PLoS ONE: De CD44high Tumordannende Undergrupper i lungekræft Biospecimens er beriget for Low miR-34a Expression

Abstrakt

Cellular heterogenitet er en integreret del af udviklingen af ​​kræft og progression. Progression kan være forbundet med fremkomsten af ​​celler, der udviser høj fænotypisk plasticitet (herunder “de-differentiering” til primitive udviklingsmæssige tilstande), og aggressive adfærd egenskaber (herunder højt tumorigene potentiale). Vi observerede, at mange biomarkører, der anvendes til at identificere cancerstamceller (CSC) kan mærke celleundergrupper i et avanceret kliniske stadium lungekræft (maligne pleurale effusioner, eller MPE). Således kan CSC-biomarkører være nyttige for levende sortering funktionelt forskellige celle-undergrupper fra individuelle tumorer, som kan gøre det muligt for forskere at slibe på den molekylære basis for funktionel heterogenitet. Vi viser, at CD44

hi (CD44-high) cancercellelinier delmængder vise højere klonal, kolonidannende potentiale end CD44

lo celler (n = 3) og er også tumorigene (n = 2/2), når transplanteret i mus xenograftmodel. De CD44

hi delmængder udtrykker forskellige niveauer af embryonal (de-differentiering) markører eller kromatin regulatorer. I arkiverede lungekræft væv, ALDH markører co-lokalisere mere med CD44 i pladecellekræft (n = 5/7) end Adeno Carcinoma (n = 1/12). MPE cancerceller og en lungekræft cellelinje (NCI-H-2122) udviser kromosomafvigelser og 1p36 sletning (n = 3/3). Da MIR-34a kort til 1p36 deletion site, blev detekteret lave MIR-34a ekspressionsniveauer i disse celler. Den kolonidannende effektivitet CD44

hi celler, karakteristisk egenskab ved CSC, kan inhiberes ved mir-34a udskiftning i disse prøver. Derudover den meget tumorgene CD44

hi celler er beriget for celler i G2 fase af cellecyklus

Henvisning:. Basak SK, Veena MS, Oh S, Lai C, Vangala S, Elashoff D, et al. (2013) Den CD44

høje Tumordannende Undergrupper i lungekræft Biospecimens er beriget for Low miR-34a Expression. PLoS ONE 8 (9): e73195. doi: 10,1371 /journal.pone.0073195

Redaktør: Mauricio Rojas, University of Pittsburgh, USA

Modtaget: Maj 2, 2013; Accepteret: 16. juli 2013; Udgivet: 3. september, 2013 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Department of Medicine, UCLA og Robert W. Green, hoved og hals Kirurgisk Oncology Program på UCLA. Tilskuddene midler blev anvendt til reagenser og støtte af de involverede i undersøgelsen forskere løn. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tumor heterogenitet kan være. kendetegnet ved differentiel ekspression af celleoverflademarkører, genetiske og epigenetiske forskelle og /eller forskelle i vigtige signalmolekyler eller effektorer af cellefunktion. Cellular heterogenitet kan karakteriseres ved forskelle i de funktionelle (adfærdsmæssige) egenskaber celler (clonogenicity, kolonidannelse evne i blød agar, tumorigenese etc.). Mens mange undersøgelser har valgt at associere celleoverflademarkører i tumorceller findes på den primære tumor site med CSC-adfærdsmæssige egenskaber, vi observeret, at klinisk fremskredne stadier især er beriget til celle delmængder bærer CSC-biomarkører. Således har vi postuleret, at fremskreden sygdommen ikke forbyder (og kan være en fordel) for at knytte specifikke biomarkører med funktionelle fænotyper. Derfor vores tilgang til biologisk opdagelse fremhæver udforme passende funktionelle bioassays til at karakterisere både celle fænotyper og molekylærbiologi underliggende tumor initiering, samt tumor progression.

Lungekræft er den hyppigste årsag til dødelighed af kræft i både mænd og kvinder; med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for 80-85% af tilfældene [1]. For at forstå biologien bag denne høje dødelighed, har vi udvalgt et fremskredent stadium sygdomsmodel (MPE). Lungekræft patienter med MPE har signifikant højere dødelighed end dem uden MPE, eller dem, der har cytologisk negative udgydelser [2] – [4]. Således er den MPE-tumorbelastning gennemsyret biologiske egenskaber, der forringer overlevelse af cancerpatienter. Vigtigt er det, er den maksimalt tilladelige fejl hovedparten tumor befolkning består af heterogene subpopulationer [5]. I del, kan denne heterogenitet være præget af biomarkører typisk er forbundet med funktioner i CSC (CD44, ALDH, cMET, CD166, MDR-1, uPAR, PTEN, OCT-4, BMI-1, hTERT, SUZ12, EZH2).

et formål med den foreliggende undersøgelse var at bestemme, om vi kunne identificere en tumorcelle delmængde, der viste et forøget kompetence for tumor formering og vedligeholdelse, og til at begynde at karakterisere de molekylære basis for disse egenskaber. Vi først studerede CD44 som en markering markør for celler forudsiges at have høj tumorigent potentiale, fordi den tidligere har identificeret CSC i forskellige epiteliale kræftformer, herunder bryst- [6], hoved og hals, [7], [8], pancreas [9], [10], og prostata maligniteter [11] – [15]. CD44 udtrykkes kraftigt i forskellige lungecancer-undertyper, [16], og dets ekspression er relateret til dårlig prognose hos patienter [17]. Nylige undersøgelser i NSCLC cellelinjer også karakterisere CD44

hi celler som CSC [16].

MPE-primære kulturer indeholder en subpopulation af celler, der stærkt udtrykker CD44 (CD44

hi). Når disse celler er sorteret fra de MPE-primære kulturer, de udviser høj tumorigent potentiale, herunder transplantation af tumorer i NOD /SCID IL2γR

null mus i begrænsende fortyndinger af celle transplantationer. Disse egenskaber er karakteristiske for CSC. Fraktioner af CD44

hi celler er forbundet med en forhøjet ekspression af en anden CSC-markør forbundet med xenobiotisk metabolisme, ALDH. Den CD44

hi /ALDH

hi fænotype er tydeligt i både planocellulært (SCC) og adenocarcinom (AC) i lungerne, hvilket tyder på, at lignende markør profiler kan mærke adfærdsmæssigt aggressive (yderst tumorigene) celle fraktioner på tværs af forskellige ” slægter “(histopatologiske undertyper) af lungekræft [18].

MPE tumorer almindeligvis vise hyperploidy og kromosomafvigelser. FISH-analyse fundet en fælles specifik abnormitet i 1p36 region, hvilket tyder på, at denne region kan spille en vigtig rolle ved at bidrage til aggressive adfærdsmæssige egenskaber. Den 1p36 region er tidligere blevet identificeret til at indeholde locus, som koder for tumor suppressor microRNA (MIR-34a). Tab af miR-34a udtryk er impliceret i kræft progression [15], [19]; dette studie føjer til dette bevis. Meget tumorigene CD44

hi celler udtrykker lave miR-34a, og miR-34a udskiftning hæmmer kolonidannelse af CD44

hi celler i blød agar. Cellen cyklus analyse af CD44

hi celler viste, at disse meget tumorigene celler bor i G2 fase af cellecyklus.

Materialer og metoder

malignt pleural effusion (MPE) Indsamling, forarbejdning og Cell Culture

Alle emner i undersøgelsen gennemgik skriftligt informeret samtykke ved en proces, der er godkendt af den institutionelle review board (IRB) ved Veterans Affairs-Greater Los Angeles Healthcare System (VAGLAHS) og undersøgelsen blev godkendt af IRB -VAGLAHS. MPE prøver (M-1, M-2 og M-3) blev opsamlet fra patienter på Veterans Affairs-Greater Los Angeles Healthcare System (VAGLAHS). Celler dyrkes i nærvær af 20-30% MPE (primær dyrkningsmedium eller PCM) som tidligere beskrevet [5]. (Støtte Information S1 og S2).

Kontrol etablerede cellelinier

To etablerede cellelinier GM 05.399 (normal fibroblast) og H2122 (lungekræft) blev anvendt i undersøgelsen. Den fibroblast cellelinje GM 05.399 blev opnået fra Coriell Institute for Medical Research (Camden, NJ). Cellelinien blev afledt fra en 1-årig kaukasisk mand. Cellelinien opretholdes i vores laboratorium i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) i nærvær af 10% føtalt bovint serum (FBS) [20]. Den H2122 lunge adenocarcinom cellelinje blev genereret af Adi Gazdar fra en ondartet pleural effusion, og erhvervet fra Ilona Linnoila og Herb Oie fra NCI. Den blev efterfølgende deponeret i ATCC (NCI-H2122 [H2122] ATCC CRL-5985 ™) [21]. Cellelinien opretholdes i vores laboratorium i RPMI-1640-medium i nærvær af 10% FBS [22], [23]. Både cellelinjer er offentligt tilgængelige

Antistoffer

Følgende antistoffer blev anvendt til flowcytometri FACS /Sortér:. Mouse anti-human IgG2b CD44-FITC, (BD Biosciences # 555.478); FITC Mouse IgG2b κ isotypekontrol, BD Biosciences # 555.742); PE-mærket muse-anti-humant CD44, (BD Pharmingen # 555.479); PE Mus Mus IgG2b κ isotypekontrol, BD Biosciences 555743. Anti-CD166-FITC (Mouse monoklonalt; IgG1 Setrotech # MCA 1926F, primær umærket anti-cMET (mus IgG2a, Abcam # 49210), anti-uPAR (muse IgG, Santa Cruz Biotech # 13522), sekundært antistof anvendes til undersøgelsen anvendte var: Goat (Fab ‘) 2 anti-mus IgG (H + L) -PE-Cy.5.5 (Caltag laboratorier # M35018)

Immunhistokemi (. IHC)

primære humane lungecancer væv (pladecellekarcinom: SCC og adenocarcinom:. AC) eller human lunge kontrolvæv (humant normalt alveolær og bronchiolær væv) blev opnået fra UCLA Patologisk Institut core Facility xenotransplantattumorer afledt af CD44

hi celler injiceret i NOD /SCID (IL2rγ

null) mus blev kirurgisk fjernet, skåret i 0,3-0,5 mm stykker og fikseret i ethanol (Fisher Scientific) eller Z-fix (Anatech, MI). for IHC blev snit 3-5 μ sektioner skåret og afparaffineres og behandlet for antigen hentning [5] og farvet for markør-ekspression. Oprindeligt vævssnit blev farvet med enkelt markør antistoffarvning (CD44 eller ALDH). Når betingelserne blev optimeret til enkelt antigenfarvning derefter den dobbelte antigenfarvning (CD44 og ALDH) af vævssnit blev opnået. Paraffin vævssnit blev deparaffineret og rehydreret. Efter antigen-genvinding (10 mM natriumcitrat, pH 6,0 ved damp 25 minutter) og blokering blev endogene peroxidaser standset (3% H

2O

2 i 1% natriumazid med PBS, 30 minutter i stuetemperatur) . Objektglas blev inkuberet med primære kanin polyklonalt antistof mod ALDH1A1 (ABCOM Inc. Cat ab51028 #), natten over ved 4 ° C. Objektglassene blev vasket med PBS og inkuberet med EnVision + System-HRP Labelled Polymer anti-kanin (Dako Cat # K4003) i 30 minutter. Objektglassene blev inkuberet i DAB (Vector peroxidasesubstrat Kit # SK-4100 med Nickel Sol) i 10-20 minutter og derefter blev glassene vasket 5 minutter 3 gange med PBS. For dobbelt farvning med CD44 (R 20 celler blev talt i slutningen af ​​10 dage kultur. Resultaterne udtrykkes som procent kloning effektivitet.

Sfæroide Formation i blød agar-analysen

Sorteret CD44

hi og CD44

lo celler blev udsået på 1000 celler /brønd i tre eksemplarer i seks-brønds dyrkningsplader indeholdende 0,35% topagar overtrukket over 0,5% baseagar (DNA Grade) indeholdende PCM. Kolonier blev talt på 3 uger efter plating, repræsenterer resultater betyder fra tre uafhængige forsøg.

tumorigenicitet i NOD /SCID (IL2rγ

null) Mus

Alle mus arbejde relateret protokol for undersøgelsen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på UCLA /VAGLAHS. CD44

hi og CD44

lo celler blev sorteret ved FACS og injiceres på forskellige celle doser (300 /mus, 3000 /mus og 30000 /mus) på højre og venstre henholdsvis NOD /SCID (IL2γ

null) mus i 100 pi saltvand. Mus blev overvåget for tumorvækst ved begge flankerne. Resultaterne er repræsenteret som gruppe gennemsnit af tumor volumen, som beskrevet [24].

miR-34a transfektion Studies

For at analysere de virkninger, som miR-34a har på kolonidannelse effektivitet i blød agar assay de CD44

høj celler blev transient transficeret med enten mIR-34a (AM17100, Applied Biosystem /Ambion) eller den negative kontrol (krypteret) oligonukleotid. Tilsvarende CD44

lo celler blev transient transficeret med enten anti-MIR-34a-inhibitor (# AM17000, Applied Biosystem /Ambion) eller negativ kontrol-anti-miR oligonukleotid (# AM17010, Applied Biosystem /Ambion). Transfektionen blev udført med CD44

hi eller CD44

lo celler under anvendelse Lipofectamin 2000 (Invitrogen) i plader med 6 brønde med 50.000 celler /brønd med 100 pmol miR, anti-miR og kontrol scrambled /oligonukleotider. Efter 2 dage af transfektion blev cellerne opsamlet og analyseret for blød agar kolonidannende effektivitet som beskrevet ovenfor.

Fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) Analyse af MPE Prøver Salg

FISH undersøgelser blev udført ifølge etableret protokol [25]. LSI 1p36 probe blev mærket med spektrum orange og LSI 1q25 probe blev mærket med spektrum grøn og hybridiseret til metafase spænd som beskrevet tidligere [25], [26]. Kort fortalt blev metafasespredninger fremstilles ved standard cytogenetiske procedurer. Mærkede prober blev hybridiseret og vaske blev udført under identiske betingelser for stringens. Objektglas blev hybridiseret ved 37 ° C natten over med 1-4 ng af proben, 50% formamid, 10% dextran, 2 x SSC, og 50 ng Cot 1-DNA til at undertrykke repetitive sekvenser. Metafasekromosomer blev modfarvet med 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i Vectashield-opløsning (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). Karyotypebestemmelse af kromosomer blev udført i overensstemmelse med etablerede protokoller.

Reverse Transcriptase- Kvantitativ PCR (RT-qPCR) Påvisning af mir-34a i MPE Prøver

Totalt RNA blev isoleret fra prøver ved hjælp TRIzol. MIR-34a blev målt ved Step One Plus Real-time PCR-system (Applied Bio-systemer, CA) ved anvendelse af Taq-Man miRNA tests (Applied Biosystems, Foster City, CA) og normaliseret ved RNU48 niveauer. 3 ul af 20 ng /ul af total RNA blev anvendt til at udføre revers transkriptase (RT) reaktion (30 min ved 16 °, 30 min ved 42 °, 5 min ved 85 grader) ved anvendelse af 10 mM dNTP’er, MultiscribeRT enzym, 10 × RT buffer, RNase inhibitor, Taqman RT-primer og vand i totalt reaktionsvolumen på 15 ul. For qPCR, 10 ul af 2 × Taqman universal PCR Master Mix (nr AmpErase UNG fra ABI), 7 ul vand, 1 ul af Taqman primer (MIR-34a og RNU48) og 2 ul for cDNA for hver reaktion blev anvendt, efter forstærkning protokol (10 min ved 95 grader, 15 sek til 95 grader, 60 sek ved 60deg til 40 cykler) ved hjælp af Step One Plus Real-time PCR-system (Applied Biosystems, CA).

Surface Marker Mærkning og Cell Cycle Analysis

Celler blev farvet med CD44-FITC og PI (propidiumiodid) til cellecyklus analyse (modificeret fra UCLA /Flow-cytometri core facilitet protokol). Kort fortalt, 1 x 10

6 enkelt cellesuspension blev vasket med PBS /2% PCM, pelleteret, og mærket med muse-anti-human IgG2b CD44-FITC-antistof (BD Biosciences # 555.478) i 45 minutter. ved stuetemperatur i mørke, blev kontrol-antistof anvendt som negativ kontrol. Prøverne blev resuspenderet i 1 ml buffer indeholdende 10 mikrogram /ml PI og 11,25 Kunitz enheder af RNase og inkuberes i mindst 30 minutter ved 4 ° C i mørke og analyseret på flowcytometeret inden for 30 min af PI-farvning .

Statistisk analyse

data er repræsenteret som middelværdi ± SD og blev analyseret med dobbeltsidet

t

test af EXCEL og gentagne foranstaltninger variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til sammenligning mellem grupper af SAS 9.3. En

P

værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

CD44 Expression Profil af MPE Afledt tumorceller

MPE-tumorceller kan isoleres. og udvidet i kortfristede primære kulturer i nærvær af MPE flydende og autologe ikke-tumorceller [5]. Heterogene populationer, herunder kandidat CSC, er til stede i MPE- tumor befolkning, som afspejles af den variable udtryk for CSC-biomarkører: c-MET, uPAR, MDR1, CD166, CD44, og ALDH. Således, i tillæg til

tumoral morfologiske heterogenitet intra, er der forskelle i overfladen CD44 intensiteter mærkning, og disse forskelle kan udnyttes til at adskille celleundergrupper [5].

De primære kulturer fra tre forskellige MPE-prøver (M-1, M-2 og M-3), indeholder morfologiske varianter (flad, oval og runde former) ved lysmikroskopi (figur 1A, B). Ved 4

th uge af kultur, de vedhængende tumorceller vise en mere homogen morfologi mønster i kultur (figur 1C). Dyrkede celler ensartet udtrykkelig CD44 i alle tre tumorprøver (Figur 1D), men mærkningen intensitet er meget varierende både mellem og inden for samme prøve. Således sammenlignet med celler mærket med sekundært antistof alene, prøverne er 96%, 99% og 98% positive for CD44; imidlertid Mean fluorescensintensiteterne (MFI’er) af CD44 mærkning er 10861, 5295 og 2120 henholdsvis. Således kan mærkningen overflade intensiteten af ​​CD44-ekspression varierer fra 2 til 5 gange blandt tumor prøver, og der er typisk en stor varians i gennemsnitlig overflade CD44 mærkning

inden

individuelle prøver.

Tumoren celler fra M-1, M-2 og M-3. (A) 100 × (2-3 uger). (B) 400 × (2-3 uger). (C) senere stadier af kultur 100 × (6-10 uger). (D) CD44- FACS ekspressionsmønster og MFI. (E) Sortering af CD44

hi og CD44

lo celler (5-10%). De sorterede celler CD44

hi og CD44

lo blev vasket og udpladet i PCM i 2-3 dage for at evaluere deres morfologiske forskelle. (F) Morfologi af sorteres CD44

hi celler og sorteret (G) CD44

lo celler var ens (100 ×). Renheden af ​​CD44

hi og CD44

lo celler ≥98%, som afsløret med post slags analyse (data ikke vist).

Fravær af Morfologiske Forskelle mellem CD44

hi og CD44

lo Celler

MPE-primære kulturer får en mere homogen morfologisk vækstmønster over tid. For at bestemme om små forskelle i kultur morfologi kunne skelne CD44

hi from CD44

lo kulturer, M-1, M-2 og M-3 prøver blev mærket med anti-CD44-antistof og sorteres ved FACS, med gates fastsat til 5% af cellerne i den høje CD44 markør og lav CD44 markør ekspression (fig. 1E). Renheden af ​​CD44

hi og CD44

lo celler ≥98%, som afsløret med post slags analyse (data ikke vist). De sorterede celler CD44

hi (figur 1F) og CD44

lo (figur 1G) blev vasket og udpladet i PCM i 2-3 dage for at evaluere deres morfologiske forskelle. Disse undersøgelser tyder på, at der ikke er nogen karakteristiske forskel i kultur morfologi forbundet med overfladen CD44 udtryk.

CD44

hi Celler Vis High Colony Forming Evne

For at undersøge, om CD44

hi celler er funktionelt forskellige fra CD44

lo celler i kolonidannende effektivitet, vi sorteret og dyrket disse delmængder fra de tre prøver (M-1, M-2 og M-3). 100-500 celler af CD44

hi eller CD44

lo-celler blev udpladet i individuelle brønde i 12-brønds plader. Selvom vi ikke er i stand til at opdage væsentlige forskelle i indledende plating effektivitet, men vi konstatere, at CD44

hi celler er mere kompetente til at danne holoclones end CD44

lo celler (

t

test og ANOVA: P 0,05) (figur 2A). Således en iboende biologisk forskel mellem CD44

hi og CD44

lo celler synes at en iboende forskellen kompetence i danner holoclones.

De sorterede celler CD44

hi og CD44

lo fra MPE prøver blev analyseret i tre eksemplarer for deres (A) klonal effektivitet (Sample M-1: kolonier CD44

hi = 35,8 (SD = 5,04) vs CD44

lo = 21,7 (SD = 6,2) (P = 0,03) ; Sample M-2 kolonier CD44

hi = 59,8 (SD = 3,2) vs CD44

lo = 40,6 (SD = 4,1) (P = 0,003), Sample M-3 kolonier CD44

hi = 53,4 ( SD = 5,3) vs CD44

lo = 33,9 (SD = 3,6) (P = 0,006)); Den gennemsnitlige effekt af CD44

hej versus CD44

lo er 17,6 (95% CI: 8,31, 26,89: p = 0,015). (B) kolonidannende evne i blød agar. (Prøve M-1: kolonier CD44

hi = 16,6 (SD = 1,1) vs CD44

lo = 8 (SD = 1,1) (P = 0,0006), Prøve M-2: kolonier CD44

hi = 27 (SD = 7) vs CD44

lo = 12 (SD = 3) (P = 0,02); Sample M-3: kolonier CD44

hi = 24,3 (SD = 6,1) vs CD44

lo = 12,6 (SD = 2,5) (P = 0,03)). Den gennemsnitlige effekt af CD44

hej versus CD44

lo er 11,8 (95% CI: 3,41, 20,14; P = 0,026). Kolonner, betyder fra tre uafhængige forsøg; SD, *,

P

0,001, sammenlignet med de CD44

lo grupper, (studerendes

t

test). (C) blød agar kolonier afledt af CD44

hi celler (100 ×) og (D) CD44

lo celler (100 ×). (E) Expression profil BMI-1, hTERT, SUZ12, EZH2 og OLT 4 i sorterede CD44

hi og CD44

lo celler blev analyseret ved revers transkriptase-qPCR. I prøve M-3 kun BMI-1 udtrykkes ved højt niveau i CD44

hi befolkning end CD44

lo cellepopulation. I prøve M-2 Ringe højere udtryk for hTERT i CD44

hi celler end CD44

lo celler. Den CD44

hi befolkning af prøve M-1 udtrykt højt BMI-1, hTERT, SUZ12, EZH2 og OLT 4, end CD44

lo befolkning.

CD44

høj celler viser High Sfæroide Forming Evne i blød agar Cultures Salg

en anden erstatningsmålingen almindeligt anvendt til at karakterisere CSC er en differential kompetence på formning “forankringsuafhængig” kolonier i blød agar [12]. CD44

hi og CD44

lo celler fra prøver (M-A-1, M-10-26 og M-8-15) blev vurderet ved udpladning af sorterede celler i agarose suppleret med PCM. De CD44

høj celler fra alle tre prøver ensartet udviser højere klumpformet dannelse effektivitet end de CD44

lo celler (

t

test og ANOVA: P 0,05) (Figur 2B). De mere robuste CD44

hi kolonier er også kvalitativt adskiller sig fra rudimentære kolonier dannet af CD44

lo-celler (Figur 2C versus 2D). Således CD44

hi celler besidder større kompetence på at danne kolonier i blød agar end CD44

lo celler fra samme lungekræft biospecimen.

CD44

hi Cells Trinløs Display Molekylær Funktioner, karakterisere CSC

Markers, der kendetegner

kandidat

CSC (hTERT, SUZ12, OCT-4 udtryk etc.) er tydelige i cellepellets isoleret fra MPE prøver [5]; således, CSC er en sandsynlig komponent af MPE-tumor mix. Sådanne CSC markører er variabelt består af embryonal eller Polycomb proteinkomponenter og deres udtryk kan forudsige mærkning af celle delmængder, der besidder høje tumorigene eller kolonidannende potentialer [27]. At afgøre, om disse

kandidat

CSC markører var begrænset til specifikke CD44 sorteres delmængder, vi screenede CD44

hi og CD44

lo celle-undergrupper for differentiel mRNA udtryk; RT-PCR-amplifikation af BMI-1, hTERT, SUZ-12, EZH2 og OCT4 blev udført. Indekseret til beta-tubulin-mRNA, er der en markant variation i ekspressionen af ​​disse markører inden for CD44-sorteret celle-undergrupper (Figur 2E). For eksempel er BMI-1 og hTERT-mRNA mere stærkt udtrykt i CD44

hi celler end CD44

lo celler i prøven M-3 og M-2. Kun i prøve M-1, forventede fordelinger af CSC markører (høj BMI, hTERT, SUZ12, EZH2 og OLT 4) er tydelige i CD44

hi celler end CD44

lo celler.

disse resultater indikerer, at 1) molekylære markører der koder for modifikatorer af kromatin struktur eller embryonale gener kan være til stede i såvel højt tumorgene og ikke-tumorigene delmængder af individuelle lung cancer cellepopulationer, og 2) at der er mærket variabilitet i den differentielle ekspression af disse kandidat “CSC-biomarkører” i lungekræft biospecimens.

CD44

hi Celler danne tumorer i NOD /SCID (IL2rγ

null) Mus

Som specifikke molekylære markører kan ikke pålideligt differentiere tumorigene fra ikke-tumorigene celleundergrupper, kan vi skelne disse undergrupper på basis af adfærdsmæssige fænotyper? Den CD44

hi og CD44

lo celle delmængder fra individuelle tumor celle populationer konsekvent vise forskelle i vedhængende holoclone og blød agar kolonidannelse. En vigtig eksperimentel målestok for “CSC”, er imidlertid ved demonstration af højere tumorigent potentiale i musemodeller. Det har vist sig, at NOD /SCID (IL2rγ

null mus er følsomme model til at vurdere for meget tumorgene CSC- adfærdsmæssige fænotyper [16], [28]. For at underbygge observerede forskelle i kolonidannende og klumpformet danner evner CD44

hej vs CD44

lo celler med

in vivo

tumorigenese, vi undersøgte deres evne til at danne tumorer i NOD /SCID (IL2rγ

null) mus.

Begrænsning fortyndinger (30.000 ; 3000; 300) af sorterede CD44

hi og CD44

lo celler fra M-1 og M-2 maksimalt tilladelige fejl blev injiceret i højre og venstre flanker henholdsvis af NOD /SCID (IL2rγ

null) mus. CD44

høj tumorceller af M-1 prøve dannet tumorer i 3/3 mus ved både 30.000 og 3.000 injiceret celledoser, og i en af ​​3 mus injiceret med 300 tumorceller (figur 3 A, B, C). den latenstid af tumorer var 50-90 dage, 90-150 dage og 150 dage, for 30.000, 3.000 og 300 CD44

hi celler (figur 3E) således kinetikken af ​​tumordannelse ved den meget tumorgene CD44

hi celler var dosisafhængig. Den CD44

hi tumorceller fra prøve M-2 genererede tumorer i 2 af 3 mus på 30.000 tumorceller med en latenstid på 90-100 dage, en højere latenstid end observeret i CD44

hi celler prøve M -1 (figur 3E). Selv om CD44

hi celler konsekvent vise højere tumorigene potentialer end CD44

lo celler af samme prøve, kan individuelle tumor prøver vise forskellige vækst kinetik i evalueringen af ​​CSC egenskaber i adfærdsmæssige bioassays.

(A) Tumorigenicitet og latenstiden på CD44

hi celler (M-1) injiceret med ved 30.000; 3.000 og 300 celler. Mus injiceret med CD44

hi (højre flanke) dannede tumorer og CD44

lo celler ikke danne tumor (venstre flanke). Tallene (1/3, 2/3 eller 3/3) repræsenterer antallet af dyr med tumor /gruppe på bestemt tidspunkt målepunkt. Time periode på dage efter tumor implantering udtrykkes langs X-aksen og tumorvækst volumen er udtrykt som mm

3 langs Y-aksen. Usorterede parentale primære tumorer implanteret med 500.000 celler /mus viste ingen tumorvækst selv efter 3 måneders tumorcelleimplantation (data ikke vist) (B) mus, der bærer tumorer på højre flanke injiceret med CD44

hi celler og ingen tumor blev fundet på venstre injiceret med CD44

lo celler (C) operativt fjernede tumorer dannet af CD44

hi celler i mus. (D) FACS-analyse af enkelte celler opnået fra musetumorer afledt af CD44

høj celler af M-1 MPE prøve. Tumorcellerne viser ekspression af CD44, cMet, uPAR og CD166 markører. (E) tumorigenicitet og latenstid på CD44

hi og CD44

lo celler prøver M-1 og M-2 i NOD /SCID (IL2rγ

null) mus.

Især CD44

lo celler fra enten primær kultur gjorde

ikke

danne tumorer i venstre flanker af musene under hele overvågning interval (fig. 3 B og E). Desuden har vi også gjorde

ikke

observere tumordannelse med injektion af 5 × 10

5

usorterede

celler, selvom denne population formentlig indeholdt ~5-10% (eller 25,000- 50.000) CD44

hi celler. Denne interessant observation antyder, at CD44

hi celler kan blive udsat for hæmmende påvirkninger i retning af tumorvækst ved celler, der har en lavere intensitet overflade CD44-ekspression i samme tumor befolkning.

For at teste, om implanteret CD44

hi celler bidrog til heterogene tumorer (tyder på multipotente differentiering), indpodede tumorer genereret fra CD44

hi from M-1-celler blev eksstirperet, spaltet, og celleoverflademarkør analyse blev udført ved FACS på enkeltcelle-suspensioner. Tumorcellerne forblev stærkt positive for CD44 markering, med 98,2% af cellerne farves positivt, selv om CD44-MFI var endnu højere end de oprindeligt implanterede celler. Heterogenitet blandt celler fremgik af den variable udtryk for andre almindeligt forbundet CSC-biomarkører (figur 3D), [cMET (40,4%), uPAR (47,6%) og CD166 (27,4%)]. Celler, der bærer disse markører blev også tidligere påvist i de primære MPE biospecimen prøver, ved varierende fraktioner [5].