PLoS ONE: “Topologiske betydning” Analyse af genekspression og proteomisk profiler fra prostatacancerceller afslører Key Mekanismer af androgen Response

Abstrakt

Baggrund

Problemet med prostatakræft progression til androgen uafhængighed er blevet grundigt undersøgt. Flere undersøgelser har systematisk analyseret genekspressionsprofiler i forbindelse med biologiske netværk og veje, afdække hidtil ukendte aspekter af prostatacancer. Trods betydelige forskningsindsats, er mekanismerne bag tumor progression dårligt forstået. Vi anvendte en ny tilgang til at rekonstruere hele systemet molekylære begivenheder efter stimulering af LNCaP prostatacancerceller med syntetisk androgen og at identificere potentielle mekanismer af androgen-uafhængig progression af prostatakræft.

Metode /vigtigste resultater

Vi har udført samtidige målinger af genekspression og protein niveauer efter behandling med microarrays og iTRAQ proteomics. Sæt med op-regulerede gener og proteiner blev analyseret ved hjælp af vores nye begreb “topologisk betydning”. Denne metode kombinerer molekylære data high-throughput med det globale netværk af protein-interaktioner til at identificere knudepunkter som indtager betydelige netværk positioner i forhold til differentielt udtrykte gener eller proteiner. Vores analyse identificeret netværket af vækstfaktor regulering af cellecyklus som den vigtigste reaktion modul til androgen behandling i LNCaP-celler. Vi viser, at størstedelen af ​​signalering knudepunkter i dette netværk indtager betydelige positioner i forhold til den observerede genekspression og proteomiske profiler udløst af androgen stimulus. Vores resultater indikerer endvidere, at vækstfaktor signalering formentlig repræsenterer en “anden fase” svar, som ikke er direkte afhængig af den indledende androgen stimulus.

Konklusioner /Betydning

Vi konkluderer, at i prostata kræftceller den proliferative signaler er, der kan overføres fra flere vækstfaktorreceptorer af en lang række signalveje konvergerende på en række centrale regulatorer af celleproliferation såsom c-myc, cyklin D og CREB1. Desuden er disse veje ikke isoleret, men udgør et sammenhængende netværk modul indeholder mange alternative ruter fra input til output. Hvis hele netværket er involveret, kan en præcist formuleret kombinationsbehandling være forpligtet til at bekæmpe tumorvækst effektivt

Henvisning:. Vellaichamy A, Dezső Z, JeBailey L, Chinnaiyan AM, Sreekumar A, Nesvizhskii AI, et al . (2010) “Topologiske betydning” Analyse af genekspression og proteomisk profiler fra prostatacancerceller afslører Key Mekanismer af androgen respons. PLoS ONE 5 (6): e10936. doi: 10,1371 /journal.pone.0010936

Redaktør: Patrick Tan, Duke-NUS Graduate Medical School, Singapore

Modtaget: November 13, 2009; Accepteret: 6 maj 2010; Udgivet: 3 juni 2010

Copyright: © 2010 Vellaichamy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af Michigan proteomiske Alliance for Cancer Research af National Institutes of Health (NIH) tilskud CA134175-01 yde R01CA126239 og GeneGo, Inc. de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller udarbejdelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Andrej Bugrim, Zoltan Dezső og Lellean JeBailey er medarbejdere i GeneGo, Inc., som delvis har finansieret undersøgelsen. Forfatterne bekræfter, at dette faktum ikke ændrer deres tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Prostatakræft er en af ​​de mest almindeligt diagnosticeret kræft, og den anden førende årsag til kræft-relaterede dødsfald i North American men [1]. Mens androgenfjernelse terapi er ofte effektive indledningsvis, fleste tilfælde videre til det langt mere aggressive androgen-uafhængig fænotype. Trods betydelige forskningsindsats, er mekanismerne bag tumor progression dårligt forstået. Roller for flere signalveje er blevet etableret, men ikke en systemisk billede. For eksempel har IGF signalering været impliceret i progressionen fra androgenafhængig til androgen-uafhængige stater [2], men også har vist sig at undertrykke AR trans-aktivering via FoxO1 og dermed har inhiberende virkninger på væksten af ​​prostatacancerceller [ ,,,0],3], blev EGF rapporteret at efterligne virkningerne af androgen på genekspression og uafhængigt stimulere vækst af androgenafhængige prostatacancerceller [4]. Andre undersøgelser har fremlagt bevis for samspil mellem androgen signalering og TGF-beta [5], [6], FGF [7], [8] og VEGF [9].

Det meste af forskningen dommen har været hypotese-drevet i stedet for data-drevet. Hypotese formulering er modtagelige for skævhed på grund af efterforskerne præferencer og aktuelle tendenser forskning om, hvad der opfattes som “interessant”. En supplerende data-tilgang ved hjælp af high-throughput molekylær profilering og avancerede dataanalyse algoritmer kan øge forståelsen af ​​de mange cellulære processer, der ligger til grund for udviklingen af ​​prostatakræft til androgen-uafhængige scene og kunne bane vejen for nye behandlinger og opnå større effektivitet fra bedre rettet brug af eksisterende behandlinger.

genom-dækkende udtryk profilering tilflugtssted været almindeligt anvendt til komplekse sygdomme, herunder prostatakræft [4], [10], [11], [12], [13], [14]. Adskillige nyere undersøgelser også systematisk analyseret genekspressionsprofiler i forbindelse med biologiske netværk og veje, afdække nye aspekter af prostatakræft [15], [16], [17]. Trods disse fremskridt virkelig systemisk analyse, som tager hensyn til både genekspression og proteomiske data fra den samme prøve forbliver en flygtig mål. En kritisk udfordring er at udføre robust integreret analyse af datasæt produceret af så forskellige molekylære platforme. Dette er en hård informatik problem, fordi microarray og proteomics data kunne ikke, i de fleste tilfælde, sammenlignes direkte med hinanden. For eksempel har studier i gær vist, at korrelation mellem niveauerne af mRNA og tilsvarende proteiner var utilstrækkelige til at foretage pålidelige forudsigelser om proteinniveauer fra genekspression data [18]. En nylig undersøgelse af prostatakræft prøver viste overensstemmelse mellem proteom og genomiske data spænder fra 46% til 68% baseret på de “fraværende /nuværende” opkald; dog korrelationer var lave, når de faktiske niveauer af ekspression blev sammenlignet [19]. Som vist i et nyere arbejde [20], langt mere omfattende kvantitativ protein karakterisering fører til signifikant forbedring i korrelation mellem niveauer af protein og genekspression. Alligevel er der flere iboende kilder til uoverensstemmelse, herunder mRNA-nedbrydning, alternativ splejsning, translationel regulering, post-translationelle modifikationer, og proteinnedbrydning [21]. Disse kan ikke overvindes ved teknologiske forbedringer alene og har skal behandles af nye analytiske tilgange til dataintegration. Tidligere indsats på dette område udnyttet foruddefinerede sæt gener (veje, Gene ontologi kategorier) til at lede efter overensstemmelse mellem proteom og genomiske data på dette niveau [22], [23].

For nylig har vi udviklet et nye beregningsmæssige metode, der kan bidrage til at fremme en integreret analyse af flere typer data et skridt videre [24]. Vores tilgang kombinerer sygdomsspecifikke eller tilstandsspecifikke, højt gennemløb molekylære data med det globale netværk af protein-interaktioner til at identificere knudepunkter som indtager betydelige netværk positioner i forhold til differentielt udtrykte gener eller proteiner i de præsenterede molekylære datasæt. Selv når der er betydelig støj og uoverensstemmelse i selve data, forudsigelser af algoritmen forventes at konvergere på et fælles sæt af signalering proteiner i de veje, der er ansvarlige for ændringer i ekspressionen af ​​target gener og proteiner. Ofte aktiviteten af ​​sådanne signalproteiner er modificeret ved subtile post-translationelle modifikationer, binding til sekundære budbringere, eller rekruttering til en bestemt subcellulær lokalitet. Disse begivenheder er ikke eksplicit afspejlet i tilsvarende molekylære profiler; således, at de forbliver “skjult” fra standard molekylær assays. Vores metode er i stand til at finde mange sådanne “skjulte” proteiner ved at identificere sæt af deres sandsynlige downstream mål og vurdere berigelse af sådanne sæt ved differentielt udtrykte gener eller proteiner. Vi kalder denne procedure “topologisk scoring” (se “Metoder” for yderligere detaljer).

I vores tidligere arbejde denne metode blev testet på et sæt af microarray genekspression data fra psoriasis patienter, hvor det var i stand til at korrekt identificere mange vigtige regulatoriske proteiner, hvis forhold til sygdommen bekræftes af uafhængige undersøgelser [24]. I den foreliggende undersøgelse har vi anvendt den topologiske scoring tilgang til at undersøge reaktionen af ​​LNCap prostatacancerceller til behandling med syntetisk androgen (R1881), som et godt undersøgt modelsystem for prostatakræft progression. Vi tog en data-tilgang, uden at have nogen forudfattede hypotese om cellulære processer aktiveres af androgen i disse celler. Vi har samlet og analyseret både genekspression og proteom data for at cross-validere forudsigelser baseret på forskellige typer af data og evaluere anvendeligheden af ​​denne tilgang til integrativ dataanalyse.

Resultater

Gener og proteiner, der berøres af androgen behandling identificeret ved microarray og protein massespektrometri

for at udspørge rolle androgen i prostatacancer blev androgen-responsive prostatacancer LNCaP behandlet med syntetisk androgen R1881 (se ” Metoder “sektionen for detaljer). LNCaP celler behandlet med androgen viste øget celledeling mens kontrolcellerne stoppet med at vokse i androgen udtømte medium. Brug af statistisk analyse af genekspression data, vi har identificeret 347 og 257 gener, der var op- og nedreguleres i henholdsvis behandlede versus ubehandlede celler (FDR≤1%) (tabel S1). De op-regulerede gener inkluderet kendt androgen-induceret gener såsom Kallikrein 3 (

KLK3

; alias

PSA

), FK506 bindende protein 5 (FKBP5), N-myc nedstrøms reguleret 1 (NDRG1 ) og fedtsyresyntase (FASN). Brug af iTRAQ 2DLC-MS /MS-baserede proteomisk profilering af androgen-behandlede versus ubehandlede LNCaP-celler, har vi identificeret 70 og 39 proteiner, som var forhøjet eller nedreguleret henholdsvis i behandlede celler sammenlignet med ubehandlede celler (tabel S1) ( Nærmere oplysninger om massespektrometri og statistiske analyser er beskrevet i [25]). Androgen-reguleret protein datasæt inkluderet genprodukter til de kendte up-regulerede gener er nævnt ovenfor, samt flere andre proteiner tidligere kendte og ukendte at blive reguleret af androgen. Sæt med op-regulerede gener og proteiner har 13 fælles elementer, som er ~17% af den mindre sæt. For down-regulerede gener og proteiner niveauet af konkordans er ~8%.

Topologisk betydelige knudepunkter i det globale signalering netværk

For at undersøge formodede signalsystemer mekanismer, der aktiverer genet og proteinekspression efter androgen stimulation, har vi anvendt vores nyligt udviklede teknik topologisk betydning analyse [24]. Vi indsendt lister over up-regulerede gener og proteiner til online-version af vores topologiske scoring værktøj (https://topology.genego.com/zcgi/topology_scoring.cgi) at identificere de vigtigste regulatoriske proteiner, hvis aktivitet i behandlede celler måske har tegnet sig for ændringer i gen- og proteinniveau. Genekspression og proteom data blev indsendt til scoring procedure separat, hvilket resulterer i to sæt af topologisk væsentlige regulatoriske proteiner. Hver node i det globale netværk af protein interaktioner blev tildelt topologiske scores (topologiske p-værdier) for hvert sæt af molekylære data. For at styre den falske opdagelse sats (FDR) signifikansniveauet filteret blev anvendt. Under anvendelse FDR≤5% vi identificeret 962 topologisk væsentlige proteiner fra genekspression data og 577 topologisk signifikante proteiner fra proteomiske data (Tabel S2). Interessant, de to sæt af topologisk væsentlige proteiner indeholder 301 fælles elementer (eller 52% af den mindre sæt) .Dette resultat står i skarp kontrast til kun 17% overlap mellem lister over up-regulerede gener og opreguleret proteiner.

vækst faktor signalering netværk er stærkt impliceret i androgen respons

for funktionel analyse blev begge sæt de topologisk væsentlige proteiner indlæst i MetaCore ™ softwarepakke (GeneGo, Inc.), hvor vi beregnede berigelse i ontologi af funktionelle processer som defineret af “GeneGo proces netværk”. Vi brugte alle proteiner i (indstilling “default”) den MetaCore netværk som referencelisten for beregning berigelse p-værdier. Som det kunne forventes, top-scoring proces er “Androgen receptor nuklear signalering” (figur 1a). Imidlertid overraskende denne proces er højt beriget kun i proteiner, hvis topologisk score er afledt fra genekspressionsprofilen; 82 af 126 knudepunkter i denne proces netværk anses væsentlige for over-udtrykte gener. I modsætning hertil er kun 19 knudepunkter anses væsentlige for opreguleret proteiner fra iTRAQ datasæt. Den næste højt beriget proces netværk er “Vækst faktor regulering af cellecyklus”. I modsætning androgen signalering, er dette netværk er stærkt beriget med proteiner, der er topologisk betydning for både genekspression og proteom data. Af 186 knudepunkter i dette netværk er 95 yderst scoret med hensyn til over-udtrykte gener, mens 63 er stærkt scoret med hensyn til iTRAQ-identificerede proteiner opreguleret efter androgen behandling. I kombination, er 49 noder bekræftet som topologisk signifikant fra begge sæt af molekylære data. Nøje undersøgelse af denne proces viser, at topologisk signifikante proteiner er til stede på alle niveauer af signalering hierarki, herunder flere vækstfaktorer (EGF, FGF, VEGF-A), receptorer (IGFR, EGFR, ActRIIB, VEGFR-2), signalering kinaser (AKT , GSK3, PI3K, JNK, ERK1 /2, PKC), transkriptionsfaktorer (c-myc, IRF1, TCF (Lef), SMAD3, Smad4, STAT1, STAT3) og endelig cyclin kinaser (cyclin D, cyklin E), som direkte regulere cellecyklus (figur 2). Vigtigere, blev topologisk betydning af mange af disse proteiner bekræftes for begge datasæt. Til sammenligning har vi også udført pathway berigelse analyse af de oprindelige sæt med op-regulerede gener og proteiner. Interessant, er de fleste af identificerede pathway kort til både genekspression og proteomforskning sæt relateret til metaboliske processer, de fleste af dem til fedtsyre metabolisme (tabel S3). Derudover er flere signalveje afsløret ved denne analyse, især Vækst faktor signalering via MAPK og PIK3, regulering af lipid metabolisme og en sti kort relateret til cellecyklus. Imidlertid er ingen af ​​de signalveje meget meget rangeret og samlede betydning af berigelsen er lav sammenlignet med resultaterne opnået for proteiner identificeret ved topologisk scoring. Berigelse af GeneGo net opreguleret proteiner åbenbarer Androgen signalering netværk, men det er også i bunden af ​​listen (p = 0,007). Bortset fra insulin signalering der synes at være nogen sammenhæng mellem netværk beriget med opregulerede gener og opreguleret proteiner. det viser samlet, at funktionel analyse af differentielt udtrykte gener og proteiner tendens til at identificere kerneområder veje, såsom metabolisme, mens anaylysis af topologisk signifikante proteiner afslører nøgle signalering forarbejdet aktiveret i androgen-stimulerede celler.

(A) berigelse af GeneGo proces netværk ved topologisk væsentlige proteiner identificeret ved hjælp af alle up-regulerede gener og proteiner. (B) Berigelse af GeneGo proces netværk ved topologisk væsentlige proteiner identificeret ved hjælp af afkortede datasæt (undtagen gener og proteiner direkte reguleret af androgen receptor). Orange barer-berigelse af betydelige proteiner identificeret ved hjælp af proteomics datasæt. Blå søjler-berigelse af betydelige proteiner identificeret ved hjælp af genekspression data.

Røde prikker angiver proteiner identificeret som topologisk betydelig hjælp genekspressionsprofilen. Blå prikker indikerer proteiner identificeret som topologisk signifikant ved hjælp af proteomics profil. Røde kasser-proteiner identificeret som topologisk signifikant fra begge sæt data.

For at undersøge, om signifikante forskelle i størrelser af sættene, der anvendes i vores analyse kunne have påvirket de resultater, vi stikprøver puljen af gener og proteiner og føjet dem til de differentielt udtrykte sæt. Dette trin blev efterfulgt af berigelse analyse af de udvidede sæt. Men resultaterne viser, at ingen nye kort eller netværk bliver væsentligt til større sæt og i øvrigt, betydning af tidligere identificerede kort og netværk falder støt som mere tilfældige gener er tilføjet. (Se tabel S4).

Afgrænsning androgen-afhængige og androgen-uafhængige aktivitet

Resultaterne præsenteret ovenfor, tyder på, at et flertal af proteiner i signalering netværk forbinder flere vækstfaktorer til regulering af cellecyklus kan blive aktiv efter androgen stimulation. Den resulterende aktivering af celledeling kan blive en vigtig medvirkende mekanisme for kontakten til androgen uafhængighed i prostatakræft. For yderligere at verificere dette formodninger vi nødt til at undersøge, om dette resultat afhænger af den direkte virkning af androgen receptor. Således er vores næste skridt var at afgrænse signalering effekter, der er uafhængige af direkte aktivering af androgen receptor.

Først brugte vi MetaCore ™ til at identificere, hvilke af de over-udtrykte gener og opreguleret proteiner er direkte mål for transkriptionel regulering af androgen receptor. Til dette formål byggede vi den “nærmeste naboer” netværk omkring androgen receptor med samspillet filter i MetaCore sæt til kun at tillade “transkriptionel regulering” type links. Krængning på op-regulerede gener og proteiner blev afbildet på det resulterende netværk. Brug af dette netværk vi yderligere valgt knudepunkter, der både er: “nedstrøms” af androgen-receptoren og har eksperimentelle data tilknyttet. Vi fandt 45 direkte mål for androgenreceptoren blandt over-udtrykte gener og 9 mål blandt sættet af opreguleret proteiner. Disse molekyler blev udelukket fra de oprindelige lister og afkortede sæt blev re-analyseret med topologisk betydning værktøj med efterfølgende funktionel analyse af topologisk scorede knuder i MetaCore ™. Vi identificerede 565 væsentlige proteiner på grundlag af iTRAQ data og 668 væsentlige proteiner på grundlag af genekspression datasæt (med FDR 5%, tabel S5). En bemærkning umiddelbart mærkbar fra gennemgangen af ​​berigelse diagrammet er fraværet af androgenet signalering netværk (figur 1b). Denne mangel bekræfter, at mange proteiner i androgen pathway modtaget høje topologiske scores på styrken af ​​over-ekspression af et stort antal direkte mål for androgenreceptoren. Når disse mål er slået ud overvejelse, scorer for proteiner i androgen-regulerede vej faldet under signifikansniveau. Derimod høj berigelse for netværket af vækstfaktor regulering af cellecyklus forblev praktisk intakt. Mens antallet af noder på dette netværk scorede på grundlag af microarray data faldt 95-78, antallet af knuder scoret baseret på iTRAQ data steg fra 63 til 71. overlapning mellem de to sæt af væsentlige proteiner også steget til 54 (eller 76% af den mindre sæt). Dette fund understøtter forslaget om, at aktiviteten af ​​denne vej er uafhængig af direkte androgen handling og kan repræsentere vigtige mekanismer for overgangen til androgen-uafhængige proliferation i prostatakræft.

Top-rangerede regulatoriske proteiner og deres veje

Næste vi undersøgte de top-rangerede molekyler i sæt af topologisk scorede proteiner. Vores mål var at fastlægge specifikke transkriptionsfaktorer, som driver genekspression respons efter androgen behandling og identificere regulatoriske kaskader, der aktiverer dem. Der er flere transkriptionsfaktorer, som kan regulere ekspression af et stort antal “mål” blandt overudtrykte gener eller opreguleret proteiner eller begge (tabel 1). For eksempel c-myc har 25 mål blandt 70 up-regulerede proteiner identificeret ved iTRAQ og 63 mål blandt 347 over-udtrykte gener identificeret ved microarray analyse. c-myc er rangeret # 1 i topologisk scoring baseret på iTRAQ data og # 11 i scoring baseret på genekspression (stadig i top 2%). Andre transkriptionsfaktorer der fik høje topologiske point med hensyn til både datasæt er SREBP1 og YY1, som er vigtige regulatorer af enzymer involveret i lipid og fedtsyremetabolisme. I modsætning hertil CREB1 og ATF-4 er top-scoring transkriptionelle regulatorer med hensyn til microarray data, men at de ikke modtager nogen score baseret på iTRAQ data. Årsagen til en sådan forskel er manglende betydeligt antal CREB1 og ATF-4 mål blandt opreguleres proteiner identificeret ved massespektrometri (tabel 1). Dette kan indikere aktivitet af nogle posttranskriptionel processer blokerer syntese eller inducerer nedbrydning af disse proteiner på tidspunktet for prøveudtagningen. Mens transkriptionsfaktorer ofte modtage high topologiske scoring på grund af det betydelige antal af deres direkte mål i de eksperimentelle datasæt, er upstream signalmolekyler scoret baseret på berigelse af sæt af deres “fjerntliggende mål” -genes og proteiner et par skridt nedstrøms på signalering veje.

Undersøgelse af individuelle signalering kaskader, der fører til toppen transkriptionelle regulatorer afslører, at PI3K signalering understøttes af konsekvent høje topologiske scores stammer fra både proteomics og microarray datasæt. Figur 3 viser denne kaskade i forbindelse med IGF-signalering. Den PI3K kaskade er fremhævet af den røde linje, mens alle dens elementer, der opnår høje topologiske scores i forhold til begge sæt er markeret med røde bokse. En sådan konsekvent scoring antyder den centrale rolle, denne vej i reguleringen begivenheder, der følger androgen behandling. Mest sandsynligt, dens rolle i dette system er inhibering af GSK3-kinase og dets evne til at phosphorylere c-Myc og cyclin D (fig. 3). Normalt sådan phosphorylering ville målrette disse molekyler til proteolyse, hvilket begrænser celledeling. I denne situation, synes imidlertid c-myc at blive vedvarende aktiveres dømme efter det store antal af sine direkte mål til stede i begge sæt. En sandsynlig årsag til den vedvarende virkning af PI3K-signalering er homozygot mutation af PTEN i LNCaP-celler, der fører til manglende dets ekspression i dette system [26]. Denne effekt kan forværres ved kombinationen af ​​høje kallikrein 3, over-ekspression af IGF-receptoren, og under-ekspression af IGF-bindende proteiner (IBPS). Kallikrein 3 (også kendt som PSA) er stærkt opreguleret i prostatakræft og er konsekvent overudtrykt på både mRNA og protein niveauer i vore eksperimentelle data. Det blev tidligere vist, at PSA har proteolytisk potentiale med hensyn til IGF-bindende proteiner [27], [28]. Desuden blev det foreslået, at dette kan være en mekanisme, hvorved biotilgængeligheden af ​​IGF øges, bidrager til væksten i prostata kræftceller [29], [30].

Red niveau i “termometre” repræsenterer relativ rang (percentil) af et protein i den tilsvarende liste over topologisk væsentlige proteiner. Nummeret identificerer datasæt, hvorfra signifikans blev beregnet: 1-iTRAQ, 2-Affymetrix. Røde kasser og fremhævet sti illustrerer signaleringskaskade med stærkeste støtte fra begge sæt.

I vores analyse har vi fået flere ekstra beviser til støtte for denne hypotese. Først IGF-bindende proteiner modtaget høje topologiske scores baseret på både microarray og iTRAQ data. Dette resultat bekræfter, at de er yderst relevante for observerede ændringer i gen og protein ekspression efter androgen behandling af LNCaP-celler. For det andet, ved androgen behandling vi fandt, at ekspressionsniveauer af mindst en af ​​de IGF-bindende proteiner (IBP3) og af IGF-receptor skift i modsatte retninger. IBP3 er 30% under-udtrykt i behandlede celler, medens IGF-receptoren er 46% over-udtrykkes. Nedregulering af IBP3 på det genomiske niveau ud over proteolytiske aktivitet af PSA vil bidrage til lavere koncentration af IBP3 protein og øget tilgængelighed af IGF. Det resulterende højere niveau af IGF modsvares af overekspression af dets receptor, hvilket fører til høj aktivitet af downstream veje.

Diskussion

Vækst faktor netværk som den vigtigste reaktion modulet til androgen stimulering i LNCaP celler

Vores topologiske analyse identificerede netværket af vækstfaktor regulering af cellecyklus som den vigtigste reaktion modul til androgen behandling i LNCap celler. Som beskrevet i indledningen, har forskellige aspekter af vækstfaktorsignalering blevet omfattende undersøgt i forbindelse med prostatacancer kontakten til androgen-uafhængig tilstand. Vores resultater understøtter disse tidligere observationer fra en supplerende systemer-niveau, data-drevet perspektiv. I stedet for at fokusere på aktiviteten af ​​individuelle proteiner, viser vi, at størstedelen af ​​signalering knudepunkter i netværket forbinder multiple vækstfaktorer til centrale regulatorer af cellecyklus indtager betydelige positioner i forhold til den observerede genekspression og proteomiske profiler udløst af androgen stimulus. Dette netværk indeholder flere konventionelle “veje” fremsendende signaler fra vækstfaktorreceptorer. Disse omfatter signalering via MAP kinaser, PI3K pathway og signalering via SMADs og krydstale mellem disse systemer. Det er således rimeligt at konkludere, at de proliferative signaler i prostatacancerceller overføres fra vækstfaktorreceptorer af en lang række signalveje konvergerende på en række centrale regulatorer af celleproliferation såsom c-myc, cyklin D og CREB1. Desuden er disse veje ikke isoleret, men udgør et sammenhængende netværk modul indeholder mange alternative ruter fra input til output.

Vores resultater tyder endvidere, at vækstfaktor signalering formentlig repræsenterer en “anden fase” celle respons på androgen stimulus. Når alle direkte mål for androgenreceptoren fjernes fra overvejelse, er de fleste proteiner i vækstfaktoren netværket stadig stærkt scoret i forhold til de resterende sæt overudtrykte gener og proteiner. Denne reaktion kan være medieret af kombinerede virkninger af høje niveauer af PSA og vækstfaktorreceptorer og lave niveauer af vækstfaktor inhibitorer, såsom IGF-bindende proteiner (IBPS) (fig. 3). Proteolytiske virkning af PSA kan yderligere bidrage til en sænkning af IBPS niveauer. Samtidig kan PSA-ekspression opretholdes uafhængigt af androgen receptor ved CREB1 og nogle andre transkriptionsfaktorer [31]. Når disse faktorer aktiveres via vækstfaktor signalveje, opstår der et positiv feedback loop, som kan modstå høje niveauer af PSA og celleproliferation, selv i fravær af aktiveret androgenreceptoren. Vi har bemærket, at CREB1 er rangeret # 1 i topologisk scoring af genekspression data, hvilket indebærer, at det er meget aktiv i dette system.

Selvom yderligere eksperimentelt arbejde, såsom siRNA undersøgelser er nødvendig for at bekræfte disse slutninger, hvis sig at være korrekt, kan de føre os til at genoverveje vores tilgang til at finde målrettede behandlinger for prostatakræft. Biologiske netværk er robust i en forstand, at der er mange alternative måder til at overføre en molekylær signal fra et punkt til et andet. Givet høje mutationsrater af gener i cancerceller, er det sandsynligt, at selv om vi blokere en bestemt kaskade med en målrettet lægemiddel, vil der være mindst en sub-population af celler i en tumor, som vil kunne omgå en sådan blok ved anvendelse af en alternativ signalering rute. Hvis hele netværket er involveret, vil en præcist formuleret kombinationsbehandling være forpligtet til at bekæmpe tumorvækst effektivt. Desuden kan sådanne kombinationsbehandlinger nødt til at være specifik for en lille delpopulation af patienter eller endda individuelle patienter givet patientspecifikke egenskaber onkogene netværk.

Dynamisk karakter af cellulære reaktioner og integration af data genereret af forskellige teknologier

i denne undersøgelse blev samtidige målinger af genekspression og proteinniveauer efter behandling med syntetiske androgen udført, og hundredvis af gener og snesevis af proteiner, hvis niveauer steg efter at stimulus blev identificeret. Men der er kun beskedne overlapning (ca. 17%) observeret mellem sættene af opregulerede gener og proteiner. Mens det i begyndelsen det lyder overraskende, bør forventes dette resultat. Celler er komplekse dynamiske systemer, hvor processer forekommer på flere tidsskalaer. Når vi analysere en biologisk prøve tager vi et statisk snapshot af denne dynamiske opførsel. For eksempel niveauer af mRNA kan stige efter 20-60 min efter behandlingen, men den proteinsyntese blive yderligere forsinket, og statistisk signifikant ændring i proteinkoncentrationer vil tage meget længere tid at udvikle og har et lavere forhold. Ved den tid proteiner syntetiseres nogle mRNA kunne nedbrydes uden at efterlade spor af gen overekspression. Således når man studerer microarray eller proteomiske data, har vi at gøre med fragmenterede spor af aktivitet, der er efterladt af forbigående dynamiske processer på forskellige niveauer af cellulære maskineri. Selv i de forsøg, hvor prøverne analyseres på flere forskellige tidspunkter vi stadig ser på en lille samling af de enkelte snapshots snarere end det fulde billede af cellulære dynamik.

Her brugte vi begrebet topologiske betydning at rekonstruere opstrøms veje, der kunne have resulteret i disse spor af dynamisk aktivitet, som vi detekteres som observerbare molekylære profiler. Resultaterne indikerer, at denne fremgangsmåde var vellykket til at forudsige centrale regulatoriske proteiner og veje såsom androgen signalering, vækstfaktorsignalering og regulering af cellecyklus, som medierer responser af LNCaP-celler til behandling med syntetisk androgen (R1881). Vigtigst, har vi opdaget, at graden af ​​overlapning mellem sæt af regulatoriske proteiner forudsagt fra genekspression og proteom data er meget højere end overlappet mellem den eksperimentelle sætter sig (52% vs. 17%). Desuden er det for vækstfaktoren regulering af cellecyklussen som synes at være et centralt proces i dette system, overlapningen når 76%. 4a. 4a.