Gynækologi Research Development Fund (KKL). De finansieringskilder ikke spillede en rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Donghai Dai, og Kristina W. Thiel er medstiftere af Immortagen, LLC, som ikke har nogen virksomhedernes rolle i de igangværende undersøgelser. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Alle andre forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.

Introduktion

Uterin endometriecancer er den mest almindelige gynækologi malignitet. Over 52.000 tilfælde diagnosticeres hvert år, og amerikanske kvinder har en levetid risiko for 01:11 [1]. Den endometrium er udsøgt følsom over for steroidhormoner. Østrogen virker gennem østrogenreceptoren (ER: ERa og ERp), driver proliferation, mens progesteron virker gennem progesteronreceptoren (PR: PRA og PRB) for at modvirke disse virkninger ved at inducere differentiering, fremme apoptose og inhibering af invasion [2]. Baseret på rollen af ​​progesteron som en tumorsuppressor i endometriet, har progestinbaseret hormonterapi blevet anvendt til behandling endometriehyperplasi og endometriecancer i mere end 60 år [3]. Imidlertid har hormonbehandling typisk været en succes kun i tumorer, hvor hormonreceptorer udtrykkes. Vores gruppe og andre grupper har rapporteret, at ekspressionen af ​​PR positivt korrelerer med en gunstig prognose og reaktion på progestin behandling [3,4], mens tab af PR udtryk ligger til grund behandlingssvigt. Dette begrænser effekten af ​​hormonbehandling i fremskreden sygdom, hvor receptorer tabt.

I vores nyligt offentliggjort undersøgelse, vi leverer overbevisende dokumentation for, at det er muligt at konvertere et PR-negativ kræft i en PR-positive kræft ved hjælp af epigenetiske modulatorer [5]. Denne tilgang øger følsomheden over for progestin terapi i tumorer med lave niveauer af PR og inducerer progestin følsomhed i tumorer, der var aldrig lydhør. Vi foreslår, at effekten af ​​progestin terapi kan blive forbedret betydeligt ved at kombinere det med epigenetiske modulatorer, som vi udtrykket “molekylært forbedret progestin terapi.”

For at undersøge, om dette molekylært forbedret progestin terapi kan anvendes til avanceret endometriecancer patienter med ERa- og PR-negative tumorer; vi genereret ERa null endometriske cancercellelinier ved at anvende nye CRISPR-Cas9 teknologi til at slette ERa på det genomiske niveau (ESR1). Vore data viser, at behandling med en HDACi er tilstrækkelig til at genoprette funktionel PR-ekspression, selv i celler blottet for ERa.

Vores undersøgelser afslørede også en hidtil uforudset omvendt korrelation mellem PR og onkogenet Myc i endometriecancer, hvilket antyder, at HDACi behandling tilvejebringer en yderligere fordel ved Myc nedregulering. Vi rapporterer en grundig analyse af denne korrelation og hypotesen, at tabet af myc ligger til grund for differentierende virkninger af progestin terapi.

Materialer og metoder

Antistoffer og reagenser

estradiol ( # E2257) og progesteron (# P6149) blev opnået fra Sigma-Aldrich og resuspenderet i ethanol. Panobinostat (LBH589) blev købt fra Selleck Chemicals og resuspenderes i DMSO. Antistoffer mod PRA /B (# 3153), PRB (# 3157), FOXO1 (# 2880) og Myc (# 13987) var fra Cell Signaling. HSP90 antistof (ADI-SPA-835) var fra Enzo. ERa antistof (sc-8002) var fra Santa Cruz. β-actin antistof (# A1978) blev opnået fra Sigma Aldrich.

cellelinjer og Cell Culture

ECC-1 endometriecancer celler blev købt fra ATCC og dyrket i henhold til de anbefalede retningslinjer. Ishikawa H endometrisk cancerceller [6] (gave fra Dr. Erlio Gurpide, New York University) blev dyrket i DMEM-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS regelmæssig, r-FBS) eller trækul-strippet FBS (cs-FBS, life Technologies, # 12676-011) og penicillin-streptomycin (Gibco). Før tilsætning af progesteron (P4) til celler, cellevækst medier med 10% FBS blev erstattet med vækstmedium indeholdende 5% trækul-strippet serum for at fjerne steroider fra FBS.

Frembringelse af ERa Knockout Cells

Genomiske deletioner af ERa (ESR1) blev skabt i ECC1 celler under anvendelse af tre par kimære enkelt guide RNA’er (sgRNAs) som tidligere beskrevet [7]. Kort fortalt blev sgRNA oligoer (S1 Table) syntetiseret og klonet i lentiCRISPR transfer plasmid til virusproduktion. Virale vektorer blev fremstillet i HEK293T celler, efterfulgt af infektion af ECC1 celler som beskrevet [7]. ECC1-ESR1 CRISPR knockout (KO) celler blev selekteret med 2 ug /ml puromycin efter 48 timers transduktion. ECC1-ESR1 CRISPR KO-celler blev dyrket ved lav densitet i 2 uger for at vælge kloner. ERa ekspression blev bestemt ved Western blotting for at identificere kloner med ingen eller lav ERa proteinekspression. ECC1-ESR1 CRISPR KO kloner blev opretholdt i medier suppleret med 5 ug /ml puromycin.

Adenoviral ekspression af PR

ECC1-ESR1 CRISPR KO-klon 1-12 og 2-12 blev inficeret med adenovirale vektorer, der koder PRA, PRB, eller PRA /B eller en tom vektor kontrol (Adcontrol) under anvendelse af en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10 virale partikler per celle som beskrevet tidligere [8]. En MOI på 10 viruspartikler per celle blev ansat til at få PR ekspressionsniveauerne nogenlunde svarer til den sene proliferative fase af menstruationscyklus.

Real-Time PCR

Total RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler ved hjælp af Mirvana miRNA Isolation kit (Ambion, Life Technologies). RNA udbytte og renhed blev vurderet ved hjælp af en NanoDrop Model 1000 spektrofotometer (Thermo Scientific). Totalt RNA (500 ng) blev oligo-dT revers transkriberet med SuperScript III (Invitrogen, Life Technologies). Real-time PCR blev udført tre gange på et Applied Biosystems Model 7900 Genetic Analyzer under standardbetingelser. Primersekvenser er opført i S1 tabel. Resultater blev kvantificeret ved anvendelse af sammenlignende tærskelcyklus (ΔΔCt) -metoden [9]. Data blev normaliseret til 18S rRNA.

Western Blotting

Efter behandling blev cellerne solubiliseret i koldt NP-40 cellelyse-buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris /HCl, pH 7,4, 1 % NP-40 med en protease og phosphatase inhibitor cocktail fra Pierce) og derefter sonikeret til frigivelse kerneproteiner. Lysater blev analyseret ved Western blotting med specifikke primære og HRP-konjugerede sekundære antistoffer. Til påvisning af PR protein, en kombination af PRA /B og PRB antistoffer ved en 1: 1000 fortynding hver blev brugt

TCGA dataanalyse

Patientinformation blev hentet fra The Cancer Genome Atlas. data Portal (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) vedligeholdt af National Cancer Institute og National human Genome Research Institute. Genekspression blev analyseret på grundlag af RNASeq gennemført på Illumina platform og blev hentet fra NCI Cancer Genomics Hub (https://cghub.ucsc.edu/). Den beregnede ekspression var for alle læser tilpasning til et bestemt gen per prøve. Der var i alt 379 livmoderkræft berettiget til genekspression analyse. Patienterne blev inddelt i fire grupper: endometrioide endometrie karcinom klasse 1, klasse 2, klasse 3 og serøs grad 3, som omfatter sager, der er udpeget som høj kvalitet og blandet histologi typen

Statistisk analyse

Students t. -test blev brugt til sammenligninger af to grupper. For TCGA dataanalyse blev statistisk analyse og data plotte udført med R Studio, og korrelationsanalyse blev udført med Spearman metode. Statistisk signifikans blev indgået med p-værdi 0.05.

Resultater

Modeling Tab af ERa i endometriecancer Celler

For at efterligne mere avanceret endometriecancer, der er forbundet med tab af ERa og PR, vi anvendte CRISPR-Cas9 teknologi til at slette ERa på det genomiske niveau (ESR1) i ERα- og PR-positive ECC1 endometriecancer-celler under anvendelse af tre forskellige sgRNA sekvenser [7]. Disse celler betegnes som ECC1-ESR1 CRISPR knockout (KO) celler. Vi næste valgte individuelle kloner fra celler transficeret med hver af de tre sgRNAs. Vi bekræftede, at størstedelen af ​​kloner havde fuldstændig deletion af ERa på proteinniveauet, selvom klon 3-5 havde et lavt niveau af resterende ERa sammenlignet med parentale ECC1 celler (Fig 1). I overensstemmelse med ERa som princippet inducer af PR-ekspression, tab af ERa resulterede i tab af PR samt en reduktion i PR målgenet FOXO1 (figur 1).

Brug CRISPR-Cas9 teknologi, ERa blev stille på det genomiske niveau i ECC1 celler. Ishikawa, forældrenes ECC1 celler og individuelle ESR1 KO ECC1 kloner blev behandlet med 20 nM LBH589 i 24 timer. Ekspression af ERa, PR, FOXO1, og Myc blev evalueret ved Western blotting. β-actin tjener som en belastning kontrol.

HDAC-hæmmer Gendanner PR Expression i ECC1-ESR1 CRISPR KO endometriecancer Cells Lines

Vi næste spurgte, om ERa udtryk er nødvendig for HDACi- medieret induktion af PR, som vi tidligere rapporteret som en mekanisme til at genoprette følsomhed over for progestin-baseret behandling [5,10]. I alle ECC1-ESR1 CRISPR KO-kloner, behandling med den pan-HDAC inhibitor LBH589 (panobinostat, Novartis) væsentligt forøget PR proteinekspression og aktivitet som bestemt ved ekspression af PR målgenet, FOXO1 (figur 1). Bemærk, at celler blev holdt i serum, der indeholder progesteron. Som kontrol vi undersøgte også PR-niveauer i forældrenes ECC1 celler og Ishikawa celler, som har beskedne baseline PR udtryk. I overensstemmelse med vores tidligere undersøgelser [5,10], LBH589 forfremmet robust PR udtryk i disse cellelinjer. Taget med vores tidligere offentliggjorte data, at kombinationen af ​​LBH589 og progesteron falder kolonidannelse med parentale Ishikawa-celler [5], antyder disse data, at selv hos patienter med tab af både ERa og PR, kan det være muligt at opnå følsomhed over for progestinterapi med en epigenetisk modulator.

HDAC-hæmmer undertrykker Oncogene Myc Expression i endometriecancer Cells

som kontrol vi også vurderet udtryk for onkogen Myc baseret på flere rapporter om, at ERa og PR fremme transskription af myc i brystcancer [11-13]. Uventet udtryk for Myc var uændret i ubehandlede ECC1-ESR1 CRISPR KO celler trods tab af ERa og PR-udtryk. Imidlertid HDACi behandling, ud over at inducere PR som beskrevet ovenfor, fuldstændigt undertrykt Myc proteinekspression. Vi observerede også et fald i Myc og en opregulering af PR i de parentale ECC1 celler såvel som anden endometriecancer cellelinje, Ishikawa, efter behandling med LBH589. Disse data identificerer et omvendt forhold mellem Myc og PR i endometriecancer-celler.

Vi udnyttet også højere koncentrationer af LBH589 at bestemme, om Myc niveauer kunne yderligere undertrykt. I både forældre- og ECC1-

ESR1

CRISPR KO endometrial cancerceller, PR niveauer blev gradvist forhøjet som reaktion på stigende koncentrationer af LBH589, med en tilsvarende dosis-afhængigt fald i Myc-ekspression (figur 2). Disse resultater bekræfter vores observation af den inverse korrelation mellem PR og Myc udtryk i figur 1 og foreslå, at højere koncentrationer af LBH589 kan være nødvendigt for at genoprette PR niveauer i tumorer med langsigtet tab af hormon receptor udtryk.

Celler blev behandlet med angivne koncentrationer af LBH589 i 24 timer og proteinekspression analyseret ved Western blotting. β-actin tjener som en belastning kontrol.

Østrogen Stimulation Øger PR og Mindsker Myc Expression i endometriecancer cellelinier

Den inverse korrelation mellem PR og Myc udtryk i figurerne 1 og 2 udfordrer godt accepteret paradigme i brystkræft, PR fremmer Myc udtryk [12,14]. Vi først bekræftet, at østrogen stimulation af MCF7-celler, der indeholder endogent ERa og PR, resulterer i robust ekspression af PR og Myc, med forventede ligand-medieret ERa nedregulering (S1 Fig). Tilsætning af progesteron yderligere øget Myc niveauer, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [12,14]. Derimod østrogenstimulering for endometriecancer-celler med endogen ERa ekspression induceret PR-ekspression, med en samtidig reduktion (Ishikawa-celler) eller ingen yderligere stigning (ECC1 celler) i Myc proteinniveauer (Fig 3).

Ishikawa og ECC1 celler blev behandlet med 10 nM estradiol (E2) for angivne tider. PR, Myc og ERa-protein-ekspression blev målt ved Western blotting. Hsp90 tjener som lastning kontrol.

PR Negativt Regulerer Myc Expression og aktivitet i endometriecancer Cell

For at undersøge om PR formidler Myc nedregulering i endometrie kræftceller, vi behandlede Ishikawa celler, som har lav baseline ERa og PR niveauer (Fig 3), med LBH589 i fravær eller tilstedeværelse af progesteron til 0-72 timer. Eksperimenter blev udført i kul-strippet serum for at fjerne hormoner. Behandling med progesteron produceret en tidsafhængig formindskelse i Myc proteinniveauer, og tilføjelsen af ​​HDACi styrker denne effekt (Fig 4A). Vi vurderede også Myc transkriptionsaktivitet ved at undersøge mRNA-niveauer af Myc målgener. I overensstemmelse med Western blot-data, blev mRNA-niveauer af Myc faldt med mere end 90% efter behandling med LBH589, og tilsætning af progesteron resulterede i et yderligere fald (fig 4B). Myc målgener CDK4, CAD, SRD5A1 og HES1 blev undertrykt i afhængighed LBH589 + progesteron (fig 4B).

(A) Ishikawa-celler blev behandlet med 20 nM LBH589, 100 nM progesteron (P4) eller kombination i de angivne tidsrum. PR og Myc-protein-ekspression blev målt ved Western blotting. β-actin tjener som en loading kontrol. (B) Ekspression af Myc og dens downstream gener (CDK4, CAD, SRD5A1 og HES1) blev analyseret ved QRT-PCR i Ishikawa-celler blev behandlet med 20 nM LBH589 – /+ 100 nM P4 i 4 eller 24 timer. Data blev normaliseret til 18S og beregnet som den fold ændring i forhold til kontrol. * P 0,05 vs. kontrol.

For at undersøge om PR formidler Myc nedregulering i ERa-nul endometriecancer celler, blev molekylært forbedret progestin terapi anvendes i ECC1-

ESR1

CRISPR KO celler. I overensstemmelse med figur 4, blev der opnået lignende resultater i ERa-nul cancerceller (figur 5). Specifikt behandling med LBH589 forøget ekspression af PR og nedsat ekspression af Myc og dens downstream transkriptionelle mål, CDK4 og CAD. Denne virkning blev amplificeret ved tilsætning af progesteron (fig 5A). Dette tab af Myc udtryk blev bekræftet på proteinniveau (figur 5B).

(A) ECC1-

ESR1

CRISPR KO-klon 1-12 blev behandlet med 100 nM P4 i 16 timer, 20 nM LBH589 i 24 timer, eller kombinationen, efterfulgt af analyse af PR, Myc, og PR målgener ved QRT-PCR. Data blev normaliseret til 18S og beregnet som den fold ændring i forhold til kontrol. Resultaterne er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter; * P 0,05 over DMSO; # P 0,05 over LBH589. (B) ECC1-

ESR1

CRISPR KO kloner blev behandlet som i (A), efterfulgt af analyse af PR og Myc proteinniveauer ved Western blotting. β-actin tjener som en belastning kontrol.

For at give yderligere bevis for sammenhængen mellem PR og Myc nedregulering, vi overudtrykt PRA og PRB i ECC1-

ESR1

CRISPR KO-klon 1 -12. Vi først bekræftet, at eksogen udtryk for PRA eller PRB af adenovirale transduktion fører til robust overekspression af PR og også induktion af PR nedstrøms gen AREG (figur 6). Overekspression af PR resulterede i Myc nedregulering, og tilsætning af progesteron faldt yderligere mRNA-niveauer af Myc og Myc målgenet, HES1 (figur 6). Disse data understøtter vores hypotese om, at PR negativt regulerer Myc udtryk i endometriecancer.

ECC1-

ESR1

CRISPR KO-klon 1-12 blev transduceret med kontrol adenovirus (Adcontrol) eller adenovirus indeholder PRA, PRB eller PRA + PRB i 24 timer, efterfulgt af 100 nM P4 i yderligere 24 timer. mRNA-niveauer blev kvantificeret ved QRT-PCR, normaliseret til 18S, og data udtrykkes som fold ændring i forhold til Adcontrol i fravær af P4. Resultaterne er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter; * P 0,05 over Adcontrol; # P 0,05 vs.-P4 i samme gruppe.

Inverter Sammenhæng mellem PR og Myc i Endometriale Patient tumorer

At undersøge, om der er en omvendt korrelation mellem PR og Myc udtryk i endometrie kræft patientprøver, analyserede vi RNA-Seq data fra 379 endometrie tumorer i TCGA datasættet. Vi observerede en progressiv nedgang i PGR og ESR1 mRNA-ekspression fra endometrioide livmoderkræft til mere aggressive serøse tumorer som defineret ved grade niveau (Fig 7A). Tværtimod blev Myc mRNA-ekspression steget betydeligt i høj kvalitet tumorer i forhold til lavere karakterer. Den Spearman korrelation metode bekræftede, at korrelationer af PGR med Myc og ESR1 med Myc er signifikante (Fig 7B og 7C).

(A) Boxplot af mRNA ekspressionen af ​​PGR (venstre panel), ESR1 (midterste panel) og Myc (højre panel) blev analyseret i henhold til endometriecancer klasse i 379 endometriecancer patient tumorer fra TCGA database. Patienterne blev inddelt i fire grupper: endometrioide type I klasse 1 (G1, n = 86), grad 2 (G2, n = 103), grad 3 (G3, n = 123) og serøs type II grad 3 (G3, n = 67). (B) Parvis korrelationsanalyse af PGR, ESR1 og Myc mRNA niveauer ved hjælp af Spearman-metoden. Korrelationskoefficienterne og p-værdier er vist. (C) Scatterplot at vise den negative korrelation i ekspression af to gener. Patienterne blev afbildet på x-aksen efter stigende ekspression af et specifikt gen. To regressionslinjer blev fremstillet ved simpel lineær regressionsanalyse baseret på ekspressionen af ​​respektive gener. Venstre: Ekspression af Myc (rød) mod PGR (sort); højre:. ekspressionen af ​​Myc (rød) mod ESR1 (sort)

For yderligere at validere den inverse korrelation mellem PR og Myc i patientprøver, vi undersøgt, hvordan PR korreleret med Myc nedstrøms gener SRD5A1, CCNB1 og CDK2. Den Spearman korrelation metode viste en stærk negativ korrelation af PGR med SRD5A1, CCNB1 og CDK2 udtryk (figur 8).

(A) Parvis korrelation analyse af PGR og Myc nedstrøms gener, SRD5A1, CCNB1 og CDK2 hjælp Spearman metode . Korrelationskoefficienterne og p-værdier er vist. (B-D) Scatterplots at vise den positive eller negative korrelation mellem ekspression af to gener som i fig 6C. (B) Ekspression af SRD5A1 (rød) mod PGR (sort); (C) ekspression af CCNB1 (rød) mod PGR (sort); og (D) udtryk for CDK2 (rød) mod PGR (sort).

Diskussion

Endometriecancer er et hormon reguleret kræft, hvor østrogen drev væksten og progesteron undertrykker proliferation og fører til differentiering. Reaktion på progestin-baseret behandling positivt korrelerer med hormon receptor udtryk, især progesteron receptor (PR), men mange avancerede tumorer er blottet for PR-udtryk samt ERa, den primære transkriptionelle inducer af PR. Vi har for nylig fundet, at PR-ekspression kan genoprettes ved HDACi. Heri vi udvide disse resultater ved at rapportere, at PR-udtryk kan genoprettes i endometrie kræftceller, selv dem uden ERa. Disse data er kritiske, fordi de antyder, at selv i patienter med tab af både ERa og PR, kan det være muligt at genskabe følsomhed for progestin gennem kombinationsbehandling med et epigenetisk modulator. Overraskende fandt vi også, at onkogenet Myc, som vides at blive induceret af ERa og PR i brystcancerceller, blev markant undertrykt af HDACi behandling, herunder i celler, som mangler ERa. Desuden eksogen udtryk for PR af adenovirus fremmet Myc nedregulering, hvilket giver yderligere beviser for, at PR negativt regulerer Myc udtryk. I overensstemmelse med observationerne i kræftceller, fandt vi, at PR og Myc omvendt er korreleret i endometrie tumorer i TCGA datasæt. Vi hypotesen, at tab af Myc ligger til grund for differentierende virkninger af progestin terapi i endometriecancer.

Myc er en velkarakteriseret onkogen, der spiller en stor rolle i patogenesen af ​​mange cancere [15,16]. Ligesom andre typer kræft, er Myc stærkt udtrykt i endometrie tumorer [17]. Studier i transgene musemodeller afslører, at Myc inaktivering resulterer i hurtig tumorregression og ofte forbundet med kendetegnende for cellulær differentiering og apoptose [18,19]. Trods klare beviser for den meget onkogene rolle Myc i mange tumortyper, herunder endometriecancer, har en specifik lille molekyle hæmmer af Myc været undvigende [20]. Aktuelle udviklingsstrategier stof omfatter målrettet veje opstrøms eller nedstrøms for Myc, såsom bromodomain og ekstra-terminal motiv (BET) hæmmer. Faktisk hæmning af BET i myelomatose resulterer i bemærkelsesværdige nedregulering af Myc udtryk og tilhørende celledød [16]. Heri vi identificere en anden potentiel mekanisme til stumpe onkogene virkninger af Myc: PR-medieret suppression af Myc transkription. Derfor molekylært forstærket progestinterapi ikke kun forbedrer følsomhed over for progestin ved at genoprette funktionel PR-ekspression [5,10], men giver også en yderligere fordel ved at nedregulere Myc.

Andre har vist, at Myc ekspression reguleres gennem epigenetiske mekanismer . For eksempel har HDACi-medieret repression af Myc udtryk også rapporteret i hoved og hals pladecellekræft cellelinjer [21]. Den potentielle mekanisme er opregulering af

MXI1

SSB2

, som inhiberer den transskriptionelle aktivitet af Myc [21]. Men vore data tyder, at mekanismen for Myc undertrykkelse er gennem PR. Først, behandling med progesteron i kombination med HDACi produceret et yderligere fald i Myc sammenlignet med HDACi alene. For det andet, overekspression af PRA /B af adenovirus i ECC1-

ESR1

CRISPR KO celler væsentligt reduceret Myc udtryk i mangel af en HDACi, indikerer en PR-medieret effekt snarere end en generel epigenetisk effekt.

Flere rapporter i brystkræft viser, at ERa og PR fremme transskription af Myc gennem binding af østrogen respons element (ERE) og progesteron respons element (PRE) i Myc promoter region [11,13,22,23]. Den tidligste rapport fra en PRE i Myc promotor-regionen i T47D brystkræftceller blev offentliggjort i 1997 [14]. Den iagttagelse, at ERa og PR inducerer Myc ekspression er konsistent med det fænomen, at progestiner anvendes i prævention narkotika fremme brystkræft vækst

in vitro

in vivo

[24-26]. Her rapporterer vi det omvendte effekt i endometriecancer, hvor ekspression af Myc omvendt korreleret med ERa og PR, både i endometriecancer cellelinjer og i tumorer fra TCGA database. Kontrolforsøg i MCF7 brystcancerceller bekræfter den positive korrelation af Myc med ERa og PR i denne celletype. Således kan den negative regulering af Myc ved PR i endometriecancer give en forklaring på de modsatrettede effekter af progesteron på spredning i bryst vs endometriecancer.

Sammenfattende fandt vi, at HDACi behandling af endometriecancer celler giver den dobbelte fordele ved at opregulere tumor suppressor PR og nedregulering onkogenet Myc. Desværre har enkeltstof HDACi begrænset klinisk effekt i solide tumorer, og nye undersøgelser udforsker brugen af ​​HDACi til “prime” tumorer til andre behandlinger [27, 28]. Baseret på vores omfattende undersøgelser af mekanismer PR tavshed i endometriecancer, foreslår vi, at HDACi kan bruges til at prime endometrie tumorer for lydhørhed over for progestin-baseret behandling, som vi kalder molekylemæssigt forbedret progestin terapi via epigenetisk modulation. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at forstå, hvis kombination af en HDACi med progestin vil genoprette PR, nedregulerer Myc, og føre til sygdom ledelse. Et første skridt kan være at udforske denne kombinatorisk strategi i neoadjuverende indstilling, hvilket vil give mulighed for at undersøge PR og Myc niveauer i forbehandling biopsier og efter behandlingen kirurgiske prøver opnået på tidspunktet for tumor cytoreduktion. En anden terapeutisk mulighed er i fastsættelsen af ​​fremskreden eller tilbagevendende endometriecancer, hvor størstedelen af ​​endometrie tumorer har mistet udtryk for PR. Ved at integrere de epigenetiske behandlingsformer i hormonelle regimer, kan det være muligt at forbedre resultater for endometriecancer, en sygdom, der er stigende.

Støtte Information

S1 Fig. E2 stimulation inducere PR og Myc ekspression i MCF7 brystcancerceller.

MCF7-celler blev dyrket i trækul strippet serum og behandlet med 10 nM Estroadiol (E2) som angivet tidspunkt. PR og ERa-protein-ekspression blev målt ved Western blotting. β-actin tjener som lastning kontrol

doi:. 10,1371 /journal.pone.0148912.s001

(TIF)

S1 Table. ESR1 sgRNA sekvens og primere til real-time PCR

doi:. 10,1371 /journal.pone.0148912.s002

(DOCX)