PLoS ONE: Regulering af Apoptotiske Effekter af Erythrocarpine E, et cytotoksisk limonoid fra Chisocheton erythrocarpus i HSC-4 Menneskelig Oral Cancer Cells

Abstrakt

Formålet med denne undersøgelse var at bestemme cytotoksiske og apoptotiske virkninger af erythrocarpine E (CEB4), en limonoid udvundet fra

Chisocheton erythrocarpus

på human oral pladecellekræft. Baseret på foreløbige dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT) assays, CEB4 behandlet HSC-4-celler demonstrerede en cytotoksisk virkning og inhiberede celleproliferation i et tidsrum og dosisafhængig måde med et IC

50 værdi på 4,0 ± 1,9 uM inden 24 timer af behandlingen. CEB4 viste sig også at have minimale cytotoksiske virkninger på den normale cellelinie, NHBE med cellelevedygtighed niveauer holdes over 80% ved behandlingen. Annexin V-fluoresceinisothiocyanat (FITC), viste poly-ADP ribose polymerase (PARP) spaltnings- og DNA-fragmentering assayresultater at CEB4 inducerer apoptose medieret celledød. Western blotting-resultater viste, at induktionen af ​​apoptose ved CEB4 syntes at være medieret gennem regulering af p53-signalvejen, som der var en stigning i p53 phosphoryleringsniveauerne. CEB4 viste sig også at opregulere pro-apoptotisk protein, Bax, mens nedregulering af anti-apoptotisk protein, Bcl-2, hvilket antyder inddragelsen af ​​den indre mitokondrielle pathway. Reducerede niveauer af initiator procaspase-9 og bøddel caspase-3 zymogen blev også observeret efter CEB4 eksponering, dermed indikerer involvering af cytochrom c medieret apoptose. Disse resultater viser den cytotoksiske og apoptotiske evne erythrocarpine E, og foreslå dens udviklingspotentiale som kræft kemoforebyggende middel

Henvisning:. Nagoor NH, Shah Jahan Muttiah N, Snart Lim C, I LLA, Mohammad K, Awang K (2011) Regulering af Apoptotiske effekter af Erythrocarpine E, et cytotoksisk limonoid fra

Chisocheton erythrocarpus

i HSC-4 Humane Oral Cancer Cells. PLoS ONE 6 (8): e23661. doi: 10,1371 /journal.pone.0023661

Redaktør: Paul C. Driscoll, MRC nationale institut for medicinsk forskning, USA

Modtaget: May 5, 2011; Accepteret: 22 Juli 2011; Udgivet: 17 August, 2011

Copyright: © 2011 Nagoor et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af universitetet i Malaya Postgraduate Research Grant (PPP) (PS166-2008B), Ministeriet for Videnskab, Teknologi og Udvikling (MOSTI) eScience Fund (12-02-03-2022), University of Malaya Research Grant (UMRG ) (RG0008 /09BIO), og Center for Natural Product Research and Drug Discovery (cenar) Tilskud (4.911.274). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Forskellige naturlige phytocompounds er blevet screenet og undersøgt udførligt som potentielle anticancer-midler. Ca. 74% af lægemidler, der blev godkendt til behandling af cancer er blevet udvundet fra naturlige kilder, enten skabt af strukturel ændring eller syntetiseret og designet er baseret på naturlige forbindelser som model [1]. De fleste af naturlige anticancermidler tilgængelige til dato er afledt fra planter, dyr, marine organismer og mikroorganismer. Nogle aktuelt anvendte eksempler på plante-afledte forbindelser med potentielle anti-cancer aktiviteter er 1’S-1’acetoxyeugenol acetat og 1’S-1′-acetoxychavicolacetat [2], vincristin, irinotecan, etoposid og paclitaxel, mens bleomycin og doxorubicin er mikrobielle-afledte forbindelser og citarabine, der stammer fra marine kilder [3].

En undergruppe af naturlige forbindelser kendt som limonoids, er stærkt iltet tetracykliske triterpenderivater og er blevet anerkendt for at besidde interessante biologiske aktiviteter. Til dato er mange limonoids blevet isoleret med en lang række af biologiske virkninger, herunder insekt anti-feedant, vækstinhiberende egenskaber og anti-inflammatoriske midler [4]. Adskillige citrus limonoid aglyconer såsom limonin, nomilin, obacunone, isoobacunoic syre og ichangin er for nylig blevet underkastet anti-cancer screeningsprocedurer, og viste sig at inducere signifikant glutathion-S-transferase (GST) og quinin reduktase (QR) aktivitet i lever og tarmslimhinden hos mus og rotter henholdsvis [5] – [6]. Andre rapporter omfatter tegn på, at blandinger af limonoid aglyconer med limonoidglucosider blev lige så potent som tamoxifen til hæmning af spredning af ER-positiv brystcancer celler og en endnu højere styrke mod østrogen-uafhængig brystkræft celler [7]. Limonoids fra ethanolekstrakt af

Azadirachta indica

(neem bark, blade og frø olie) blev også fundet at forårsage celledød af prostata cancer celler (PC-3) ved at inducere apoptose gennem en reduktion i Bd-2-ekspression niveauer svarende med en stigning i Bax niveauer [8]. Salg

i øjeblikket er processen af ​​apoptose og dets relevans i kræft som den foretrukne død på grund af den effektive clearance af apoptotiske celler uden at udløse inflammation er blevet en af de prioriterede felter i kræftforskningen [9]. Nylige undersøgelser udført på limonoids ekstraheret fra

Citrus aurantifolia

viste, at forekomsten af ​​apoptose blev medieret gennem induktion af caspase-3, drevet af indre vej og frigivelse af cytochrom-c i humane bugspytkirtelkræftceller [10 ]. Den naturlige limonoid, erythrocarpine E (CEB4), som blev brugt i dette studie, er en A, B, D-seco heptacyclic limonoid med en cinnamoylgruppe som sidekæden ved C-3 ekstraheret fra barken af ​​

Chisocheton erythrocarpus

Hiern fra MELIACEAE familien, almindeligt kendt som »Rongga« i Malaysia. Det er for nylig blevet påvist, at CEB4 inducerer cytotoksisk aktivitet mod P-388 murine leukæmiceller på IC

50 af 16,0 ug /ml [11]. I denne undersøgelse blev CEB4 undersøgt for dens potentiale til at inducere apoptose i HSC-4 human oral pladecellekræft (SCC).

Materialer og metoder

Plantemateriale

Chisocheton erythrocarpus

Hiern blev indsamlet fra Hutan Simpan Terenas, Kedah, Malaysia. Prøven blev identificeret af Mr. Teoh Leng Eng fra Institut for Kemi, Det Naturvidenskabelige Fakultet, Universitetet i Malaya. En voucher eksemplar (KL 4863) blev deponeret i Institut for Kemi Herbarium, University of Malaya.

Reagenser

Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) og Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI- 1640) med 4,5 g glucose /l, 300 mg /l L-glutamin, 2,5% (vol /vol) trypsin i modificeret Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) uden calcium eller magnesium, føtalt bovint serum (FBS), og alle antibiotika blev indkøbt fra Lonza Inc., USA. Dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT) reagens, annexin V-fluoresceinisothiocyanat (FITC) apoptosis afsløring kit, propidiumiodid (PI), RNase og SuicideTrack ™ DNA Ladder Isolation kit blev indkøbt fra Calbiochem (CA, USA).

Udvinding og isolering Naturlig Compound

Tørret jorden bark (1,3 kg) af

Chisocheton erythrocarpus

blev udtrukket successivt med hexan, dichlormethan og methanol. Hver ekstrakt blev derefter tørret

i vakuum

. Den tørrede dichlormethan ekstrakt (4,0 g) blev underkastet fraktionering ved silicagelsøjlekromatografi under anvendelse af en opløsningsmiddelblanding af hexan-ethylacetat. Polariteten af ​​den mobile fase blev forøget gradvist til 100% ethylacetat. Fraktionen elueret fra 30% ethylacetat, der indeholdt målforbindelsen, blev adskilt ved præparativ tyndtlagschromatografi (TLC) med hexan-ethylacetat (7: 3). Hvilket gav erythrocarpine E (4,7 mg)

cellelinier og dyrkningsbetingelser Salg

Et sæt på fem humane tumorcellelinier blev anvendt i denne undersøgelse, der omfatter HSC-4, HSC-2 orale tumorcellelinier og Ca Ski cervikal tumorcellelinie opnået fra Cancer Research initiativ Foundation (CARIF, Malaysia), MCF-7 bryst adenocarcinom og HepG2 leverkarcinom som blev opnået fra University of Malaya Medical center (UMMC), og normale humane bronchieepithelceller (NHBE) (Lonza Inc., USA), der anvendes som en normal cellekontrol. Til rutinemæssig vedligeholdelse HSC-4, HSC-2, Ca Ski og HepG2-celler blev dyrket i DMEM og MCF-7-celler blev dyrket i RPMI-1640, med begge medietyper suppleret med 10% (vol /vol) FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. NHBE-celler blev dyrket med bronchieepithelceller basalmedium (BEBM) med 10% (vol /vol) FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Celler blev dyrket som monolag ved 37 ° C i fugtig atmosfære med 5% CO

2/95,% luft.

MTT cellelevedygtighed Assay

De cytotoksiske virkninger af CEB4 på alle cellelinier blev bestemt ved anvendelse af MTT-assayet metode. CEB4 blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) til en slutkoncentration på 10 mM. Kortvarigt 1,0 x 10

4 celler pr 100 pi medier blev podet i hver brønd på en plade med 96 brønde i nærvær eller fravær af CEB4 i slutkoncentrationer på 5 uM til 40 uM i op til 24 timer. MTT (5 mg /ml) blev tilsat til hver brønd (10 pl /brønd), og pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 2 timer. Efter inkubation blev mediet erstattet med 200 pi DMSO, og absorbansen blev målt ved 570 nm for hver brønd under anvendelse af en mikropladelæser (Tecan Sunrise, Schweiz).

Annexin V-FITC /PI Analyse

påvisning af apoptose blev udført under anvendelse af Annexin V-FITC /PI apoptose detektion kit ifølge producentens protokol. Kort beskrevet både CEB4 behandlede og ubehandlede HSC-4 og NHBE-celler blev høstet ved trypsinisering, vasket i 1 x PBS og farvet med annexin V-FITC konjugat og PI. Celler blev derefter analyseret ved flowcytometri (BD FACSCalibur ™, USA) under anvendelse BD CellQuest erhvervelse og analysesoftware.

DNA fragmentation assay

Totalt DNA blev ekstraheret fra både ubehandlede og behandlede celler med CEB4 for 12 og 24 timer ved hjælp af SuicideTrack ™ DNA Isolation Kit ifølge producentens protokol. Isoleret DNA blev analyseret på en 1% (vægt /volumen) agarosegelelektroforese og farvet med ethidiumbromid. Fragmentering af DNA blev observeret under UV-belysning ved anvendelse af en gel dokumentationssystem (Alpha Inotech, USA).

Western Blotting

CEB4 behandlet HSC-4-celler blev dyrket til en celledensitet på 80-90 % sammenflydning, vaskes med iskold 1x PBS og proteinerne ekstraheret under anvendelse af NE-PER® Nuclear og cytoplasmiske Extraction Kit (Pierce, USA). Proteinkoncentrationer blev bestemt under anvendelse af Bio-Rad DC-proteinassay (Bio-Rad Laboratories, USA). Lige store mængder protein blev underkastet 12% SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran. Membranerne blev efterfølgende inkuberet med ni primære antistoffer mod β-actin, poly-ADP ribose polymerase (PARP), p53, phospho-p53, muse dobbelt minut 2 (MDM2), Bax, Bcl-2, procaspase-3 og procaspase-9 . Efter vask i Tris-bufret saltvand og Tween-20 (TBST) puffer, peberrodsperoxidase (HRP) -bundet sekundære antistoffer blev tilsat, og bundne proteiner blev påvist gennem forøget kemiluminescens-signaler under anvendelse af røntgenfilm. Relative intensiteter af alle bånd blev kvantificeret ved hjælp af billedanalyse software (NIH ImageJ v1.43, National Institutes of Health, USA).

Statistisk analyse

Alle resultater blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse. af data indhentet fra tre uafhængige forsøg. Den statistiske signifikans mellem forskellige grupper blev bestemt ved hjælp af en-vejs ANOVA. Signifikante forskelle blev betragtet som p ≤ 0,05.

Resultater

Isolering og karakterisering af Erythrocarpine E (CEB4)

CEB4 (erythrocarpin E) blev isoleret som hvidt amorft pulver. Molekylformlen var C

36H

40º

10, der blev bestemt ud fra [M + H]

+ top ved m /z 633,2703 i høj opløsning hurtigt atombombardement massespektrometri (HRFABMS) . De infrarøde absorptioner ved 3413 cm

-1 og 1700-1730 cm

-1 indikerede tilstedeværelsen af ​​hydroxyl og forskellige carbonylgrupper. I

1H NMR spektrum blev typiske toppe er forbundet med limonoid skelet identificeret. Den furan sidekæde på δ 7,64 (

s

), δ 6,29 (

brs

), og δ 7,30 (

d

, J = 1,5 Hz) blev tilskrevet H-21, H-22 og H-23, hhv. Signaler forbindelse iltet methin- protoner af H-3 ved δ 4,91 (

d

, J = 10,2 Hz) og H-17 ved δ 5,46 (

s

) var let differentieret og tildeles på grundlag af signalet multiplicitet. På den anden side blev forekomsten af ​​en oxygen bro, der forbinder C-1 til C-29 anses sjældne [11]. De isolerede diasterotopic methylenprotoner af H

2-29 blev påvist som et par af dubletter ved δ 3,46 og δ 3,88, med en koblingskonstant på 9,3 Hz. På allylalkoholen underkonstruktion, blev den olefiniske signal findes ved δ 5,53 (dd, J = 1,7, 7,1 Hz). Cinnamatet sidekæde ved C-3 blev bekræftet ved tilstedeværelsen af ​​fem aromatiske protoner i regionens δ 7,10-o 7,20 og karakteristiske dublet signaler af H-2 ‘og H-3’ ved δ 6,25 (

d

, J = 16,0 Hz) og δ 7,58 (

d

, J = 15,7 Hz). Den relative stereostruktur af erythrocarpin E blev etableret gennem nukleare Overhauser effekt spektroskopi (NOESY). Den kemiske struktur af CEB4 er vist i figur 1.

CEB4 Hæmmer spredning af HSC-4 Cells

MTT analyser blev udført for at vurdere de cytotoksiske egenskaber og hæmmende koncentration (IC

50) værdier af CEB4 på fem menneskelige tumor og NHBE normal cellelinjer. Resultaterne indikerede, at CEB4 inducerer cytotoksicitet i en dosis og tid afhængig måde over en 40,0 uM behandlingsregime og 24 timers eksponering (fig. 2A og 2B). Minimale cytotoksiske virkninger blev observeret på NHBE-celler, hvor ca. 20,0% drab blev observeret under lignende betingelser behandling, i modsætning til 95% drab i HSC-4-celler med den laveste IC

50 registrerede værdier på 4,0 ± 1,9 uM blandt alle celle linjer testet (tabel 1). Levedygtighed celler behandlet med DMSO uden CEB4 blev ubetydeligt påvirket ( 1,0%) (. Figur 2A og 2B) for derved udelukker inddragelse af opløsningsmiddel-induceret cytotoksicitet. Både tid og dosisafhængige analyser støttede behovet for yderligere at undersøge de apoptotiske virkninger af CEB4 og dens potentiale som en anti-tumor lægemiddel til behandling af oral cancer. Alle de følgende eksperimenter blev udført baseret på IC

50 værdier som opnået fra vores nuværende MTT data, og er opsummeret i tabel 1.

(A) dosisafhængig MTT assay graf på 24 timer af CEB4 udsættelse. (B) Tid afhængig MTT assay graf ved behandling med 40,0 pM CEB4. Alle resultater blev udtrykt som totale procentdel af levedygtige celler med middelværdi ± SD af tre uafhængige bestemmelser. Opløsningsmiddel kontrol ved hjælp af DMSO blev udført på HSC-4 celler som repræsentant for alle andre cellelinjer.

CEB4 fremkalder apoptose Mediated celledød i HSC-4 Cells

Vi næste undersøges, om de CEB4 cytotoksiske virkninger blev medieret gennem apoptose. En stigning i cellulær farvning med FITC-konjugeret annexin-V tjener som en tidlig markør for apoptose. Celler blev samtidigt farvet med PI at undersøge tab af cellemembranens integritet. Denne dobbelte farvning procedure adskiller tidlig fase apoptotiske celler (annexin V-positive) fra slutningen af ​​fase apoptotiske celler (annexin V-positive, PI positiv). Behandling af HSC-4-celler ved IC

50 koncentrationer af CEB4 viste sig at inducere apoptotisk celledød gennem observation af et skift i levedygtig cellepopulation fra tidligt til sent tidspunkt i apoptose, efterfulgt af sekundær nekrose (fig. 3B). Procentdelen af ​​levedygtige celler faldt fra 99% til 51%, mens tidlig og sen fase apoptotiske celler steg til 21% og 45%. Den totale procentdel af apoptotiske HSC-4-celler var 63% efter 12 timer. Ingen population skift blev observeret i NHBE celler efter lignende CEB4 behandling (fig. 3A).

ubehandlede celler (øverste panel) og behandlede celler (nederste panel) efter CEB4 behandling hos IC

50 koncentrationer for 12 h. Kvadranter var udformet således, I: ikke-farvede celler angiver levedygtige celler; II: annexin V-FITC farvede celler indikerer tidlig apoptose; III: annexin V-FITC og PI farvede celler indikerer sen apoptose; og IV: PI farvede celler indikerer sekundær nekrose. Alle dot plots er en repræsentation af lige cellepopulationer (n = 10.000).

CEB4 Fremkalde Endonuclease- og caspase-spaltning af DNA og PARP Henholdsvis

På grund af den forskelligartede måde og kendetegnende, hvor processen af ​​apoptose kan manifestere undersøgte vi også induktion af apoptose i HSC-4-celler gennem forekomsten af ​​DNA fragmentation og spaltning af PARP-proteiner. Vi observerede, at DNA ekstraheret fra ubehandlede HSC-4-celler viste ingen fragmentering, mens DNA fra CEB4-behandlede HSC-4-celler (12 og 24 h) viste DNA laddering med ca. 200 bp intervaller formentlig som et resultat af endonuclease action på steder mellem nucleosomer (fig. 4A). Den mistænkte inddragelse af caspase-3 aktivering i CEB4-induceret apoptose blev også valideret gennem udtryk og nedbrydning af en nuklear protein, PARP. Proteolytisk spaltning af fuld længde PARP fra en 116-kDa-polypeptidet til en 85-kDa fragmentet er en typisk markør for indtræden af ​​apoptose, og blev observeret på en tidsafhængig måde i HSC-4-celler behandlet med CEB4 (fig. 4B). Derfor blev de apoptose-inducerende effekter af CEB4 på HSC-4-celler bekræftet.

Der blev imidlertid ikke tydelige fragmenteringer observeret i bane 1 indikerer fravær af apoptose i modsætning til bane 2 (12 h) og 3 ( 24 h). (B) PARP nedbrydning blev observeret ved forskellige CEB4 inkubationsperioder. Ens mængder af cellulære proteiner blev underkastet SDS-PAGE, og PARP nedbrydning fra sin native form (116 kDa) for det kløvede formen (89 kDa) blev påvist ved Western blot analyse.

Ekspression af p53 og andre p53-Related apoptotiske proteiner

Western blotting-analyse af CEB4 behandlet HSC-4-celler blev udført for at undersøge status for p53 og p53-relaterede apoptotiske proteiner. Resultaterne viste, at ved CEB4 behandling blev phosphoryleret p53 forhøjet, mens niveauet af p53-inhibitor, MDM2, faldt over 12 timer (fig. 5A). Det totale p53 niveauet var konsistent i HSC-4-celler og forblev uændret på CEB4 eksponering. Protein ekspressionsniveauer af det pro-apoptotiske Bax-proteinet øget efter 12 timer af CEB4 behandling. På den anden side blev niveauet af anti-apoptotiske Bcl-2-protein fundet at falde sammen med ændringen i Bax (fig. 5B). Vi undersøgte også downstream caspaser, og fandt, at mængden af ​​initiator procaspase-9 og bøddel caspase-3 zymogen faldt samtidigt ved CEB4 eksponering, hvilket indikerer den aktiverede spaltning af procaspase-9 og caspase-3 zymogen (fig. 5C).

Celler blev inkuberet med CEB4 til 6 og 12 timer, høstet i lysispuffer og underkastet SDS-PAGE. Protein-ekspressionsniveauer blev undersøgt ved Western blot-analyse og kvantificeret under anvendelse af ImageJ software anvender β-actin som en normalisering kontrol. (A) Analyse af p53 og MDM2 inhibitor niveauer. (B) Analyse af anti-apoptotiske Bcl-2 og pro-apoptotiske Bax proteinniveauer. (C) Analyse af initiator procaspase-9 og effektor caspase-3 zymogen niveauer. Kvantificering af normaliserede protein niveauer mod β-actin vises på højre paneler.

Diskussion

Processen af ​​apoptose er blevet den ønskede rute for kræftceller til at dø, og er normalt karakteriseret ved morfologiske og biokemiske ændringer såsom membranblæredannelse, cellulær krympning, chromatinkondensering, aktivering af kaskader af proteaser, såsom caspaser og endonukleaser, spaltning af PARP [12] og fragmentering af genomisk DNA [13]. Apoptotisk celledød er foretrukket, fordi den ikke involverer den pludselige frigørelse af proinflammatoriske mediatorer, som i processen med nekrose [14]. Induktionen af ​​apoptose og hæmning af cancercelleproliferation er blevet anvendt som referencepunkter i evalueringen af ​​fytokemiske anti-cancer-aktiviteter, hvor i de sidste mange kemoterapeutiske midler har vist sig at bevirke forstyrrelse i cellecyklusprogression eller induktionen af ​​apoptose i tumorceller [15].

I denne undersøgelse beviser fra MTT-baserede cellelevedygtighed tests viste, at erythrocarpine E (CEB4) inducerer både tid og afhængig dosis cytotoksiske virkninger på alle tumor testede cellelinjer, med effekt er størst i HSC-4-celler. Denne observation opfordrer yderligere undersøgelser af de apoptotiske virkninger af CEB4 og dens potentiale som en anti-tumor lægemiddel til behandling af oral cancer. På dette stadium, epitel-lignende oprindelse NHBE som besidder ligheder til HSC-4 tjener blot som et første

in vitro

kontrol for lægemiddelscreening formål, mens de faktiske fysiologiske bivirkninger af CEB4 kan kun evalueres gennem

in vivo

undersøgelser. De minimale cytotoksiske virkninger af CEB4 på NHBE celler (hvor levedygtighed celle niveauer forblev over 80% ved behandling) give en foreløbig indikation sikkerhed for dens videre udvikling som et kemoterapeutisk middel. blev også udført tre typer af assays for at bekræfte celledød mekanisme CEB4 på HSC-4-celler: annexin V-FITC, PARP-spaltning og DNA-fragmentering assays. De kombinerede resultater af disse tests viser, at cytotoksicitet induceret af CEB4 resultater fra induktion af apoptose.

Det næste relevante spørgsmål ville være at bestemme, hvordan CEB4-afhængig apoptose medieret på molekylært niveau? To hovedruter af programmeret celledød kan skelnes: den ydre og indre veje. Virkningen af ​​p53 er indirekte relateret til den indre celledød vej, hvor det stimulerer et bredt netværk af signaler, der fungerer dels gennem Bcl-2-familien signaleringskaskade [16]. Tidligere rapporter har indikeret, at mutationer i p53 spiller en afgørende rolle i kræft initiering og er meget fremtrædende i sin kobling til kræft såsom tyktarms-, lunge-, spiserør, bryst, lever, hjerne, reticuloendotheliale væv og bloddannende væv [17].

Western blotting-resultater viser en stigning i niveauet af phosphoryleret p53 og en reduktion af dets inhibitor, MDM2 tyder på, at måden for induktion af apoptose ved CEB4 medieres gennem den indre vej. Dette forstærkes yderligere af bemærkninger om mitokondrielle proteiner, hvor en stigning i pro-apoptotiske protein niveauer, Bax og reduktion af anti-apoptotiske protein niveauer, Bcl-2 blev set. Forholdet mellem Bcl-2 og Bax reguleret induktion af apoptose ved at dimerisere med hinanden og derved udløser frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier [18] – [19]. Foruden CEB4, andre naturlige forbindelser, der har vist effekter på induktionen af ​​p53-medieret apoptose var curcumin, resveratrol, anthocyaniner og capsaicin [20]. Tidligere undersøgelser af limonoid-baserede forbindelser fra

Citrus aurantifolia

er også blevet vist at inducere apoptose gennem p53 inaktivering [10], [20].

Virkningsmekanismen af ​​cytostatika ikke udelukkende omfatte funktioner såsom celle krympning og DNA-fragmentering, men også aktivering af p53 signalmolekyler, der fører til aktivering af en kaskade af caspase indsats [21]. Caspase kaskader kan udløses gennem to store grene, enten gennem celleoverflade-TNF-superfamilien dødsreceptorer og den drejelige adapter protein Fas aktiveret dødsdomæne (FADD), der fører til aktivering af caspase-8 og i sidste ende caspase-3, eller via frigivelse af cytochrom c (Cytc) fra mitochondrier resulterer i caspase-9-aktivitet og efterfølgende caspase-3 handling. Caspase-3, repræsenterer en konvergens mellem de to ruter, og til gengæld fremkalder PARP spaltning, kromosomale DNA pauser og endelig fordelingen af ​​cellen i apoptotiske organer [22]. Vores resultater antyder, at CEB4 udøver sine apoptotiske virkninger ved at virke på caspase-9 og -3, hvor niveauet for fuldlængde procaspase-9 og caspase-3 zymogen er faldet på CEB4 eksponering, hvilket resulterer i spaltede, aktiverede former af caspase-9 ( 37 kDa og 10 kDa) caspase-3 (17 kDa og 12 kDa). Imidlertid apoptotisk signaltransduktion involverer død receptor signalering, hvilket resulterer i aktiveret initiator caspase-8, som igen aktiverer zymogen caspase-3 kan ikke udelukkes. Mediering af celledød via denne rute kan forklare observationen af ​​en tidlig fald ( 6 h) i procaspase-3 niveauer før ændringer i Bcl-2 og Bax, som forekommer ved 12 timer (figur 5b og 5c.). Det kunne også betyde, at inddragelsen af ​​den indre vej tjener som en forstærkning skridt mod indledende død signalering via ydre vej ved CEB4 eksponering.

Vi konkluderer, at CEB4 inducerer cytotoksicitet gennem apoptotisk celledød i HSC-4 oral cancer celler, og at induktionen af ​​apoptose forårsaget af aktivering af p53, som udløser indre vej gennem Bcl-2 og Bax, og endelig gennem caspase-9 og -3 aktivering. Vores data viser potentiale for udvikling af CEB4 som en ny potentiel anti-cancer medicin mod human oral cancer, selv om det videre arbejde med

in vivo

sikkerhedsmæssige effekter og farmakokinetiske er nødvendig, før CEB4 kan blive fuldt evalueret i en klinisk indstilling.

Tak

Vi vil gerne anerkende Datuk Prof. Dr. A. Hamid A. Hadi fra Center for Natural Product Research and Drug Discovery, University of Malaya for hans bidrag til opdagelsen af ​​CEB4 forbindelse. Også, Ms Norahayu Othman og Ms. Yap Seow Hui fra Biologisk Institut, University of Malaya for deres bidrag i løbet af cytotoksicitet screening og sti analyse af denne undersøgelse.