PLoS ONE: Azacytidin og Decitabin Fremkald Gene-Specific og ikke-tilfældige DNA Demethylering i Human Cancer Cell Lines

Abstrakt

DNA methyltransferase-hæmmere azacytidin og decitabin repræsenterer arketypiske lægemidler til epigenetisk kræftbehandling. For at karakterisere demethyleringsmiddel aktivitet azacytidin og decitabin vi behandlede tyktarmskræft og leukæmiceller med begge lægemidler og brugt matrix-baserede DNA methylering analyse af mere end 14.000 genpromotorer. Endvidere blev lægemiddelinduceret demethylering forhold til methylering mønstre af isogene kolon kræftceller mangler både DNA methyltransferase 1 (DNMT1) og DNMT3B. Vi viser, at lægemiddelinducerede demethylering mønstre er meget specifikke, ikke-tilfældige og reproducerbar, hvilket indikerer målrettet remethyleringen af ​​specifikke loci efter replikation. Tilsvarende fandt vi, at CG dinukleotider inden CG øer blev fortrinsvis remethylated, hvilket indikerer en rolle for DNA-sekvens sammenhæng. Vi identificerede også en delmængde af gener, der aldrig demethylerede af lægemiddelbehandling, enten i coloncancer eller i leukæmiske cellelinier. Disse demethylering-resistente gener blev beriget for Polycomb Undertrykkende Complex 2 komponenter i embryonale stamceller og for transskriptionsfaktorbindende motiver ikke forekommer i demethylerede gener. Vores resultater giver detaljerede indsigt i DNA methylering mønstre induceret af azacytidin og decitabin og foreslå inddragelse af komplekse regulerende mekanismer i narkotika-induceret DNA demethylering

Henvisning:. Hagemann S, Heil O, Łyko F, ​​Brueckner B ( 2011) azacytidin og Decitabin Fremkald Gene-Specific og ikke-tilfældige DNA Demethylering i menneskelige kræftceller. PLoS ONE 6 (3): e17388. doi: 10,1371 /journal.pone.0017388

Redaktør: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, USA

Modtaget: November 23, 2010; Accepteret: 1. februar, 2011; Udgivet: 7 Marts 2011

Copyright: © 2011 Hagemann et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1463) til FL (www.dfg.de). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Aberrant DNA-methylering er en vigtig kendetegnende for kræft [1], [2], [3]. I kræftceller, er global hypometylering ledsaget af hypermethyleret og transkriptionelt tavshed tumorsuppressorgener. Disse såkaldte epimutations bidrager til tab af spredning kontrol i cancerceller [4], [5], [6].

vedligeholdelse af hypermethyleringsassocierede inducerede epimutations kræver kontinuerlig aktivitet af DNA methyltransferaser (DNMTs) under celledeling. Inhibering af DNMTs held har været anvendt i epigenetisk cancerterapi at vende epimutations og genaktivere epigenetisk lyddæmpet tumorsuppressorgener [7], [8], [9], [10]. De arketypiske DNMT hæmmere 5-azacytidin (azacytidin, AZA) og 2′-deoxy-5-azacytidin (Decitabin, DAC) er blevet godkendt til behandling af myelodysplastisk syndrom, en præleukæmisk knoglemarv uorden. På trods af deres anvendelse i klinikken og i talrige prækliniske studier, viden om virkemåde af disse lægemidler er stadig ufuldstændig [11].

En af de store konsekvent observerede cellulære virkninger af azacytidin og decitabin er DNA demethylering . Som nukleosidanaloger, er AZA og DAC inkorporeret i replikerende DNA, hvor de kan danne kovalente bindinger med DNMTs [12], [13], [14]. Denne indfangning af DNMTs fører til passiv demethylering under DNA replikation og celledeling. Hæmning af DNA methylering af AZA og DAC er blevet demonstreret på udvalgte loci i forskellige kliniske undersøgelser [7], [9], [15].

For nylig virkningerne af AZA og DAC er også blevet undersøgt på det genomiske niveau. På grund af den begrænsede tilgængelighed af egnede værktøjer til genom-dækkende methylering analyse blev disse undersøgelser oprindeligt begrænset til analysen af ​​narkotika-induceret transskription ændringer. For eksempel blev genekspressionsprofilering anvendt til at analysere virkningerne af DAC på genekspressionen mønster af HCT116 colon cancerceller, og resultaterne tydede på, at udover genaktivering af hypermethyleret gener, kan transkriptionel nedregulering være en vigtig effekt af DAC [16], [17]. For nylig blev Illumina GoldenGate arrays anvendes til direkte at karakterisere lægemiddelinduceret DNA demethylering ved 1.505 CG dinukleotider der repræsenterer 807 cancerrelaterede gener af myeloide leukæmiceller [11]. Men på grund af den forholdsvis lav dækning af dette array, de resulterende data blev ikke analyseret i detaljer og de molekylære karakteristika af DNA demethylering responser stadig at blive undersøgt.

I den foreliggende undersøgelse anvendte vi genom-skala Infinium analyse systematisk karakterisere demethyleringen reaktioner efter AZA og DAC behandling i to humane cancercellelinier. Til dette formål undersøgte vi methylering niveauer af mere end 27.000 CG dinucleotider repræsenterer mere end 14.000 gener [19] i HCT116 kolon kræftceller og i HL-60 myeloid leukæmi-celler. Vores resultater viser, at AZA og DAC demethylate CGs i ikke-CG øer mere effektivt end i CG øer (CGI). Desuden behandling med AZA og DAC resulterer i ikke-tilfældige og reproducerbare DNA demethylering mønstre i HCT116 og HL-60 celler. Desuden har vi identificeret en delmængde af CGs der hverken demethyleres efter lægemiddel-behandling eller i celler med ekstremt reducerede niveauer af DNMT1 og ingen DNMT3B [20], [21]. Demethylering-resistente CGs er forbundet med gener fortrinsvis bundet af Polycomb Undertrykkende Complex 2 (PRC2) komponenter i ES-celler og er beriget til transskription faktor bindende motiver ikke er til stede i demethylerede gener. Disse resultater optrævle mønstre af DNA demethylering af AZA og DAC og foreslå, at narkotika-induceret demethylering reguleres af definerede molekylære mekanismer.

Materialer og metoder

Cell kultur

Menneskelig HCT116 coloncarcinomceller og HCT116 dobbelt knockout (DKO) celler (DNMT1 – /-; DNMT3B – /-) blev venligst stillet til rådighed af Bert Vogelstein (juli 2007) og dyrket under standardbetingelser i McCoys 5A-medium suppleret med 5% L-glutamin og 10% FCS (Invitrogen). Identitet af HCT116 celler blev bekræftet af DMSZ (Braunschweig, Tyskland, januar 2008) ved hjælp af DNA-profilering af otte korte tandemgentagelser. HL60-celler blev opnået fra ATCC og dyrket under standardbetingelser i RPMI-medium (Sigma) suppleret med 5% L-glutamin og 10% FCS (Invitrogen). Friske portioner af alle cellelinier blev anvendt til forsøgene. For at analysere effekten af ​​5-azacytidin (AZA) og 2′-deoxy-5-azacytidin (DAC), blev cellerne dyrket i medier suppleret med forbindelserne, ved de angivne koncentrationer.

Inhibitors

5 mM stamopløsninger af AZA (Sigma) og DAC (Calbiochem) blev fremstillet ved opløsning stofferne i destilleret H

2O (GIBCO) og opbevaret ved -80 ° C. Umiddelbart før behandling blev stamopløsninger fortyndet i celledyrkningsmedium til angivne koncentrationer.

Genomisk DNA methyleringsanalyse

lægemiddelbehandlede celler blev inkuberet med de angivne koncentrationer af AZA og DAC efter en 24 h såning periode, og genomisk DNA blev fremstillet ved anvendelse af DNeasy blod og væv Kit (Qiagen). Globale genomisk DNA-methylering blev bestemt ved kapillarelektroforese som beskrevet tidligere [22].

Array baserede DNA methyleringsanalyse

Array-baseret gen-specifik DNA methyleringsanalyse blev udført ved anvendelse Infinium HumanMethylation27 bead chip teknologi (Illumina) ifølge producentens instruktioner. Kort tid, bisulfit behandlede genomiske DNA var hel-genom forstærkes og hybridiseret til HumanMethylation27 BeadChip. Oligomerer, der er knyttet til to forskellige perle typer pr forhørt locus, matcher enten umethylerede eller methylerede tilstand, der gør det muligt enkelt base udvidelse og afsløring. status methylering af en specifik cytosin er angivet med gennemsnitlig beta (AVB) værdier, hvor 1 svarer til fuld methylering og 0 til ingen methylering. Delta beta (DB) værdier blev beregnet ved at trække AVB værdier behandles eller knockout celler fra kontrol AVB værdier. Biologiske gentagelser (se figur S2) af hvert forsøg blev grupperet og array-sonder med

P

≥0.05 blev udelukket fra analysen. Loci blev scoret som methyleret hvis AVB var større end eller lig med 0,2 [23]. Den komplette CG methylering data er tilgængelige i ArrayExpress databasen (www.ebi.ac.uk/arrayexpress). For en mere detaljeret beskrivelse af normalisering og yderligere beregninger refererer til Metode S1. Resultaterne blev analyseret ved hjælp af Illumina s BeadStudio software-version 3.1.3.0 og med R, udgave 2.10.0 [24]. Konkret blev følgende R-pakker til analyse af data: grafik (boxplots), statistik (skøn kerne tæthed og statistiske analyser), den limma pakke [25] til opførelse af Venn diagrammer og gitter pakke [26] til visning af multivariate data (espalier plots).

454 DNA bisulfit sekventering

Deep DNA bisulfit sekventering af CGs af 4 gener (PIK3CG, Ells1, Aff2, NTRK3) blev udført som beskrevet tidligere [27], [ ,,,0],28]. For 454 sekventering, blev behandlet med bisulfit genomisk DNA amplificeret under anvendelse af sekvensspecifikke primere indeholdende behandlingsrelaterede specifikke stregkoder og 454 linkersekvenser (Figur S7). 454 dyb sekventering blev udført af DKFZ Genomics og Proteomics Core Facility.

Analyse af transskriptionsfaktorbindende motiver

For at identificere beriget transskription faktor bindende motiver vi brugt online-værktøj PSCAN [29] og 130 transkriptionsfaktor-bindende profiler (

H. sapiens

) fra Jaspar databasen [30]. Analysen af ​​gener var fokuseret på regionen fra -450 til +50, i forhold til deres transkriptionsstartstedet. For at opsummere resultaterne af PSCAN analyse blev en Heatmap viser den naturlige logaritme til de

P

værdier genereret.

Resultater

Etablering af betingelserne for aza og DAC behandling induceret demethylering i HCT116 celler

som et første skridt i retning af en systematisk karakterisering af demethylering reaktioner induceret af azacytidin (AZA) og decitabin (DAC), vi havde til formål at maksimere demethylering effektivitet, for at minimere lægemiddeltoksicitet [31], [32] og for at forhindre remethyleringen som observeret under langtidsbehandling [33]. Til dette formål har vi behandlet HCT116 celler med stigende narkotika koncentrationer (figur 1A) og over forskellige tidsperioder (Figur 1B) at bestemme de globale genomisk methylering niveauer ved kapillarelektroforese. Resultaterne viste tydeligt for begge lægemidler, maksimal demethylering blev opnået med koncentrationer på 1 uM efter 24-36 timer med DAC viser en reduktion på 60% og AZA viser en 50% reduktion af den globale DNA methylering.

Da azanucleosides kræver DNA-replikation for deres funktion, vi undersøgt, om antallet af celler i S-fase kan være påvirket af lægemiddelbehandling. HCT116-celler blev behandlet med 0,1, 1 og 10 uM af AZA eller DAC og cellecyklusfordeling blev analyseret ved FACS (Fluorescence Acitvated Cell Sorting). Mens andelen af ​​celler i S-fase blev forøget efter 24 timers behandling med 0,1-10 uM AZA eller DAC, kun længere inkubationstider resulterede i et fald replikere cellerne i adskillige medikamentkoncentrationer (Figur S1a). Desuden FACS analyser afslørede også, at kun høje narkotika koncentrationer (10 uM) resulterede i en G2 fase anholdelse, som blev ledsaget af en reduktion af celler i G1 fasen (figur S1B). Der blev heller udtalt celledød kun observeret med høje lægemiddelkoncentrationer, især efter behandling med 10 pM AZA, hvilket indikerer, at AZA-behandlede celler standsede at replikere og døde. Disse observationer bekræftede, at demethylering skal analyseres efter 24 timer og ved en uM medikamentkoncentration at udelukke forstyrrende virkninger af lægemiddeltoksicitet.

Array-baserede genom-dækkende DNA methylering analyse

For at analysere DNA methylering mønstre af HCT116 celler på en genom-plan vi brugte Infinium methylering profilering at afhøre status methylering af 27,578 CG dinucleotider repræsenterer 14,475 associerede gener [11], [19]. Methylering af individuelle loci blev bestemt ved gennemsnitlig beta (AVB) værdier, der lå fra 0 (umethyleret) til 1 (fuldstændig denatureret). Baseret på tidligere undersøgelser [19], kun CGs som viste en reduktion eller forøgelse i deres AVB værdi (delta beta, DB) på mindst 0,2, blev anvendt til analyse af methylering ændringer. Biologiske replikater af HCT116 kontrolceller og lægemiddelbehandlede celler viste en meget høj lighed (figur S2A, B, C), hvilket bekræfter den tekniske robusthed af arrayet og den høje specificitet af lægemiddelinducerede methyleringsmønstre.

Efterfølgende dataanalyse klart viste en bimodal fordeling af CG dinucleotid methylering med en lav-methylering peak (13,667 af 27.571 CGs), som blev fundet hos AVB værdier på mellem 0 og 0,2 og en top med høj methylering (8222 af 27.571), som dækkede intervallet fra 0,8 til 1,0 (figur 1C). Som i ubehandlede celler blev bimodal fordeling methylering også observeret efter behandling af celler med AZA og DAC (se figur 1C). Men efter lægemiddelbehandling peak high-methylering (AVB≥0.8 i kontrolceller) blev flyttet, for at sænke methylering værdier og angiver lægemiddelinduceret demethylering.

A, Global methyleringsanalyse (CE), i HCT116-celler behandlet med de angivne koncentrationer af AZA og DAC i 24 timer. B, Time-kursus CE måling af lægemiddel-induceret demethylering hjælp 1 pM AZA eller DAC; Co, ubehandlede HCT116 celler. C, Kernel skøn over Infinium methylering data for ubehandlet (Co) og lægemiddelbehandlede celler tæthed. D, Validering af Infinium methylering data ved hjælp af 454 bisulfit sekventering; methylering data for fire CG loci, målt enten ved Infinium analyser eller af 454 sekventering, korrelerer kraftigt (Pearsons korrelationskoefficient r = 0,84); behandling med AZA og DAC er angivet ved A og D; forskellige loci er angivet med farver: PIK3CG (blå), NTRK3 (grøn), Ells1 (rød), og AFF2 (sort)

For at validere methylering array-resultater, vi brugte meget kvantitativ 454 bisulfit. sekventering [28] for at analysere fire stærkt denatureret CGs der blev demethylerede af lægemiddel-behandling i HCT116 celler. I gennemsnit vi opnåede omkring 300 læser pr CG (se figur S7). Korrelation analyse af bisulfit sekventering data og array-resultater (Figur 1D) viste en meget god samlet aftale for begge metoder (r = 0,84). Disse resultater viser, at Infinium methylering arrayet genererer en nøjagtig gengivelse af HCT116 methyleringsmønster den i vore forsøg.

lægemiddelinducerede demethylering mønstre er ikke-tilfældige

Yderligere analyser af array-data viste, at behandling med AZA resulterede i demethylering (DB≤-0,2) på 6% (852 af 13.911) af CG’erne methyleret i kontrolceller (Figur 2A). Viser en endnu højere effektivitet, DAC behandling induceret demethylering på 11% (1487 af 13.911) af disse CG sites (figur 2B). En Wilcoxon rank sum test bekræftede betydningen af ​​forskellen mellem methylering i aza og DAC-behandlede celler (figur 2C,

P

2 × 10

-16). Den større effektivitet af DAC-medieret demethylering på genspecifikke niveau er i overensstemmelse med vores globale methyleringsanalyse i HCT116-celler (figur 1A, B).

methylering ændringer i HCT116-celler behandlet i 24 timer med AZA (A ) eller DAC (B); blå prikker og tal repræsenterer demethyleret CGs (DB≤-0,2). C, Boxplots viser fordelingen af ​​denatureret CGs i HCT116 kontrolprøver og celler behandlet med AZA eller DAC; sorte streger angiver medianerne, hak standard fejl, kasser den interkvartile område, og whiskers den 2.5th og 97.5th percentiler. D, Venn diagrammer angiver overlappende demethylerede CGs i lægemiddelbehandlede celler.

Baseret på den iagttagelse, at demethylering mønstre viste sig at være overraskende specifik med høj inter-kopiere reproducerbarhed, vi spekulerede på, om begge lægemidler deler almindeligt demethyleret CG dinucleotider. At identificere almindeligt demethylerede CGs vi grupperet AZA og DAC replikerer henholdsvis og fandt en betydelig overlapning af CGs der blev demethylerede af begge lægemidler (Figur 2D). Denne overlapning var signifikant større end forventet ved tilfældig demethylering (

P

2 × 10

-16, Fishers eksakte test), hvilket indikerer, at specifikke loci fortrinsvis er demethyleres af AZA og DAC. Trods den udbredte demethyleringsmiddel aktivitet af AZA og DAC, et betydeligt antal CG dinukleotider forekom resistente over for lægemiddel-induceret demethylering i HCT116-celler (figur 2A, B).

Modstand mod lægemiddelinduceret demethylering meste overvundet i DNMT1 ; DNMT3B dobbelt knockout celler

For yderligere at karakterisere CG’erne resistent over for narkotika-induceret demethylering vi opnåede methylering profiler fra HCT116 celler med stærkt reducerede niveauer af DNMT1 og fuldstændigt tab af DNMT3B (DKO celler). Data analyse afslørede udtalt demethylering i DKO-celler med mere end 85% af methylerede CGs bliver demethyleret (figur 3A). DKO-celler viste også den største grad af demethylering repræsenteret ved median DB-værdier på mindre end -0,55 i forhold til kontrol-celler (figur 3B). Til sammenligning, vi observerede signifikant (

P

2 × 10

-16, Wilcoxon rank sum test). Lavere grader af demethylering for AZA og DAC (figur 3B)

A , DKO celler viser betydelige forskelle i forhold til HCT116 celler i deres methylering mønster; blå prikker og tal repræsenterer demethyleret eller hypermethyleret CGs (DB≤-0,2 eller ≥0.2). B, Boxplots viser demethylering (DB) i lægemiddelbehandlede HCT16 celler og DKO celler; sorte streger angiver medianerne, hak standard fejl, kasser den interkvartile område, og whiskers den 2.5th og 97.5th percentiler. C, Sammenligning af relativ middelværdi methylering af lægemiddelbehandlede celler og DKO celler som bestemt ved den globale genomisk methylering analyse (CE) og Infinium methylering analyse. D, Venn diagrammer angiver overlappende demethylerede CGs mellem lægemiddelbehandlede celler og DKO celler.

Vi næste sammenlignede methylering niveauet af gen-associerede CGs afledt af Infinium array til global methylering målt ved kapillarelektroforese middelværdi (CE) (figur 3C). Foruden Infinium methyleringsanalyse, CE aflæser også CGs i repetitive elementer, som omfatter størstedelen af ​​methyleret DNA i det humane genom [34]. Interessant graden af ​​demethylering af hele genomisk DNA altid var højere end genspecifik demethylering. Dette antyder, at CGs i repetitive elementer blev mere effektivt demethyleres end gen-associerede CGs. Når vi sammenlignet demethylering mønstre af lægemiddelbehandlede og knockout-cellelinier, fandt vi, at 92% af CGS demethylerede af AZA og 90% af CGS demethylerede af DAC også blev demethyleret i DKO celler (figur 3D). Vores resultater tyder dog, at lægemiddelinduceret demethylering af specifikke gener er relativt ineffektivt i forhold til hele genomet og at DNMT-manglende celler.

Drug-induceret demethylering af cancer-relaterede og bona fide tumorsuppressorgener

Vi analyserede næste lægemiddel-induceret demethylering i et panel af cancerassocierede gener (tilpasset fra GoldenGate Methylering Cancer panel i, Illumina). Ud af 807 cancer-associerede gener i dette panel, 784 (repræsenteret ved 2.125 CGs) var også til stede på Infinium methylering chip. Analysen af ​​vores methylering data viste, at cancerrelaterede gener var mere stærkt methylerede end ikke-cancerrelaterede gener, som er til stede på Infinium platform, men ikke på GoldenGate (figur 4A). Endvidere blev cancer-relaterede methylering stærkt reduceret i DKO celler (figur 4A).

A, Median methylering niveauer af kræftrelaterede og ikke-kræftrelaterede CGs i ubehandlede celler (CO), lægemiddelbehandlede celler (AZA, DAC) og DKO-celler. B, Heatmap af CG-methylering i cancerassocierede gener. C, Heatmap af hypermethyleret bona fide tumor suppressor-gener i lægemiddelbehandlede og DNMT knockout celler.

En detaljeret analyse viste, at ud af 2125 cancer-associeret CGs, et sæt af 906 CGs blev hypermethyleret ( AVB≥0.8) i HCT116 kontrolceller. DAC demethyleres disse hypermethyleret cancerassocierede gener med en lignende effektivitet som AZA (figur 4B). Interessant vi observeret, at næsten alle gener blev kraftigt demethyleres i DKO-celler. Lignende resultater blev også opnået for et sæt hypermethyleret bona fide tumorsuppressorgener (figur 4C). Disse data illustrerer yderligere evne DAC og AZA til demethylate tumorsuppressorgener, og foreslå, at narkotika-induceret samlede gen-specifikke demethylering er sammenligneligt svag.

Ikke-CG øer og meget denatureret CGs er fortrinsvis demethylerede

For yderligere at forfine vores analyse, adskiller vi mellem CGI og ikke-CGI-associeret CGs. Som forventet [35], [36], CGs i ikke-CGI’er var overvejende methylerede (3667 af 7513, AVB≥0.8), mens dem i CGI’er var for det meste ikke-methylerede (12.782 af 20.002, AVB≤0.2) (figur 5A). Derudover har vi også observeret en fremtrædende brøkdel af meget methylerede CGs der var forbundet med CGI’er (4527 af 20.002, AVB≥0.8), hvilket er i overensstemmelse med CGI hypermethylering i cancer [6]. Interessant, vores resultater viser, at både, AZA og DAC, demethyleres en højere andel af methylerede CGs ikke er beliggende i CGI’er. Specifikt i HCT116-celler, AZA demethyleres 3,0% (219 af 7224) af methylerede CG dinucleotider i CGI’er men 9,5% (633 af 6687) methylerede CGs i ikke-CGI’er (figur 5B); DAC demethyleres 6,6% (474 ​​af 7224) af CG dinucleotider i CGI’er men 15,2% (1013 af 6687) CGs i ikke-CGI’er (figur 5C). Vi konkluderer derfor, at CG dinucleotider inden CGI’er fortrinsvis blev remethylated efter narkotika-induceret passiv demethylering (

P

2 × 10

-16, Fishers eksakte test).

A, Boxplots indikerer forskelle i methylering mellem CGI’er og ikke-CGI’er. B, Boxplots show demethylering angivne virkningsgrad af DB-værdier i aza og DAC-behandlede HCT116 celler afhængige af CG association med CGI’er. For A og B, sorte streger angiver medianerne, hak standard fejl, kasser den interkvartile afstand, og whiskers den 2.5th og 97.5th percentiler. C, Boxplots viser demethylering effektivitet som en funktion af graden af ​​CG-methylering i aza og DAC-behandlede HCT116 celler. Methylering niveauer blev grupperet i 10% intervaller fra 0 til 100% methylering; sorte mærker betegne medianerne, kasser den interkvartile range, og knurhår den 2.5th og 97.5th fraktiler.

For at analysere, om demethylering effektivitet er en funktion af graden af ​​CG methylering, vi grupperet CGs ved deres methylering niveau i 10 intervaller fra 10% til 100% methylering og fast besluttet på i hvilket omfang CGs i forskellige intervaller blev demethyleret. Vores resultater viser, at aza og DAC-induceret demethylering var mere effektivt for stærkt methylerede CGs (methylering intervaller fra 60% til 100% methylering). Betydningen af ​​denne effekt blev yderligere illustreret ved en tilsvarende undersøgelse af demethylering effektivitet i DKO-celler. Her blev CGs af alle methylering niveauer demethyleret lige godt, hvilket fremgår af den konstant stigende afstand af deres medianer til baseline (figur 5D). Vi konkluderer derfor, at AZA og DAC fortrinsvis føre til demethylering af stærkt methylerede CG dinucleotider.

Da ikke-CGI-associerede CGs viser højere methylering niveauer end CGI-associeret CGs (figur 5A), vi yderligere analyseret, hvis forskellen methylering af begge grupper resulterede i den observerede forskel i demethylering effektivitet mellem cGI- og ikke-CGI-associeret CGs (figur 5B, C). Til dette formål har vi grupperet CGs, i henhold til deres methylering niveau i ubehandlede celler, i intervaller på lige methylering og bestemt demethylering af CGs i CGI’er og ikke-CGI’er (Tal S3, S4). Denne analyse bekræftede, at for methylering mængder større end 50-60% i HCT116-celler (mere end 20-30% for HL60-celler, se nedenfor), CGs i ikke-CGI’er blevet markant mere demethyleret end CGs i CGI’er.

Drug-induceret demethylering i myeloid leukæmi-celler

Vi forsøgte at bekræfte vores tidligere fund i en model mere nært beslægtet med den godkendte indikation af DAC og AZA. Til dette formål har vi behandlede HL-60 myeloide leukæmiceller i 24 timer med medikamentkoncentrationer, der induceres i den stærkeste demethylering respons (0,5 uM DAC eller AZA) og igen fremstillet methylering profiler ved Infinium analyse. Resultaterne viste, at behandling med AZA resulterede i stærk demethylering (DB≤-0,2) på 16% (1.839 af 11.406) af CG’erne methyleret i kontrolceller (figur 6A). DAC behandling induceret demethylering af 8% (941 af 11.406) af disse CG sites (figur 6b). Methylering niveauer mellem lægemiddelbehandlede celler afveg signifikant (

P

2 × 10

-16, Wilcoxon rank sum test), som beskrevet ovenfor for HCT116 celler, og vi igen ses en kraftig overlapning CGs demethyleres ved AZA og DAC (fig S5E). Sammenligningen af ​​CGI-associerede CGs og ikke-CGI-associerede CGs viste, at CGs i CGI’er var mindre denatureret end i ikke-CGI’er, hvilket er i overensstemmelse med vores resultater i HCT116 celler. Også, som tidligere observeret i HCT116 celler, AZA og DAC demethyleres CGs i ikke-CGI’er mere effektivt end i CGI’er i HL60-celler (Figur 6C, D) (

P

2 × 10

– 16, Wilcoxon rank sum test). I overensstemmelse med vores resultater i HCT116 celler, lægemiddel-induceret demethylering var også mere effektivt for stærkt methylerede CGs i HL60 celler (figur 6E, F).

methylering ændringer i HL60 celler behandlet i 24 timer med AZA (A) eller DAC (B); blå prikker og tal repræsenterer demethyleret CGs (DB≤-0,2). C, D, Boxplots show demethylering angivne virkningsgrad af DB værdier i aza og DAC-behandlede HCT116 celler afhængige af CG association med CGI’er; sorte streger angiver medianerne, hak standard fejl, kasser den interkvartile område, og whiskers den 2.5th og 97.5th percentiler. Boxplots viser demethylering effektivitet som en funktion af graden af ​​CG-methylering i E, aza- og F, DAC-behandlede HL60-celler. Methylering niveauer blev grupperet i 10% intervaller fra 0 til 100% methylering; sorte mærker betegne medianerne, kasser den interkvartile afstand, og whiskers de 2.5th og 97.5th percentiler.

Modstand mod demethylering korrelerer med PRC2 belægning og transskriptionsfaktorbindende

Vi endelig anset potentiale molekylære mekanismer, som kan modulere lægemiddel-induceret demethylering effektivitet. Tidligere undersøgelser har antydet, at specifik binding af Polycomb komplekser (PRC2) kan inducere hypermethylering af genpromotorer under tumorigenese [37], [38]. Følgelig kan PRC2-associerede regioner være prædisponeret for hurtig remethyleringen efter replikation. Således overdraget vi genom-dækkende forening data for SUZ12, europæiske demokratifond, og H3K27 trimethylation [39] til de tilsvarende CGs på Infinium chip. Vores analyse viste, at CGs forbundet med de interrogerede PRC2 komponenter viser højere median methylering end CGs ikke forbundet med PRC2 (figur 7A). Interessant PRC2-associerede CGs var signifikant mere resistente over for demethylering ved AZA og DAC (figur 7B, C).

A, Boxplots viser fordelingen af ​​CG-methylering i PRC2-associeret CGs og ikke-PRC2-associeret CGs i HL60-celler. B, C, Boxplots show demethylering angivne virkningsgrad af DB værdier i aza og i DAC-behandlede HL60-celler er afhængige af association med PRC2 komponenter. For A, B, og C sorte streger angiver medianerne, hak standard fejl, kasser den interkvartile range, og knurhår den 2.5th og 97.5th fraktiler. D, Venn diagrammer angiver CGs som ikke blev demethyleret (AVB≥0.8) i stof behandlet HCT116 og HL60 celler og i DKO celler. E Procentdel af demethylering-resistente CGs forbundet med PRC2 komponenter i HCT116 og HL60 celler, og for overlappende CGs af begge cellelinier (HCT116 HL60). F, Betydningen af ​​berigelse af transkriptionsfaktorbindingssites i gener med demethylering-resistente CGs i HCT116 og HL60-celler og med CGs der blev demethylerede af AZA og DAC i HCT116 og HL60-celler (følsomme til demethylering). Heatmap kolonner repræsenterer log (

P

værdier) for berigelse af 130 transkriptionsfaktorer.

For at forfine denne analyse, vi efterfølgende fokuseret på demethylering-resistente CGs. Vi identificerede et sæt af 1129 gen-associerede CGs som var resistente over for demethylering af AZA og DAC i HL60 celler (AVB≥0.8). Interessant, 75% af disse CGs var også resistente over for lægemiddel-induceret demethylering i HCT116 celler (figur 7D). En detaljeret analyse viste, at PRC2 komponenter var stærkt beriget på promotorområder CGS resistente over for demethylering i HCT116 og HL60-celler, såvel som i overlappende resistent CGs af begge cellelinier (figur 7e). For at identificere yderligere særlige kendetegn ved demethylering-følsomme og resistente CGs analyserede vi også, hvis gener huser demethylering-resistente CGs er karakteriseret ved forskellige sæt af transskription faktor bindende motiver i forhold til gener, der bliver demethyleret. Brug af softwaren værktøjet PSCAN [29], analyseret vi tilstedeværelsen af ​​bindingssteder for 130 transkriptionsfaktorer i 644 gener (851 CGS), der var resistente over for demethylering i HCT16 og HL-60-celler og 121 gener (128 CGS), der blev demethylerede i begge cellelinier efter lægemiddelbehandling. Analysen afslørede, at demethylering-følsomme og -resistente CGs er forbundet med gener, der viser en komplementær berigelse af transkriptionsfaktor-bindingssites (figur 7F, fig S8). Interessant, de tilsvarende transkriptionsfaktorer også tilhøre forskellige transkriptionsfaktor familier (se figur S9). For eksempel bindingssteder af Forkhead boks (Fox) transkriptionsfaktorer er beriget i demethylering følsomme gener grundforskningen Helix-loop-helix (bHLH) transcription faktor binding sites er beriget med demethylering resistente gener. Disse resultater bekræfter den opfattelse, at specifikke molekylære mekanismer, baseret på sekvens kontekst og kromatin konfiguration, er involveret i reguleringen af ​​narkotika-induceret DNA demethylering.

Diskussion

rolle DNA-methylering i tumor cellebiologi er blevet systematisk analyseret i HCT116 celler og DNMT knockout celler i to tidligere undersøgelser [16], [17]. Disse undersøgelser udnyttede den indirekte tilgang af farmakologisk demaskering [40] for at identificere denatureret gener gennem ændringer i deres transskriptionsprofilen. Interessant seneste data viser, at AZA og DAC fremkalde forskellige sæt af gener med kun lidt overlap [41].