PLoS ONE: nedregulering af Gli Transskription Factor Fører til hæmning af migration og invasion af ovariecancerceller via Integrin β4-medieret FAK Signaling

Abstrakt

Baggrund

De seneste oplysninger tyder på, at afvigende aktivering af Hedgehog (Hh) signalering af Gli transkriptionsfaktorer er karakteristisk for en række aggressive humane carcinomer, herunder kræft i æggestokkene. Derfor har kemoterapeutiske midler, som inhiberer aktiveringen af ​​Gli transkriptionsfaktorer dukket op som lovende nye terapeutiske lægemidler til ovariecancer.

Resultater

I denne undersøgelse viser vi, at aktivering af Hh-signalering fremmet cellulære migration og invasion, mens blokade af Hh-signalering med GANT61 undertrykt cellulære migration og invasion i æggestokkene cancerceller. Efter behandling med GANT61, analyser cDNA microarray afsløret ændringer i mange gener såsom Integrin β4 underenhed (ITGB4), fokal vedhæftning kinase (FAK), etc. Endvidere ITGB4 udtryk blev opreguleret af Sonic Hedgehog (Shh) ligand og nedreguleret af Hh signalering inhibitor. The Shh-medieret ovarie celle migration og invasion blev blokeret af neutraliserende antistoffer mod ITGB4. Desuden blev phosphoryleringer af FAK steg med Shh og faldt med Hh-signalering inhibitor. Hæmning af Gli1 udtryk ved hjælp siRNA efterlignede virkningerne af GANT61 behandling, støtte specificitet GANT61. Yderligere undersøgelser viste, at aktivering af FAK var nødvendig for Shh-medieret cellemigration og invasion. Endelig fandt vi, at nedregulering af Gli reducerede udtryk for ITGB4 og det phosphorylerede FAK, hvilket resulterer i hæmning af tumorvækst

in vivo

.

Konklusioner

hh signaleringsvej inducerer cellemigrering og invasion gennem ITGB4-medieret aktivering af FAK i ovariecancer. Vores resultater tyder på, at formindskelse af krydstale mellem fosforyleret FAK og ITGB4 grund af nedregulering af Gli familie transkriptionsfaktorer kunne spille en central rolle for at hæmme kræft i æggestokkene progression

Henvisning:. Chen Q, Xu R, Zeng C, Lu Q, Huang D, Shi C, et al. (2014) nedregulering af Gli Transskription Factor Fører til hæmning af migration og invasion af ovariecancerceller via Integrin β4-Mediated FAK Signaling. PLoS ONE 9 (2): e88386. doi: 10,1371 /journal.pone.0088386

Redaktør: Frédéric André, Aix-Marseille Universitet, Frankrig

Modtaget: 16 oktober, 2013; Accepteret: 6 jan 2014; Udgivet: 12 februar 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra China National Basic Research Program (2010CB535001), National Natural Science Foundation of China (81.060.095, 31.171.359), Specialized forskningsfonden for ph.d.-programmet for videregående uddannelse (2010360111007) og NIH (P30 CA054174 ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er en af ​​de mest dødelige gynækologiske maligniteter verdensplan. På grund af de ikke-specifikke symptomer, er de fleste af æggestokkene cancertilfælde stede med fremskredent sygdom og forbundet med en høj dødelighed [1]. Ved fremskreden ovariecancer, tumorceller er yderst invasive og efterfølgende cancer metastaser fører til døden [2]. Dereguleret celle migration og invasion bidrager til virkeliggørelsen af ​​det metastatiske evne af tumorcellerne og den molekylære mekanisme, der regulerer metastaser stort set ukendt. Derfor er det afgørende at identificere molekylære mediatorer, der giver metastatisk potentiale til æggestokkene kræftceller og i sidste ende til at bruge disse molekyler som biomarkører til at forudsige risikoen for kræft i æggestokkene progression [3].

Hedgehog (Hh) signalering er initieret af bindingen af ​​ligand nemlig Sonic Hedgehog (Shh), Indian Hedgehog (Ihh) eller Desert Hedgehog (Dhh) til dens receptor, Patched (ptch), som derved mindsker de inhiberende virkninger af ptch på Smoothened (Smo) [4]. Smo derefter lokaliseret i den primære cilium, en organel spiller en kritisk rolle i Hh signalering [5] som bevis fra smo medieret aktivering af en intracellulær kaskade i cilium der resulterer i nuklear translokation af Gli2, en Gli familie transkriptionsfaktor [6]. Til gengæld omplantes Gli2 inducerer transskription af Hh target gener, såsom Gli1, en afgørende komponent i Hh-signalering [6], [7]. Evnen af ​​disse Gli transkriptionsfaktorer at tænde gener i kernen kan faktisk fremme cellulær proliferation, cellulær overlevelse, stemness, og celleskæbne bestemmelse i en række forskellige organer [8], [9]. Endnu vigtigere er, opstår Hh-drevne cancerformer fra en række forskellige mutationer, der påvirker forskellige komponenter, herunder de centrale transkriptionelle effektorer Gli proteiner [10] – [12]. Konstitutivt, Hh-Gli signalering er hyperaktiv i basalcellekarcinomer, medulloblastomer og kræft i spiserøret, på grund af mutation i Patched eller Smoothened [13]. Også, blev tilstedeværelsen af ​​dereguleret Hh-Gli signalering akse observeret i melanomer og prostata carcinomer [14], [15]. Endvidere adskillige rapporter indikerer, at Hh-signalering er involveret i metastaser af æggestokkene [16], prostata [17], gastrisk [18], esophageal [19] og pancreas [20], [21] carcinomer. Tilsammen viser disse observationer indebærer, at misreguleret Hh-signalering korrelerer med sværhedsgraden af ​​den tilknyttede tumor og bidrager til at opretholde metastatisk adfærd. Alligevel forbliver dårligt defineret rolle Hh signalering i invasion og metastase af kræft i æggestokkene. Desuden de mekanismer, hvormed Hh signalering fremmer tumor invasion og metastase skal yderligere belyst.

Der er mange tegn på, at Hh signalvejen er afgørende for væksten af ​​kræftceller. Af denne grund har inhibering af Hh-signalering ved nye terapeutiske midler blevet forsøgt i flere humane cancere [22] – [24]. Blokade af Hh signalering ved GDC-0449 [24], [25], cyclopamin [24], IPI-926 [23], eller Smo shRNA [26] hæmmede celleproliferation og overlevelse, og undertrykte tumordannelse. Men en række tumorer har vist, at være resistente over for de direkte virkninger af farmakologisk Hh hæmning med SMO antagonister skyldes naturlig eller erhvervede mutationer i Smo [27], [28] eller forstærkning af downstream effektor Gli2 [29]. Disse observationer understreger behovet for at identificere bedre terapeutiske mål, der effektivt blokerer Hh signalvejen. GANT61 (Gli-Antagonist 61) blev identificeret fra en celle-baseret screening for inhibitorer af Gli-medieret transkription [29]. For nylig GANT61 er blevet identificeret som en potent Hh signaleringsvej inhibitor til behandling af forskellige cancertyper [22], [24].

I denne undersøgelse anvendte vi GANT61, et lille molekyle inhibitor for både Gli1 og Gli2 [29 ], til at identificere unikke nedstrøms mål af

GLI

gener, der fungerer specielt i cellulær migration og invasion i kræft i æggestokkene. Vores resultater opnået fra humane ovarie cancercellelinier SKOV3 celler, som udviser høj invasive adfærd [30], støtter Hh-signalering fremmer cancercelleinvasion gennem integrin β4 (ITGB4) -medieret aktivering af fokal adhæsionkinase (FAK) i ovariecancer. Faktisk vokser tyder på, at ITGB4 spiller en central rolle i funktioner i forbindelse med carcinom progression [31] – [33]. Interessant FAK har været forbundet med integrin-signalveje via interaktioner med integrin-associerede proteiner, såsom paxillin og talin [34] – [37] med heraf følgende virkninger på cellemigrering [37], [38]. Desuden er der i muse xenograftmodeller af human ovariecancer, kan inhibering af Hh-signalering pathway fremme omfattende celledød og reducerer tumorvækst

in vivo

. Vores resultater tyder på, at formindskelse af krydstale mellem fosforyleret FAK og ITGB4 grund af nedregulering af Gli familie transkriptionsfaktorer kan spille en afgørende rolle for hæmning af kræft i æggestokkene progression.

Resultater

nedregulering af Gli ekspression svækker ovariecancer cellemigration og invasion

Tidligere undersøgelser har antydet, at afvigende aktivering af Hh-signalering er impliceret i en række af aggressive humane carcinomer [10], [12], [16]. I denne undersøgelse, vi først undersøgt virkningerne af GANT61, en specifik hæmmer af Gli1 og Gli2 [29], [39], på Hh signalvejen ved at måle ekspressionen af ​​Hh receptorer (ptch og Markedsobservatoriet) og effektorer (Gli1 og Gli2 ). GANT61 inhiberede ekspression af transkriptionsfaktor Gli1 og Gli2 (figur 1A og B). Tilsvarende GANT61 inhiberede ekspression af ptch, en nedstrøms mål for Gli [40]. Også, vi ansat immunofluorescens teknik til at undersøge effekten af ​​GANT61 på ekspression af Gli. Immunofluorescens billede viste GANT61 inhiberede ekspressionen af ​​Gli2 (figurerne 1C og D). Disse data antyder, at GANT61 kan inhibere Hh-signalvejen

(A) Udsættelse for GANT61. (30 pM; 48 timer) reducerer ekspression af både Gli1 og Gli2 protein, bestemt ved Western blot. GAPDH blev anvendt som indlæsning kontrol. (B) Ekspression af både Gli1 og Gli2 mRNA reduceres efter behandling med GANT61 (30 pM; 48 timer), bestemt ved real-time PCR. (C, D) GANT61 inhiberer ekspression af Gli2 i ovariecancerceller. ES2 og SKOV3-celler blev behandlet med vehikelkontrol (DMSO) eller GANT61 (20 uM) i 48 timer. Efterfølgende blev celler farvet med Gli2 og visualiseret under et konfokalt mikroskop. Scale bar, 10 um. (E, F) Blokade af Hh-signalering hæmmer kræft i æggestokkene celle migration. Sammenflydende ES2 cellemonolag blev såret med en pipettespids og derefter behandlet med N-Shh betinget medium plus vehikelkontrol (0,2% DMSO) eller GANT61. Cellemigrering til sårområdet blev overvåget ved mikroskopi. Procentdelen af ​​det samlede areal dækket af celler blev derefter vurderet under anvendelse af NIH Image program. (G, H) Blokade af Hh-signalering inhiberer ovariecancer celleinvasion. SKOV3-celler (1 x 10

5 celler /brønd) blev podet i det øvre kammer. Vækstmedium indeholdende N-Shh (0,5 ug /ml) alene eller sammen med GANT61 (20 uM), vehikelkontrol (0,2% DMSO) blev tilsat til det nederste kammer. Efter 24 timers inkubation blev celler, der invaderede den nedre overflade af indsatsen farvet med krystalviolet og talt ved mikroskopi. De repræsentative billeder fra tre uafhængige eksperimenter er vist. Scale bar, 200 pm. Dataene er udtrykt som middelværdi ± SD for eksperimenter udført tre gange. **,

P.

0,01 sammenlignet med kontrolgrupper

Næste, vi testede effekten af ​​Hh-signalering på motiliteten af ​​humane ovariecancerceller ved hjælp af en

i vitro

sår-helende assay. To humane ovarie cancercellelinjer ES2 og SKOV3 blev behandlet med den betingede medium indeholdende N-Shh (0,5 ug /ml), og kontrol medie. Vi fandt, at N-Shh signifikant forøget ES2 og SKOV3 cellevandring (data ikke vist). For at bekræfte bidrag Hh-signalering til motiliteten af ​​ovariecancerceller, blev cellerne behandlet med en inhibitor af Hh signalvejen. Den yderligere inkubering af N-Shh-behandlede celler med stigende koncentrationer af GANT61 vendt den stimulerende virkning af N-Shh på cellemigrering i ES2 celler, versus celler behandlet med N-Shh plus vehikelkontrol (fig 1 E og F), hvilket antyder, at GANT61 hæmmede ES2 celle migration. Endvidere blev virkningen af ​​Hh-signalering på den invasive evne ovariecancerceller målt under anvendelse af et Matrigel invasion assay. Evnen hos ovariecancerceller at invadere Matrigel blev markant forbedret ved behandling med Shh (fig 1G og H). Omvendt blev Shh-induceret invasionsevne af SKOV3-celler reduceres med næsten 64% i celler, der blev også behandlet med GANT61 (figur 1G og H), hvilket antyder, at Hh-signalering har en væsentlig rolle i motilitet ovariecancerceller.

inhibering af Hh-signalering ændrer genekspressionsprofiler af ovariecancerceller

for at undersøge rollen af ​​Hh signalvejen i initieringen og fremadskriden af ​​ovariecancer, vi målte genekspressionsniveauer som reaktion på inhibering af Hh signalering i ovariecancerceller anvendelse af en cDNA microarray teknik. SKOV3-celler blev behandlet med enten 20 uM GANT61 eller DMSO som vehikelkontrol i 60 timer. Derefter sammenlignede vi genekspressionsprofilerne af GANT61-behandlede SKOV3-celler og DMSO-behandlede celler med Illumina® Sentrix® BeadChip arrays. Ekspressionen af ​​18,401 menneskelige gener blev profileret i kontrolceller behandlet med bærer og i celler behandlet med GANT61. Gener med en

DiffScore

mindre end -20 eller mere end 20 (dvs.

P

-værdi 0,01) blev anset for differentielt udtrykte gener (degs) induceret af GANT61 forhold til kontrolgruppen køretøjet. Af de 412 DEGS unikke for SKOV3 (20 uM GANT61 i 60 timer), 208 gener (50,5%) blev opreguleret og 204 gener (49,5%) blev nedreguleret (figur 2A). Og næsten alle

degs Hotel (392/412) viste en betydelig udtryk ændring efter GANT61-behandling (fold forandring 2,0). Gener med væsentlige ændringer i udtryk følgende GANT61 behandling blev klassificeret i forskellige kategorier baseret på veldokumenterede og etableret biologisk eller patologisk funktion (figur 2B). Disse degs i respons på behandling med GANT61 hovedsageligt tilhører følgende kategorier: omdrejningspunkt vedhæftning, MAPK signalering, celle cyklus, p53 signalering, ekstracellulære matrix (ECM) receptor interaktion, Wnt signalering, ErbB signalering, Toll-lignende receptor signalering, NOD- lignende receptor signalering og cytokin receptor-interaktion. Degs opererer i omdrejningspunktet vedhæftning i GANT61-behandlede celler præsenteres i en varme kort (Figur 2C). Gennem dette kort, fandt vi, at 19 gener blev signifikant differentielt udtrykt, herunder syv op-regulerede gener og 12 ned-regulerede gener, sammenlignet med kontrol SKOV3-celler. Interessant, blev nogle degs observeret i omdrejningspunktet vedhæftning såsom LAMC2, ITGA5, LAMA3, ITGB4, COL1A1, THBS1 og COL5A1 også findes blandt DEGS i ECM-receptor interaktion. Disse resultater antyder, at den fokale vedhæftning og ECM-receptor-interaktionen krydstale i SKOV3-celler efter behandling med GANT61, og udtrykket ændring af “fokal adhæsion” -relaterede gener spiller en vigtig rolle i afhængighed GANT61-behandling.

(A) Identifikation af differentielt udtrykte gener (degs) i GANT61-behandlede SKOV3 celler. Celler blev behandlet med GANT61 (20 uM) eller DMSO i 60 timer, og totalt RNA blev ekstraheret som beskrevet i Methods. Ændringer i genekspression blev bestemt ved cDNA microarray gen profilering ved anvendelse af Illumina human HT-ekspression BeadChip V4 (Illumina Inc., San Diego, CA). Differential angivelser for de DEGS er vist. (B) De øverste 11 kanoniske signalveje påvirkes af inhibering af Gli1 /Gli2 funktion i SKOV3-celler. De top 11 kanoniske signalveje, bestemt af IPA, der var markant opreguleret eller nedreguleret af GANT61 behandling i SKOV3 celler, vises. De 412 degs blev kortlagt til IPA-definerede netværk. De signifikante

P

-værdier, der bestemmer sandsynligheden for, at sammenhængen mellem generne i datasættet og den kanoniske vej er tilfældigt alene blev beregnet ved Fishers eksakte test, og udtrykkes som -log (

P

-værdi). (C) Heat kort over degs i omdrejningspunktet vedhæftning signal vej hos GANT61-behandlede SKOV3 celler. Varmen kort viser, at 17 gener blev signifikant differentielt udtrykt, herunder syv op-regulerede gener og 12 nedregulerede gener, i GANT61-behandlede sammenlignet med kontrol SKOV3-celler. (D) Udvalgte DEGS fra cDNA-array genekspressionsprofilering analyseret ved real-time PCR. SKOV3-celler blev behandlet med DMSO eller GANT61 i de angivne tidsrum, totalt RNA blev ekstraheret for real-time PCR som beskrevet i Methods hjælp af primersæt i tabel 1. Dataene repræsenterer middelværdien ± SD af tre bestemmelser, og GAPDH blev anvendt til normalisere de relative mRNA-niveauer.

for at bestemme robustheden af ​​cDNA microarray genekspression profilering efter behandling af SKOV3 celler med GANT61 blev realtids-PCR anvendes til at bestemme ændringer i ekspressionen af ​​den valgte gruppe af seks degs identificeret fra cDNA microarrays. De involverede gener og syntetiserede primere er vist i tabel 1. Real-time PCR blev udført på cDNA, der blev genereret ved anvendelse af total RNA uafhængigt isoleret fra GANT61-behandlede SKOV3 celler til 0 timer, 36 timer og 60 timer. GAPDH blev anvendt til at normalisere alle real-time PCR data (Figur 2D). Ændringerne bestemt ved real-time PCR blev fundet at være i overensstemmelse med microarray analyse, således at validere dens betydning. Samlet set har disse data viser, at Hh signalvejen kan spille en central rolle i motilitet og invasionsevne af æggestokkene cancerceller.

ITGB4 medierer Shh-induceret migration og invasion af ovariecancerceller

Talrige undersøgelser har vist, at ITGB4-FAK signalering kan modulere metastatiske potentiale ovariecancerceller ved at nedbryde kælder membranbarrierer og fremme cellemotilitet [41] – [43]. For at bestemme om Shh-stimuleret cellemigrering og invasion skyldtes forhøjede niveauer af ITGB4 protein, vi undersøgte ekspressionsniveauet af ITGB4 anvendelse af Western blot-analyse og real-time PCR. Den ITGB4 ekspression blev forøget efter N-Shh-stimulering, med niveau 3 gange større end ubehandlede celler bliver observeret efter 24 timers (figur 3A, B og C). I modsætning hertil blev ITGB4 ekspression markant reduceret i nærvær af GANT61 (fig 3D og E). For at bestemme om ophævelse af ITGB4 signalering kunne blokere Shh-stimuleret cellulær motilitet og invasion, vi blokeret ITGB4 signalering ved anvendelse af et anti-ITGB4 blokerende antistof. Som vist i figur 3F blev de stimulerende virkninger af N-Shh på cellemigration og invasion fuldstændigt ophævet ved anti-ITGB4 blokerende antistof, men ikke af normale IgG.

(A, B) Stimulering af N-Shh opregulerer ITGB4 ekspression. SKOV3-celler blev inkuberet i nærvær eller fravær af N-Shh (0,5 ug /ml) i 24 timer. Western blots blev derefter udført for de angivne antistoffer. Proteinekspression blev kvantificeret af Image J og normaliseret til GAPDH. (C, D) Inhibering af Gli1 nedregulerer ITGB4 ekspression. SKOV3-celler blev behandlet med GANT61 eller DMSO i 48 timer. Western blot blev derefter udført med de angivne antistoffer. Proteinekspression blev kvantificeret af Image J og normaliseret til GAPDH. (E, F) Blokade af ITGB4 inhiberer celleinvasion i SKOV3-celler. SKOV3 celler dyrket i lavt serum (2% FBS) vækstmedium blev podet i de øvre kamre. Den lave serum vækstmedium indeholdende N-Shh (0,5 ug /ml) sammen med anti-ITGB4 antistof (0,2 ug /ml) eller kontrol IgG tilsat til det nederste kammer. Efter 24 timers inkubation blev celler, der invaderede den nedre overflade af indsatsen farvet med krystalviolet og talt ved mikroskopi. (G) Gli1 miRNAi inhiberer ekspressionen af ​​ITGB4 i SKOV3-celler. SKOV3-celler blev transient transficeret med vehikel (lipofectamin alene), kontrollere miRNAi og Gli1 miRNAis (MIR-Gli1-720 og MIR-Gli1-1863) hhv. Western blot viste, at Gli1 miRNAi inhiberede ekspressionen af ​​ITGB4 gener. (H) Silencing Gli1 udtryk svækker Shh-induceret æggestokkræft celle invasion. SKOV3-celler blev transficeret med Gli1 miRNAi eller kontrol miRNAi i 24 timer efterfulgt af stimulering med N-Shh (0,5 ug /ml) eller kontrolmedium i yderligere 24 timer. Celleinvasion blev målt som beskrevet i Methods. (I, J) Silencing ITGB4 udtryk svækker Shh-induceret æggestokkræft celle invasion. SKOV3-celler blev transficeret med ITGB4 miRNAi-konstruktioner (MIR-ITGB4-2255 og MIR-ITGB4-4027) eller kontrol miRNAi i 24 timer efterfulgt af stimulering med N-Shh (0,5 ug /ml) eller kontrolmedium i yderligere 24 timer. Western blot viste, at ITGB4 miRNAis inhiberede ekspressionen af ​​ITGB4 genet (I). Celleinvasion blev målt som beskrevet i Methods (J). Dataene er udtrykt som middelværdi ± SD for eksperimenter udført tre gange. **,

P.

0,01 sammenlignet med kontrolgrupper

For at bekræfte rollen som transkriptionsfaktor Gli i mediere ITGB4 udtryk, vi transficerede SKOV3 celler med miRNAi konstruktioner rettet mod Gli1 . Immunoblotanalyse i figur 3G viste miR-Gli1-720 og miR-Gli1-1863, hvilket reducerede udtryk for Gli1 af 5- og 4-fold, henholdsvis faldt betydeligt ITGB4 subunit udtryk. Dernæst vi evaluerede effekten af ​​direkte lyddæmpning af Gli1 udtryk på celle adfærd. Som vist i figur 3H, blev et signifikant fald i celleinvasion observeret i Gli1 miRNAi-behandlede celler som bedømt ved den celleinvasion assay. Endelig har vi forsøgt at bestemme, om ITGB4 bidrager til den invasive fænotype medieret af Hh-signalering. Til disse eksperimenter anvendte vi stærkt invasive ovariecancer celler SKOV3 [30]. ITGB4 udtryk blev undertrykt ved hjælp af specifikke miRNAi konstruktioner, og Shh-stimuleret cellulær invasion af behandlede celler til ikke-targeting (miR-kontrol) eller ubehandlede celler blev sammenlignet. Tabet af ITGB4 ekspression (fig 3I) reducerede Shh-stimuleret cellulær invasion af SKOV3-celler ved -60% i forhold til ubehandlede eller ikke-targeting (MIR-kontrol) miRNAi-transficerede celler (figur 3J), hvilket antyder, at ITGB4 er vigtigt for tumor celle invasion.

Shh fremmer motilitet og invasivitet af ovariecancer celler gennem ITGB4-medieret aktivering af FAK signalering

for at belyse de molekylære mekanismer bag den Shh-stimuleret ITGB4 respons i cellulær motilitet og invasion af kræft i æggestokkene celler, evalueret vi FAK protein-ekspression og aktivering af ITGB4 at bestemme, om de blev ramt af Hh-signalering. Som vist i figur 4A, blev fundet phosphorylering af FAK (Tyr397) til øges væsentligt som følge af N-Shh-stimulering. Men på trods af tilstedeværelsen af ​​N-Shh, behandling af SKOV3-celler med anti-ITGB4 blokerende antistof faldt betydeligt phosphorylering af FAK (Tyr397) (figur 4A og B). Desuden stimulerer SKOV3 celler med stigende koncentrationer af N-Shh afslørede, at ekspressionen af ​​ITGB4 og phosphorylering af FAK (Tyr397) steg på en dosis-afhængig måde (data ikke vist). Endvidere blev phosphorylering af FAK (Tyr397) reduceret i celler, som blev cotreated med GANT61 sammenlignet med celler behandlet med N-Shh plus vehikelkontrol (fig 4C, D og F). Fornyet probing med et antistof rettet mod alt FAK afslørede ikke nogen væsentlig ændring i protein og mRNA-niveauer (figur 4C, D og E), hvilket tyder på, at de observerede stigninger i udtryk ikke opstå som følge af en stigning i mængden af ​​total FAK protein, hvilket stemmer overens med de resultater, blokaden af ​​Hh-signalering reducerede ekspressionen af ​​ITGB4 (fig 3D og G). Interessant, når Hh signalvejen blev blokeret af GANT61, en reduceret ekspression af paxillin, som er nedstrøms for FAK [44], blev observeret (figur 4C og D). Tilsvarende inhibering af Hh-signalering førte til afbrydelse af cytoskeletorganisation i ovariecancerceller (figur 4G). Disse fund indikerer, at Hh-signalering spiller en kritisk rolle i induktionen af ​​FAK phosphorylering og cytoskeletorganisation.

(A, B) Hh-signalering aktiverer FAK gennem ITGB4. SKOV3-celler blev behandlet med ITGB4 antistof eller kontrol IgG i nærvær eller fravær af N-Shh (0,5 ug /ml) i 24 timer. Ekspression og fosforylering af FAK (Tyr397) blev verificeret ved Western blot. (C-E) Blokade af Gli nedregulerer phosphoryleringsniveauerne af FAK (Tyr397), men ikke FAK protein ekspression. SKOV3-celler blev behandlet med GANT61 eller DMSO i 24 timer. Derefter Western blot blev udført ved anvendelse af de viste antistoffer. N.S, uden betydning. (F, G) Undertrykkelse Gli ekspression reducerer phosphoryleringen af ​​FAK (Tyr397) og cytoskeletorganisation. SKOV3-celler blev behandlet med GANT61 i 48 timer. Efterfølgende blev celler farvet med antistof mod phosphorylering af FAK (Tyr397) og fremkaldes med konfokalt mikroskop (F). For F-actin-farvning blev celler inkuberet med Alexa Fluor 488 phalloidin (Invitrogen, A12379) i 20 minutter og visualiseres under anvendelse af konfokal mikroskop (G). (H) Tab af Gli-FAK signalering svækker Shh-induceret æggestokkræft celle invasion. SKOV3-celler blev transficeret med kontrol miRNAi eller Gli1 miRNAi (MIR-Gli1-720) i 24 timer efterfulgt af stimulering med N-Shh (0,5 ug /ml) sammen med PF573228 (5 uM), en specifik inhibitor af FAK, eller vehikelkontrol (DMSO) i yderligere 24 timer. Celleinvasion blev målt ved invasion assay som beskrevet i Methods. Dataene er udtrykt som middelværdi ± SD for eksperimenter udført tre gange. **,

P

0,01 sammenlignet med kontrolgrupper. Scale bar, 20 pm.

For yderligere at evaluere rolle ITGB4-FAK signalering i Shh-stimuleret cellulær migration og invasion, vi også hæmmet og bankede ned FAK i SKOV3 celler og analyseret for cellulær motilitet og invasion. Vigtigere, yderligere behandling med PF573228, en specifik hæmmer af FAK [45], fuldstændig vendt de bevægelige og invasive virkninger af Hh-signalering på SKOV3 celler (Figur 4H). Endvidere forbigående ekspression af FAK miRNAi reduceret evne N-Shh at stimulere migrering og invasion af disse celler sammenlignet med celler behandlet med kontrol miRNAi (data ikke vist). Notatet blev reduktionen af ​​FAK udtryk med en specifik miRNAi konstruere bruges her vist tidligere [46]. Tilsammen disse resultater viser, at Hh signalering modulerer migration og invasion af ovariecancer celler gennem ITGB4-medieret aktivering af FAK signalering.

Blokade af Hh-signalering hæmmer kræft i æggestokkene vækst

in vivo

for at estimere de potentielle væksthæmmende effekter af GANT61

in vivo

, vi efterfølgende implanteret SKOV3 celler sc i mus. Behandling med GANT61 (25 mg /kg, tre gange om ugen) reducerede signifikant væksten af ​​tumorer sammenlignet med opløsningsmidlet kontrol (figur 5A). Dette blev også afspejlet i sluttumorvægte på dag 15, som var signifikant lavere i GANT61 behandlede gruppe (figur 5B). Vi undersøgte også, om Gli kunne være nedreguleret ved denne behandling. Western blot-analyser af tumorvæv afslørede, at behandling med GANT61 faktisk nedreguleret Gli1 og Gli2 i væv (figur 5C og D). Desuden blev intensiteten af ​​både ITGB4 og phosphorylering af FAK (Tyr397) signifikant reduceret i tumor dele af GANT61 gruppen sammenlignet med opløsningsmiddel kontrolgruppen (figur 5E og F). Dette resultat antyder, at nedregulering af Gli reducerer ekspressionen af ​​ITGB4 og phosphorylerede FAK, hvilket resulterer i inhibering af tumorvækst

in vivo

.

SKOV3-celler (2 x 10

7) blev implanteret sc i flanken af ​​BALB /c nu /nu mus. Bagefter blev modtaget musene enten GANT61 (25 mg /kg s.c., tre gange om ugen) eller opløsningsmiddel (majsolie: ethanol, 04:01). Behandling blev initieret i alle grupper (n = 8 hver gruppe), når gennemsnitlige tumorvolumen havde nået 100 mm

3. (A) Behandling med GANT61 ført til en betydelig vækst hæmning af xenotransplanterede humane kræft i æggestokkene tumorer. n = 8; **,

P

0,01. (B) Eksperimentet blev afsluttet på dag 15, og tumorerne blev udskåret. Sluttumorvægte i GANT61 behandlingsgruppe (n = 8) var signifikant lavere sammenlignet med udskårne tumorer på opløsningsmidlet kontrolgruppe (n = 8). **,

P

0,01. Kolonner, betyder; barer, SD. (C, D) Western blot analyser for Gli1 og Gli2 i tumorvæv. Behandling med GANT61 formindsket ekspression af Gli1 og Gli2. (E, F) Immunhistokemisk billede af tumorvæv sektion. Behandling med GANT61 formindsket ekspression af ITGB4 (E). Et betydeligt fald i fosforylering af FAK (Tyr397) blev også effektivt opnået ved GANT61 behandling (F). Scale bar, 20 pm

Diskussion

Selv om den kritiske rolle Hh signalering i tumorigenese er blevet fremhævet [47] -. [50], de molekylære mekanismer, som Hh signalering pathway medierer metastase er ikke godt forstået. Her rapporterer vi, at Hh signalvejen fremmer ovariecancer celle migration og invasion

in vitro

in vivo

. Endvidere fandt vi, at aktiveringen af ​​Hh-signalvejen induceret ITGB4 ekspression og aktivering af FAK. Endelig viste vi, at afbrydelse af ITGB4-FAK signalering resulterede i suppression af Hh-medieret cellemigration og invasion. Baseret på disse resultater, foreslår vi, at Hh signalvejen inducerer metastatiske funktioner af ovariecancer gennem ITGB4-medieret aktivering af FAK.

Tidligere undersøgelser har antydet, at Hh-signalering spiller en rolle i kontrollen af ​​motiliteten af ​​multipel celletyper [51] – [53]. Afbrydelse af Hh signalering ved cyclopamin har vist sig at hæmme EMT og reducere metastaser i bugspytkirtelkræftceller [20]. Gli overekspression inducerede lymfatisk metastase, hvorimod inhiberingen af ​​Hh-signalering reduceret cellevækst og motilitet [19]. I denne undersøgelse viste vi, at migration og invasion af ovariecancerceller blev induceret ved N-Shh stimulation og blokeres ved ophævelse Hh signalering med GANT61 (figur 1). Interessant, vi fandt også, at aktivering af Hh signalvejen i ovariecancerceller induceret ITGB4 gentranskription (figur 3). Endvidere blokade af ITGB4 signalering ved en ITGB4-blokerende antistof gør ovariecancerceller ikke reagerer på Shh-stimuleret migration og invasion, hvilket antyder, at ITGB4 modulerer Hh-signalering i æggestokkene migration kræft og invasion (figur 3). Tilsammen indikerer disse data, at unormal aktivering af dette signalering kan bidrage til metastase i en række forskellige cancere, herunder ovariecancer, og at inhibering af Hh signalvejen kan være nyttige til forebyggelse metastase. Det er interessant at bemærke, at forøgelse af ITGB4 genekspression blev induceret ved N-Shh-stimulering (figur 3). Derfor skal Hh-signalering, der skal evalueres yderligere for at bestemme, om den påvirker aktiviteten af ​​ITGB4 promotoren gennem en fysisk interaktion mellem Gli protein og et specifikt område af ITGB4 promotoren.

mere tyder, at integriner kan ændre cellulær adfærd gennem rekruttering og aktivering af signalproteiner, såsom ikke-receptortyrosinkinaser, herunder FAK og c-Src, der danner en dobbelt kinase kompleks [54]. The FAK-Src-kompleks binder til og kan phosphorylere forskellige adapter proteiner, såsom p130C og paxillin [55]. Aktivering af FAK af både integrin og vækstfaktorer spiller en kritisk rolle i flere forskellige biologiske processer, herunder celleoverlevelse, proliferation, attachment, migration og invasion [56] – [58]. Overekspression af FAK protein er blevet rapporteret i metastatisk menneskelig colorectal, bryst, prostata, og ovariecancer celler [59] – [62].