PLoS ONE: Kombination mTOR Hæmning med Stråling Forbedrer antitumoraktivitet i Blære Cancer celler in vitro og in vivo: A Novel strategi for Treatment

Abstrakt

Formål

Strålebehandling for invasiv blærekræft tillader for orgel konservering men toksicitet og lokal kontrol er fortsat problematisk. Som sådan forbedrer effektiviteten af ​​behandlingen kræver radiosensibilisering af tumorceller. Formålet med undersøgelsen er at undersøge, om den mammalian target of rapamycin (mTOR), en nedstrøms kinase af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT overlevelse pathway, kan være et mål for strålingssensibilisering.

Eksperimentel udformning

klonogene assays blev udført ved hjælp af 6 blære kræft cellelinier (UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, KU7, 253J-BV, og 253-JP) for at undersøge virkningerne af ioniserende stråling ( IR) alene og i kombination med RAD001, en mTOR-inhibitor. Cellecyklusanalyse blev udført under anvendelse af flowcytometri.

In vivo

, atymiske mus blev subkutant injiceret med 2 blærekræft cellelinjer. Behandling respons med RAD001 (1,5 mg /kg, dagligt), fraktioneret IR (total 9Gy = 3Gy × 3), og kombinationen af ​​RAD001 og IR blev fulgt over 4 uger. Tumor vægt blev målt til eksperimentel endpoint.

Resultater

klonogene assays viste, at i alle blære cellelinjer testet, blev en additiv virkning observeret i den kombinerede behandling i forhold til enten behandling alene. Vores data indikerer, at denne virkning skyldes standse i både G1 og G2 faserne af cellecyklussen når behandlinger kombineres. Desuden vores data viser, at denne arrestation primært er reguleret af ændringer i niveauet af cyclin D1, p27 og p21 følgende behandlinger.

In vivo

, et signifikant fald i tumorvægt blev observeret i den kombinerede behandling sammenlignet med enten alene behandling eller kontrol.

Konklusioner

Ændring cellecyklus ved at hæmme mTOR signalering vej i kombination med strålebehandling har gunstige resultater og er en lovende terapeutisk modalitet for blærekræft

Henvisning:. Nassim R, Mansure JJ, Chevalier S, Cury F, Kassouf W (2013) kombinere mTOR Hæmning med stråling Forbedrer Antitumor Aktivitet i Blære Cancer Cells

In vitro

In Vivo

: A Novel strategi for behandling. PLoS ONE 8 (6): e65257. doi: 10,1371 /journal.pone.0065257

Redaktør: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, USA

Modtaget: 24. februar, 2013; Accepteret: April 24, 2013; Udgivet: 17 juni 2013

Copyright: © 2013 Nassim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt bliver finansieret af en bevilling fra den canadiske Institute of Health Research (CIHR) tilskud MOP 89796. Dr. W. Kassouf er en modtager af en klinisk forskning lærd pris fra Fonds de recherche du Québec-Santé (FRSQ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Det mTOR-hæmmer RAD001 blev venligst stillet til rådighed af fabrikanten, Novartis. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Blærekræft er en meget udbredt sygdom i Nordamerika. I 2012 blev der 55.000 mænd og 18.000 kvinder diagnosticeret med blærekræft; 1 ud af 5 mænd og 1 ud af 4 kvinder vil dø af deres sygdom [1]. . Radikal cystektomi som består af fuldstændig fjernelse af blæren, forbliver “gold standard” behandling af invasiv blærecancer [2]. Strålebehandling er et attraktivt alternativ, da det bevarer blæren og muliggør normale urin og seksuelle funktioner [3]. Manglen på lokal kontrol af sygdommen samt signifikant toksicitet, der er forbundet med strålebehandling stadig problematisk [4] – [6]. For at forbedre effektiviteten, blev adskillige kliniske forsøg med orgel-besparende ledelse udført for at teste effekten af ​​kombineret kemoterapi og stråling [7], [8]. Men trods mange anstrengelser, forbliver chemoradiation undersøgelser forbundet med suboptimal lokal kontrol af sygdomme og mindske overlevelse sammenlignet med radikal kirurgi. Som sådan er der et tvingende behov for at øge strålingssensibilisering for blærekræft for at øge effektiviteten ved at forbedre lokal kontrol af sygdomme og giver mulighed for dosisreduktion for at reducere toksicitet strålebehandling.

En signalering molekyle, der er yderst attraktiv og har nylig trukket meget opmærksomhed til målrettet terapi er pattedyr mål for rapamycin (mTOR). Mere specifikt mTOR er en nedstrøms serin /threoninproteinkinase af phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /AKT pathway, der spiller en kritisk rolle i onkogenese [9], [10]. Deregulering af PI3K /AKT /mTOR pathway genererer et gunstigt onkogen miljø og er blevet dokumenteret i en række humane tumorer, herunder blærekræft [11]. mTOR hæmning blev et aktivt område af forskning for at udvikle og afprøve små hæmmende molekyler såsom rapamycin analoger -notably RAD001 (Everolimus, Novartis) og CCI-779 (Torisol, Wyeth) til behandling af forskellige sygdomme, herunder kræft. For nylig blev den kliniske første vellykkede fase III forsøg med et mTOR-hæmmer realiseret i patienter med fremskreden renalcellecarcinom, som oplevede en forbedring af den samlede overlevelse [12]. Vi har for nylig offentliggjort den første rapport viser signifikant antitumoraktivitet

via

hæmme mTOR med RAD001 i blæren kræftmodeller

in vitro

in vivo

[13]. Interessant var bemærkelsesværdige forskelle i følsomhed til mTOR hæmning bemærket blandt ni menneskelig blære cancer cellelinjer. Endvidere var der ingen sammenhæng mellem aktiverede AKT og mTOR niveauer med celle aggressive funktioner. Dette var imidlertid ikke tilfældet for aktiveret S6 hvis niveau dukkede højere i RAD001 følsomme i forhold til relativt resistente cellelinier. Af interesse, har nogle undersøgelser rapporteret, at mTOR inhibering kan sensibilisere tumorer i prostata, bryst, og hjernen for ioniserende stråling [14] – [16]. Da stråling viste sig at aktivere PI3K /Akt overlevelse /vækst vej, som kan være ansvarlig for celledød flugt og radioresistance [17], [18], kan samtidig mTOR hæmning potentielt overvinde modstand mod stråling i blærekræft. For at følge op på denne hypotese, den foreliggende undersøgelse undersøgt virkningerne af at kombinere RAD001 og ioniserende stråling,

in vitro

in vivo

på celle overlevelse og vækst i en vifte af blærekræft celle linjer. Derudover har vi forsøgt at kaste lys over den mekanisme, som denne kombination af behandlinger kan hæmme tumorvækst.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle etiske standarder i forbindelse med brugen af ​​vores dyr xenograftmodel var fuldt fulgt og respekteret. Den McGill University Health Centers Facility Animal Care Udvalget godkendte vores dyr protokoller (protokol # 5428) før begyndelsen af ​​studiet. Desuden blev dyrene vedligeholdes og holdes i state-of-the-art faciliteter, der følger de strenge procedurer for dyr forskning, som omfatter konstant overvågning og inspektion af dyrene og brugerne.

Cell kultur

UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, og KU7 cellelinjer blev karakteriseret og leveret af Specimen kerne af Genitourinary specialiserede programmer for Forskning Excellence i blærekræft på MD Anderson cancer center [19]. Den 253-JP og 253J-BV blev venligst stillet til rådighed af Dr. Colin P.N. Dinney fra M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas [20]. Cellelinierne blev rutinemæssigt dyrket ved 37 ° C i en CO 5%

2 inkubator opretholdt i Eagles minimale essentielle medium (EMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) (Wisent, Saint-Jean-Baptiste QC) og passage, når nåede 80% sammenflydning. MTOR inhibitor RAD001 blev venligst stillet til rådighed af fabrikanten, Novartis.

klongenicitetsassayet

Celler blev podet i en 6-brønds plade med en tæthed på 200 celler per brønd og holdt i vækstmediet . Når den er tilsluttet, blev de behandlet med RAD001 ved doser svarende til GI50 for hver cellelinie som tidligere beskrevet [13]: UM-UC3 (75 nM), KU7 (50 nM), 253J-BV (8 nM), 253- JP (8 nM), UM-UC5 (0,5 nM) og UM-UC6 (0,5 nM) og holdt ved 37 ° C i en CO 5%

2 inkubator i 12 timer. Dette blev efterfulgt af strålebehandling ved forskellige doseringer, med og uden RAD001. Kontroller indbefattede ubehandlede celler sammen med celler behandlet med hver af stråling og RAD001 behandling alene. Celler blev yderligere dyrket ved 37 ° C og fik lov til at danne kolonier i 10-14 dage. En omtrentlig afskæring på 50 levedygtige celler /koloni blev valgt. Cellerne blev vasket med phosphat balanceret saltopløsning (PBS) og fikseret i 15 minutter under anvendelse af 3,7% formaldehyd i PBS. Efter en anden PBS vaske blev celler farvet med krystalviolet (0,4% vægt /volumen i PBS; Fisher Scientific, Waltham, MA) og venstre at lufttørre før tælling af kolonier. Hver behandling bestod af dobbelte brønde i en 6-brønds plade, og forsøget blev udført to gange. Den overlevende fraktion blev beregnet som (middel kimtal ved slutningen af ​​forsøget) /(celler podet ved begyndelsen) × (udpladningseffektivitet). Udpladningseffektiviteten blev defineret som (middel kimtal) /(celler udpladet i ikke-udstrålede kontrol). De ikke-bestrålede celler blev anvendt som kontrol.

Flowcytometri

Celler blev podet i dyrkningsplader og fik lov at vedhæfte. RAD001 blev tilsat til de passende prøver 12 timer før stråling i en dosis ækvivalent med GI50 for hver cellelinie. Dette blev efterfulgt af en dosis af 4Gy af ioniserende stråling (baseret på tidligere bestemte følsomhed eksperimenter), og cellerne blev yderligere dyrket i 48 timer. Celler blev derefter trypsiniseret, vasket en gang med PBS og fikseret med 100% kold ethanol i 60 minutter ved 4 ° C. Efter centrifugering blev cellepellets resuspenderet i en opløsning af propidiumiodid (PI) (50 g /ml, Invitrogen, Carlsbad, CA) i PBS suppleret med RNase (100 g /ml; Invitrogen, Carlsbad, CA) overføres derefter til fluorescens -aktiverede cellesortering (FACS) rør og inkuberet i mørke i 30 minutter ved 40 ° C for at tillade propidiumjodid indtag i kernen. PI indtagelse blev derefter vurderet under anvendelse af en Coulter flowcytometer (BD Biosciences, Franklin, NJ).

Western blot-

Celler blev dyrket og behandlet i henhold til ovenfor beskrevne regime (RAD001, ioniserende stråling, og begge i kombination), med ubehandlede celler tjener som kontroller. Efter behandlinger, blev celler skrabet på is og resuspenderes i 30 minutter ved 4 ° C i koldt RIPA (lysis) puffer indeholdende en cocktail af phosphatase og proteasehæmmere (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Cellesuspensioner blev derefter centrifugeret for at opsamle klare lysater i supernatanten. Proteinkoncentrationen blev målt ved bicinchoninsyre (BCA) assay (Pierce Scientific-Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Proteinprøver (40 ug-60 ug) blev underkastet polyacrylamidgelelektroforese som tidligere beskrevet [13]. Proteiner i gelerne blev overført til membraner, blokeret med en 5% fedtfri mælk og /eller 5% bovint serumalbumin-opløsning, og immuno-blottet med de følgende monoklonale primære antistoffer (alle kanin): phospho-AKT, total AKT, phospho S6, total S6, p21, p27KIP1, og cyclin D1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) ved koncentrationer anbefalet af producenten. Membranerne blev derefter inkuberet med de passende anti-kanin sekundære antistoffer og et ECL kemiluminescens påvisningssystem (Amersham-GE Healthcare, Piscataway, NJ) blev anvendt til at afsløre proteinbånd af interesser på røntgenfilm. Filmene blev scannet og protein niveauer blev normaliseret mod actin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), en kontrol 42 kDa husholdning protein til stede i alle prøver og tjente som vores lastning kontrol.

In vivo-xenograftmodel

Alle protokol godkendelser blev opnået før igangsættelsen af ​​undersøgelsen fra Animal Care udvalg af McGill University Health center. Kvinde athymiske mus (nu /nu-stamme, 4-6 uger gamle, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) blev anvendt til vores xenograft blærecancer model, som tidligere rapporteret [13]. Kort beskrevet blev mus injiceret subkutant med KU7 (10

6 celler pr injektion). Et andet forsøg med den samme metode blev udført ved hjælp af de 253J-BV blærekræft cellelinjer. For at lette adhæsion blev celler suspenderet i 200 pi Matrigel (BD Biosciences, Franklin, NJ) før injektion. Tumorer fik lov til implantere og vokse i en uge før randomisering i 4 grupper svarende til de forskellige behandlingsarme, med hver gruppe bestående af 14 mus. Den 1

st gruppe blev behandlet med placebo (5% glucoseopløsning i vand). De 2

nd gruppe fik RAD001 oralt (mikroemulsion fortyndet i 5% glucoseopløsning) i en dosis på 1,5 mg /kg dagligt. I 3

rd gruppe blev tumorer udsættes for ioniserende stråling ved en fraktioneret dosis på i alt 9 Gy (3 × 3Gy) hver anden dag i den første uge af behandlingen. I 4

th gruppe blev mus givet RAD001 ved den ovennævnte dosering 1 dag før starten af ​​tumoren strålebehandling. Mus blev fulgt i 4 uger fra starten af ​​behandlinger. Kropsvægt og dyrenes adfærd blev overvåget gennem hele eksperimentet. Tumorer blev målt (længde og bredde) to gange om ugen med en Vernier skydelære for at beregne volumen (V = [(længde x bredde

2) × (π /6)] som tidligere beskrevet [13]. Mus blev aflivet i en CO

2 kammer i slutningen af ​​behandlingen. Tumorer blev høstet, straks vejet og bevaret faste eller fryses til fremtidige undersøgelser.

Immunhistokemi

Tumor sektioner blev opnået fra mus behandlet med placebo, stråling, RAD001 og kombinationen regime. de paraffinindlejrede tumorer snit blev monteret på objektglas til farvning. efter de-paraffinization og hydratisering, blev antigen-genvinding udført i opvarme prøverne med 5% citratbufferopløsning (pH 7,0). sektionerne blev inkuberet natten over ved 4 ° C med et p21-specifikt antistof (fortynding 1:25). HRP-konjugeret gede-polyklonalt anti-kanin IgG sekundært antistof blev tilsat og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time. 3,3′-diaminobenzidin ( DAB) substrat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) blev anvendt til farveudvikling i overensstemmelse med producentens anvisninger. Slides blev set under et Leica Diaplan omvendt mikroskop udstyret med et Leica DFC300FX kamera (Leica, Wetzlar, Tyskland). Billeder blev taget med et Leica Application Suite. Analyse baseret på et gennemsnit af 5 foci, ved 40 × forstørrelse, som viser levedygtige celler, og en beregnet H-score blev beregnet som summen af ​​produkter af de procentvise celler farvet ved en given farvning intensitet (0-100) og farvningsintensitet (0 for negativ farvning, 1 for lav og 2 for høj farvning).

statistisk analyse

t-test (uparret, to-halet) blev anvendt i alle statistiske analyser. Signifikans blev fastsat til p. 0,05

Resultater

Relativ følsomhed af et panel af blærekræft cellelinjer til RAD001 og ioniserende stråling

Vi viste for nylig, at et panel af ni blære cancer cellelinjer udviser relative forskelle i deres RAD001 følsomhed og i overensstemmelse hermed, RAD001 behandling resulterede i relative forskelle i mTOR hæmning og vækst anholdelse, som overvåges af MTT-assays. Med disse data, vi var i stand til at dele vores celler linjer i 3 grupper baseret på deres RAD001 følsomhed [13] som følger: relativt resistent (UM-UC3, UM-UC13, KU7 (GI50≥50 nmol /l)), moderat følsom (253J-P, 253J-BV, RT4 (GI50 50 nmol /l)). og endelig meget følsom (UM-UC1, UM-UC5, UM-UC6 (GI50≤0.5 nmol /l) i denne undersøgelse ser på effekter af kombinerede behandlinger (RAD001 og stråling), blev klonogene assays anvendes til at klassificere de seks cellelinier testet i henhold til deres relative følsomheder til IR til forskellige doser af stråling (fig. 1A). Baseret på disse relative følsomheder for stråling, cellelinjer var inddelt i tre grupper, resistente, moderat resistente, og følsomme. det resistente gruppe omfatter UM-UC5 med den højeste overlevende fraktion, den moderat resistente inkluderet UM-UC13, KU7, UM-UC3, UM-UC6 hvorimod 253J-BV havde en lavere overlevende fraktion og blev derfor defineret som en strålingsfølsom cellelinie. Vi sammenlignede responset af disse seks cellelinier til hver af RAD001 og ioniserende stråling. Baseret på dataene i figur 1B og tabel 1, konkluderede vi, at der ikke er nogen korrelation mellem følsomheden over for RAD001 og følsomheden for ioniserende stråling.

udpladede celler blev udsat for ioniserende stråling for at måle virkningerne på vækst af klonogene assay, som beskrevet i Methods. (A) Baseret på de indsamlede resultater, var vi i stand til at klassificere disse cellelinjer som stråling-følsomme, moderat følsom og -relativt resistente. (B) Den RAD001 IC50 blev plottet mod hældningen af ​​kurven for hver cellelinie i klonogene assay, når de behandles med IR.

Ioniserende stråling aktiverer AKT mens RAD001 hæmmer S6 fosforylering

det er blevet rapporteret, at ioniserende stråling aktiverer AKT i overlevende cellefraktion [17], [21] den. Da dette kan være forbundet med resistens over for behandling, celledød escape og overlevelse, søgte vi at bestemme, om stråling eksponering af blære cancerceller ville føre til AKT aktivering. Til dette formål et relativt resistent cellelinje, KU7, blev udsat for ioniserende stråling over tid (0 til 60 min) og lyseret at analysere Pakt ved direkte Western blotting under anvendelse af phospho-specifikke AKT antistoffer rettet imod S473 phosphoryleringssite. Resultater i figur 2A viser, at ja AKT blev hurtigt aktiveret efter 15 min af strålebehandling og denne aktivering varede ved 30 og 60 min. Disse resultater indebærer, således at KU7 underkastes en aktivering af pro-onkogene overlevelse pathway efter udsættelse for ioniserende stråling. I alle eksperimenter, niveauerne af Pakt øget efter behandling med ioniserende stråling til et maksimum og faldt derefter. Ligeledes som KU7 celler er også relativt RAD001 resistente, blev de behandlet med RAD001 at fastslå, at dets mål mTOR blev inhiberet. Til dette formål blev niveauerne af phosphoryleret S6 bestemmes anvendende et antistof specifikt til serin-rester 240/244 i S6 protein. Som forventet, RAD001 var potent i faldende phosphoryleringsniveauerne på mTOR nedstrøms signalmolekyle og target S6, som vist ved 30 minutter efter behandlingen (fig. 2B) og denne inhibering fastholdes ved 24 timer efter behandling (data ikke vist). Endvidere blev der opnået lignende resultater med andre blærekræft cellelinjer (253J-BV, UM-UC3, og UM-UC6) behandlet med stråling og RAD001 (data ikke vist).

(A) KU7 celler blev behandlet med 4 Gy af ioniserende stråling. Cellerne blev lyseret 15, 30 og 60 minutter efter behandling for at analysere AKT aktivering (p-AKT, øvre række) ved Western blot. Total niveauer af AKT er vist i den nederste række. (B) KU7 celler blev behandlet med 5 Gy stråling, 100 nM RAD001 eller begge dele og lyseret. Niveauer af Akt og S6 phosphorylering blev analyseret ved Western blot. Total niveauer af Akt og S6 ekspression er vist. Lignende resultater blev opnået, når 253J-BV, UM-UC3, og UM-UC6 blev behandlet med stråling og RAD001 alene og i kombination (data ikke vist).

kombinere RAD001 med ioniserende stråling reducerer koloni betydeligt dannelse

at give indsigt i effekter af at kombinere RAD001 med ioniserende stråling på blærekræft cellelinjer, vi overvågede den del af overlevende celler over tid ved hjælp af klonogene assays. Efter behandling blev udpladede celler overvåget over tid, og antallet af kolonier blev talt. Den RAD001 dosis blev opretholdt på GI50 for hver cellelinie, mens dosis stråling blev varieret. I alle cellelinjer testet (253J-BV, UM-UC6, KU7, UM-UC3, UM-UC13, og UM-UC5), blev der observeret et signifikant fald i antallet af kolonier for celler behandlet med kombinationsbehandling sammenlignet med enten ioniserende stråling alene, eller den ubehandlede kontrol (fig. 3). Interessant, mens dette fald i overlevende fraktion blev set i alle testede cellelinier, var den mest dramatiske relative fald når begge behandlinger blev kombineret set med to mest følsomme cellelinier til RAD001 (UM-UC5 og UM-UC6). I alle testede cellelinier, vores resultater peger på en additiv virkning på vækst, når man kombinerer RAD001 med ioniserende stråling. Det er værd at bemærke, at en lavere inhibering af colon-dannelse blev observeret i de to cellelinjer (UM-UC5 og UM-UC6), der oprindeligt var karakteriseret ved vores laboratorium til at være den mest følsomme for RAD001. Det ligger primært med selve colonogenic assay, hvor colon dannelse (som bestemt ved en universelt sæt koloni størrelse), mens følsomheden over for RAD001 blev gjort med et enzymatisk assay (MTT). Denne forskel i følsomhed af assayene, længde assay, kombineret med den hurtige fordoblingstiden, kunne forklare de klonogene resultater for disse to cellelinier.

Seks cellelinier blev behandlet med RAD001 i 12 timer før udsættelse for ioniserende stråling og yderligere dyrket som angivet i Methods. Kolonidannelse blev målt efter celle fiksering og farvning med krystalviolet, 10-14 dage efter behandling alt efter cellelinier. Resultaterne var statistisk signifikant (p 0,05). I den kombinerede behandling i forhold til enten behandling alene i alle testede cellelinier

Behandlingen med RAD001 og ioniserende stråling inducerer både en stigning i procentdelen af ​​celler i G0 /G1 og G2 faserne af cellecyklussen

for at få indsigt i den mekanisme ligger til grund for væksthæmning observeret, blev cellecyklus analyse udført ved flowcytometri for at studere fordelingen af ​​celler gennem de forskellige faser af cellecyklus 48 timer efter hver behandling alene og i kombination. Cellerne blev behandlet med en dosis af RAD001 ækvivalente med deres GI50 (området fra 0,5 til 75 nmol /l) samt 4Gy af ioniserende stråling. Resultaterne er vist i figur 4. RAD001 inducerede en G0 /G1 anholdelse i alle blærekræft testede cellelinjer: KU7 62% ± 4%, UM-UC3 71% ± 6%, UM-UC6 77% ± 3% og 253J- BV 67% ± 4% i forhold til deres ubehandlede kontroller, 54% ± 3%, 64% ± 2%, 66% ± 2% og 55% ± 3%, hhv. Procenter repræsenterer forholdet mellem celler i hver fase i forhold til det totale antal celler. Som forventet, ioniserende stråling førte primært til en G2 anholdelse, illustreres af en betydelig stigning i procentdelen af ​​celler i denne fase efter behandling med ioniserende stråling: KU7 38% ± 4%, UM-UC3 23% ± 4%, UM-UC6 19% ± 4% og 253J-BV 22% ± 3% i forhold til deres respektive ubehandlede kontroller: 23% ± 2%, 19% ± 3%, 14% ± 3% og 4% ± 2%, hhv. I den kombinerede arm med RAD001 og ioniserende stråling, observerede vi begge en stigning i procentdelen af ​​celler i G0 /G1 og G2 faserne (fig. 4). Mere specifikt et fald i procentdelen af ​​celler i S-fase blev observeret sammenlignet med enten behandling alene eller med kontrollen (ingen behandling), og dette blev modsvares af en stigning i procentdelen af ​​celler i G0 /G1 og G2 faser. Samlet set konkluderede vi, at den cytostatiske virkning af RAD001 kombineret med ioniserende stråling udviser en inhiberende additiv virkning på progression af celler gennem deres cyklus.

cellelinierne blev dyrket og behandlet med RAD001 alene, ioniserende stråling alene og med kombinationen af ​​RAD001 og stråling. For sidstnævnte serier, prøver blev forbehandlet med RAD001 i 6 timer før strålebehandling. Celler blev fikseret og farvet for propidiumiodid indtag på 48 timer efter behandling, og derefter blev udført ved flowcytometri. Andelen af ​​cellepopulationer i de forskellige faser af cellecyklus er vist for hver cellelinje ved farvede bjælker (G0 /G1: Orange /Blå, S: Rød og G2: Gul)

RAD001. og ioniserende stråling ændre niveauer af cellecykluskontrolpunkter cyclin D1, p27KIP1 og p21

Baseret på de ovennævnte cellecyklus analysedata og til yderligere at forstå den mekanisme, hvorved RAD001 og ioniserende stråling handling sammen til at inhibere cellevækst, testede vi sandsynligheden for ændringer i ekspressionsniveauer af forskellige regulatorer af cellecyklussen, især forbundet med checkpoints såsom cyclin D1, p27, og p21. Resultater i figur 5 illustrerer tilfældet med KU7, der anvendes som en repræsentant for gruppen af ​​cellelinjer sig at være relativt resistent over for både ioniserende stråling og RAD001. Det er sagt, en dosis på RAD001 ækvivalent med GI50 af denne cellelinie blev anvendt til at sikre en reaktion på RAD001 behandling. Vores resultater viser, at niveauet af cyclin D1, som er et protein påkrævet for G1 /S overgang gennem cellecyklussen, faldt efter 24 timers behandling med RAD001 (fig. 5), en opdagelse, som understøtter vores observationer på cellecyklus ændringer. I modsætning hertil niveauer af p27, som er et protein også tilknyttet G1 /S overgang, ændret i en omvendt korrelation (øget) efter 24 timers behandling med RAD001, ioniserende stråling, og den kombinerede behandling sammenlignet med kontrollen (fig. 5). Interessant niveauer af p21, som også er forbundet med inhibering cellecyklusprogression, blev reduceret i celler behandlet med RAD001 alene sammenlignet med kontrol, eller bestråling (fig. 5). Niveauerne af p21 steg som reaktion på behandlingen for stråling i forhold til kontrollen, og niveauet af p21 er på deres højeste, når celler behandles med både RAD001 og ioniserende stråling. Det er bemærkelsesværdigt, at lignende resultater blev opnået for cyclin D1, p27, og p21, i alle testede cellelinier:. UM-UC3, UM-UC6 og 253J-BV Salg

blærekræft celler blev behandlet med RAD001, ioniserende stråling (IR) eller den kombinerede behandling. De blev lyseret 24 timer efter behandling som beskrevet i Methods. Western blot-analyse for cyclin D1, p27KIP1 og p21 i KU7 celler og normaliseret i lavere paneler som funktion af actin målt parallelt. Lignende resultater blev opnået for alle cellelinjer testet, UM-UC3, UM-UC6 og 253J-BV (ikke vist).

kombinere RAD001 behandling med ioniserende stråling hæmmer tumorvækst i human blærekræft xenograft betydeligt model i forhold til enten behandling alene

for at konstatere betydning og at kontrollere, om

in vitro

data med hensyn til virkningerne af at kombinere RAD001 og ioniserende stråling på væksten af ​​blærekræft cellelinjer kan overføres

in vivo

, brugte vi KU7 blærekræft cellelinje at vokse som subkutane tumor i athymiske mus. I alle musene blev tumorer fremgår inden for de første 10 dage efter implantation. Der var ingen organ vægttab eller nogen væsentlig toksicitet er direkte forbundet med RAD001 og ioniserende stråling behandlinger under hele varigheden af ​​undersøgelsen (i alt 5 uger). I mus behandlet med kombineret RAD001 og ioniserende stråling, der var en maksimal inhiberende virkning på blærekræft progression, som angivet ved det betydelige fald i tumorvægt sammenlignet med enten alene behandling eller placebogruppen (gennemsnitlig tumorvægt 31 mg til kombination arm vs. 117 mg med RAD001 alene, 80 mg med IR, eller 340 mg for placebo, P 0,05) (figur 6).. Lignende resultater blev også opnået ved hjælp af de 253J-BV cellelinjer hvor kombinationsbehandling opnået maksimal hæmmende effekt på blærekræft progression efter 4 ugers behandling sammenlignet med kontrol. De samme resultater blev påvist under anvendelse tumor vækstkinetik når tumorvolumen blev målt under hele behandlingen (data ikke vist). Vores p21 immunhistokemi farvning på xenograft sektioner bekræftede vores resultater fra Western blot analyse for p21-niveauer

in vitro

(fig. 7). Niveauerne af p21 signifikant (p 0,05) øget efter behandling med stråling og kombinationen regimen sammenlignet med placebo. Endvidere angives vores data et lille fald, selv om statistisk ikke-signifikant, af p21-niveauer i alene RAD001-behandlede gruppe.

athymiske mus blære tumor model af KU7 blev anvendt som beskrevet i Methods. Tumor vægte (i gram) nåede på den eksperimentelle endpoint og udtrykt som gennemsnit vægten af ​​tumorer høstet for hver gruppe af mus i de 4 behandlingsgrupper, som angivet. Lignende resultater opnået ved hjælp 253J-BV-celler (data ikke vist).

(A) Immunhistokemi blev anvendt til at påvise niveauet af p21 i paraffinindlejrede mus xenograft blærekræft væv behandlet med placebo, IR, RAD001 og i kombination. (B) Kvantificering af immunhistokemi data viste en signifikant stigning i p21-ekspression som observeret i tumorer behandlet med ioniserende stråling og i kombination sammenlignet med placebo og RAD001 behandling.

Diskussion

Strålebehandling er et centralt element i mange kræft behandlingsregimer dermed dens udbredte brug. Men ioniserende stråling synes at bidrage til en ugunstig stigning i signalering gennem PI3K /AKT /mTOR pro-overlevelse vej. I den foreliggende undersøgelse, vi observerede forskelle i følsomheden af ​​et panel af seks blære cellelinier for ioniserende stråling, idet nogle er var mere resistente end andre. Vi demonstrerede også aktiveringen af ​​AKT efter udsættelse for ioniserende stråling. Flere faktorer kan potentielt være afgørende i aktivering mekanismer PI3K /AKT-vejen efter ioniserende stråling og derefter hjælpe kræftceller i etableringen af ​​resistens [22]. Blandt andet den forøgede aktivitet af nøgleenzymer såsom telomeraseaktivitet [23], samt involvering af signalmolekyler, såsom den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) og RAS [24], [25] kan forklare, hvorfor nogle tumorer ikke svare stråling så effektivt som andre. Især blev EGFR signalering gennem PI3K /AKT rapporteret at regulere DNA-afhængige proteinkinase katalytiske subunits, som er en del af DNA-reparation maskiner tændt efter stråling [26]. Mens disse observationer understreger den vigtige rolle, som aktivering af PI3K /AKT spiller i cancer radioresistance, viser vi, at blokering PI3K /AKT /mTOR pathway med RAD001 vises som et værdifuldt middel til at forbedre effektiviteten af ​​strålebehandling i blæren cancerceller. Den mekanisme, som RAD001 udviser denne forstærket effekt stadig behov yderligere vurdering. Det kunne simpelthen være, at blokering rebound aktivering af omsætningsvejen efter stråling er tilstrækkelig til at reducere radioresistance; en plausibel mekanisme som de to behandlinger deler fælles mål i cellen, såsom hypoxi inducerbar transskription faktor (HIF-1), et molekyle nedstrøms for mTOR [27].

Udover cellulær signalering, effekten