PLoS ONE: Androgen Undertrykker spredning af Androgen receptor-positiv kastrationsresistent prostatacancerceller via hæmning af Cdk2, CyclinA, og Skp2

Abstrakt

De fleste af prostatakræft (PCA) patient, der modtager androgen ablation terapi i sidste ende udvikle kastrationsresistent prostatacancer (CRPC). Vi har tidligere rapporteret, at androgen behandling undertrykker Skp2 og c-Myc gennem androgen receptor (AR) og induceret G1 cellecyklusstop i androgen-uafhængige LNCaP 104-R2-celler, en sen fase CRPC cellelinie model. Imidlertid blev mekanismen for androgen regulering af Skp2 i CRPC celler ikke fuldt forstået. I denne undersøgelse undersøgte vi androgen regulering af Skp2 i to AR-positive CRPC cellelinje modeller, LNCaP 104-R1 og PC-3

is celler. Den tidligere ene er en tidlig fase androgen-uafhængige LNCaP celler, mens den senere man er PC-3 celler igen udtrykker enten vildtype AR eller mutant LNCaP AR. Proliferation af LNCaP 104-R1 og PC-3

is celler ikke er afhængig af, men undertrykkes af androgen. Vi observerede i denne undersøgelse, at androgen behandling reducerede protein ekspression af Cdk2, Cdk7, cyklin A, cyclin H, Skp2, c-Myc, og E2F-1; mindsket phosphorylering af Thr14, Tyr15, og Thr160 på Cdk2; nedsat aktivitet af Cdk2; induceret protein niveau af p27

Kip1; og forårsagede G1 cellecyklusstop i LNCaP 104-R1 celler og PC-3

AR celler. Overekspression af Skp2 protein i LNCaP 104-R1 eller PC-3

AR celler delvist blokeret akkumulering af p27

Kip1 og øget Cdk2 aktivitet under androgen behandling, som delvist blokeret de androgene undertrykkende virkning på spredning og cellecyklus. Analysere on-line-gen-array data for 214 normale og PCA prøver indikerede, at genekspression af Skp2, Cdk2 og cyclin A positivt korrelerer med hinanden, mens Cdk7 negativt korrelerer til disse gener. Disse observationer antydede, at androgen undertrykker spredning af CRPC celler delvist gennem hæmning af cyclin A, Cdk2, og Skp2

Henvisning:. Kokontis JM, Lin HP, Jiang SS, Lin CY, Fukuchi J, Hiipakka RA, et al. (2014) Androgen Undertrykker spredning af Androgen receptor-positiv kastrationsresistent prostatacancerceller via hæmning af Cdk2, CyclinA, og Skp2. PLoS ONE 9 (10): e109170. doi: 10,1371 /journal.pone.0109170

Redaktør: Allen Gao, UC Davis Comprehensive Cancer Center, USA

Modtaget: Juli 17, 2014 Accepteret: August 28, 2014; Udgivet: 1 okt 2014

Copyright: © 2014 Kokontis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af CA58073 og AT00850 fra National Institute of Health i USA for SL; CS-103-PP-14 (National Health Research Institutes), CA-103-SP-01 (Ministeriet for Sundhed og Velfærd), MEST 103-2325-B-400-001 (Ministeriet for Videnskab og Teknologi) i Taiwan for CPC og National Core Facility Program for Biotechnology fra Taiwan (NSC 102-2319-B-400-001). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Den tilsvarende forfatter Dr. Chih-Pin Chuu er en PLoS ONE Editorial Board medlem, men forfatterne bekræfte, at dette ikke ændrer tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

i 1941, Charles Huggins rapporterede, at androgen ablation terapi forårsagede regression af primær og metastatisk androgen-afhængig prostatacancer (PSA) [1]. Androgen ablation, under anvendelse luteiniserende hormon-frigivende hormon-agonister (LH-RH) eller bilateral orchiektomi, er blevet en primær behandling for metastatisk prostatacancer [2]. Størstedelen af ​​patienterne oplever en indledende hurtigt fald i PSA efterfulgt af en langsommere fald til nadir [2]. Men 80-90% af patienterne i sidste ende udvikle kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) 12-33 måneder efter androgen ablation behandling med en median overlevelse på 12-24 måneder [3]. Androgen receptor (AR) spiller vigtig rolle i udvikling, progression, og metastase af prostatacancer [4]. Stigning i AR mRNA og protein er observeret i CRPC tumorer sammenlignet med de primære prostatatumorer [5], [6].

LNCaP er en almindeligt anvendt cellelinje etableret fra en human lymfeknude metastatisk læsion af prostata-adenocarcinom. LNCaP-celler udtrykker androgen receptor (AR) og prostataspecifikt antigen (PSA) [7], [8]. Tidligere har vi udviklet et PCa progression model ved hjælp af LNCaP celler. Androgenafhængige LNCaP 104-S celler blev dyrket i androgen-depleterede betingelser at efterligne patienter, der får androgen ablation terapi [9] – [11]. En lille population af kastrationsresistent celler opkaldt LNCaP 104-R1 opstået efter 10 måneder [9] – [11]. Efter yderligere 8 måneder dyrkning i androgen-udtømte medium, LNCaP 104-R1-celler gav anledning til LNCaP 104-R2-celler, der prolifererede meget hurtigere end 104-R1-celler [10]. Proliferation af LNCaP 104-R1 og 104-R2-celler er androgen-uafhængig, men undertrykkes af fysiologiske koncentrationer af androgen [9], [10], [12], [13]. LNCaP 104-R1 og 104-R2-celler efterligner tidlige og sene CRPC celler henholdsvis [14]. Efter androgen behandling, de flertal af LNCaP 104-R1 og 104-R2 celler undergik G1 celle celler arrestere og døde til sidst med kun en lille population af celler overlevede og genoptaget voksende, opkaldt R1ad [10] og R2Ad [15], hhv. Imidlertid proliferation af R1ad celler er androgen-afhængig og kan styres af androgen ablation terapi [12], mens proliferation af R2Ad celler er androgen-ufølsom og reagerer ikke på yderligere hormonbehandling [15]. Derfor kan patienten med tidlig fase CRPC tumorer gavn af androgen behandling. Vi har tidligere rapporteret, at androgen behandling undertrykker S-fase kinase-associeret protein 2 (Skp2) og c-myc gennem AR i LNCaP 104-R2-celler, således at inducere G1 cellecyklusstandsning og vækstinhibering [15]. Onkogen aktivitet og androgen regulering af c-myc er blevet undersøgt intensivt. Dog er mindre forstået, androgen regulering af Skp2 i CRPC celler.

Skp2, en F-box protein, og dets cofaktor Cks1 er substrat-targeting underenheder af SCF (Skp1 /CUL1 /F-box protein) ubiquitin ligase kompleks. SCF er en E3 ubiquitin ligase kompleks, der regulerer S indtastning af celler fase ved at inducere nedbrydningen af ​​cyclin-afhængige kinaseinhibitorer p21

Cip1 og p27

Kip1 [16], [17]. Skp2 mål p27

Kip1 ved phosphorylering p27

Kip1 på T187 for ubiquitinering og nedbrydning [18] – [20]. Skp2 danner et stabilt kompleks med cyclin A-cyclin-afhængig kinase 2 (Cdk2) [20]. Skp2 phosphoryleres med Cdk2 på Ser64 [20] og ved Akt på Ser72 [21]. Phosphorylering af Ser64 og Ser72 på Skp2 bidrager til stabilisering af Skp2 ved at forhindre dens association med APC /CCdh1 [17], [18], [20], [21]. Både luminale og basale epitelceller i normal prostata udviser meget lave Skp2 niveauer, dog Skp2 niveauerne stiger dramatisk i både prostata intraepithelial neoplasi (PIN) og PCa [22], [23]. Opregulering af Skp2 korrelerer at sænke p27

Kip udtryk, højere score Gleason, og mere avanceret patologisk stadium af PCa [22], [24]. Opregulering af Skp2 i PCa er også uafhængigt forbundet med en højere risiko for PCa tilbagefald efter kirurgi [22], [24]. Skp2 overekspression i PCA-celler stimulerer PCa celleproliferation og forøger tumorigenese i xenograft tumor model [25].

Cdk2 er medlem af cyclin-afhængige kinase familie af Ser /Thr-proteinkinaser [26]. Kompleks af Cdk2-cyclin E er nødvendig for overgangen af ​​celler fra G1 til S-fasen, mens binding mellem Cdk2 og cyclin A er nødvendig for at avancere i S-fasen [26]. Aktivering af Cdk2 komplekser kræver dephosphorylering af Thr14 og Tyr15 på Cdk2 ved cdc25 phosphatase og phosphorylering af Thr160 på Cdk2 [26], [27], som medieres ved CAK, et kompleks af Cdk7 og cyclin H [28]. Cyclin A er et medlem af cyclin familie, en gruppe af proteiner, der fungerer i regulering progression gennem cellecyklusen. Transkription af cyclin A reguleres stramt og synkroniseres med cellecyklusprogression af transkriptionsfaktoren E2F i en negativ tilbagekoblingssløjfe [29].

LNCaP-celler udtrykker en mutant AR (T877A), der viser afslappet ligandbindingsspecificitet [30 ], [31], vi således frembragte AR-positive PC-3 celler ved overekspression enten vildtype AR (PC-3

AR) eller LNCaP mutant AR (PC-3

LNCaP-AR) i AR-negative PC-3 celler som andre CRPC celle tilbageholdsret. Vi brugte LNCaP 104-R1 celler, en model efterligner tidligt tidspunkt CRPC samt PC-3

AR og PC-3

LNCaP-AR celler til at undersøge androgen regulering af Skp2 og relaterede cyclinafhængige kinaser ( CDK’er) samt celleproliferation i disse CRPC celler.

Materialer og metoder Salg

Materialer

Syntetisk androgen R1881 og antiandrogen Casodex (bicalutamid) blev opnået fra Perkin Elmer (Boston , MA, USA) og AstraZeneca (Wilmington, DE, USA), hhv. [A-

32P] dCTP (3000 Ci /mmol) og [g-

32P] ATP (5000 Ci /mmol) var fra Amersham (Arlington Heights, IL, USA). Peptider blev syntetiseret ved University of Chicago Cancer Research Center oligopeptid syntese facilitet.

Celledyrkning

LNCaP 104-R1 celler og PC-3 underlinjer var gaver fra Dr. Shutsung Liao (The University of Chicago, IL, USA). LNCaP 104-R1-celler blev afledt fra parentale androgenafhængige LNCaP 104-S-celler, som blev genereret fra LNCaP FGC klon (ATCC CRL-1740). LNCaP 104-R1-celler og PC-3 underlinjer er blevet beskrevet i tidligere publikationer [10] – [13], [15], [32] – [34]. LNCaP 104-R1, PC-3, PC-3

AR, og PC-3

LNCaPAR celler opretholde i DMEM med 10% kul-strippet FBS (CS-FBS).

Western blotting analyse

LNCaP 104-R1-celler eller PC-3 underlinjer blev vasket med PBS og lyseret i 2 × Laemmli puffer uden bromphenolblåt-farvestof. Proteinkoncentrationen af ​​cellelysaterne blev bestemt med Bradford reagens (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Antistof for Skp2 og p21

CIP1 /WAF1 var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Californien, USA). Antistoffer til cyclin E, Cdk2, og phospho-Cdk2 Thr160 var fra Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Cyclin A og E2F-1-antistoffer var fra Millipore (Billerica, MA, USA). Den p27

Kip1 antistof var fra BD Transduktion Laboratories (Lexington, KY, USA). Phospho-Cdk2 Tyr15 og phospho-Cdk2 Thr14 antistoffer blev indkøbt fra Epitomics (Burlingame, CA, USA). Cdk7 og cyclin H var fra Abnova (Taipei, Taiwan). Påvisning af α-tubulin (Sigma, St. Louis, MO, USA) eller β-actin (Novus, Littleton, CO, USA) blev anvendt som indlæsning kontrol. Til SDS-PAGE af Cdk2, justering af pH af adskillende gel buffer til 8,5 var nødvendig for løsning af hurtigere migrerende isoform. Intensitet af bands for forskellige proteiner blev kvantificeret med Epson Stylus TX130 hjælp UN-SCAN-IT gel 6.1 software.

Cell proliferation assay

LNCaP 104-R1 celler eller PC-3 underlinjer blev podet ved en densitet på 3 x 10

3 celler /brønd i plader med 96 brønde med 100 pi DMEM-medium indeholdende 10% CS-FBS. Proliferationsassays blev udført som tidligere beskrevet [13], [15], [33] – [39]. Alle readouts blev normaliseret til gennemsnittet af kontrolgruppen tilstand i hvert enkelt eksperiment. Eksperimentet blev gentaget tre gange. Ti brønde blev anvendt til hver tilstand. Den middelværdi og standardafvigelse repræsenterede gennemsnittet og standardafvigelsen henholdsvis af resultaterne fra alle 30 brønde i de tre forsøg.

flowcytometrisk analyse

Celler blev podet ved tætheden af ​​5 × 10

5 celler i 6 cm-skåle. Flowcytometrisk analyse blev udført som beskrevet tidligere [13], [15], [35] -. [37], [39]

Real-Time kvantitativ polymerasekædereaktion

Total RNA var isoleret under anvendelse af TriZol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) og blev behandlet med DNase i (DNA-fri, Ambion, Austin, TX). Revers transskription blev udført med vilkårlige hexamerer og Moloney leukæmivirus revers transkriptase (Omniscript; Qiagen, Valencia, CA). TaqMan-primer /probe blev designet ved hjælp Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA). 5′-enden af ​​proben blev mærket med reporter-fluorescerende farvestof FAM. 3′-enden af ​​probe blev mærket med udslukningsfarvestof TAMRA. Sekvenserne af CDKN1B primere, 5′-CCGGTGGACCACGAAGAGT-3 ‘og 5′-GCTCGCCTCTTCCATGTCTC-3′; CDKN1B probe, 5’-AACCCGGGACTTGGAGAAGCACTGC-3 ‘. Real-time PCR blev udført på en ABI PRISM 7700-system (Applied Biosystems) under anvendelse af QuantiTect Probe PCR-protokol (Qiagen). RRNA Kontrol kit (Applied Biosystems) blev anvendt til at normalisere transkriptniveauer mellem prøverne.

Isolering af Skp2 cDNA

A Skp2 cDNA blev isoleret ved PCR-amplifikation fra en LNCaP 104-R1 Lambda ZAP- II cDNA bibliotek under anvendelse af følgende primere afledt fra Skp2 sekvens: 5′-CAGCTCTGCAAGTTTAATGC-3 ‘og 5′-AAGAAGAGACACCATCCTGC-3’. Følgende program blev anvendt: pre-amplifikation ved 94 ° C 5 min, 55 ° C 2 min, 30 cyklusser ved 72 ° C 2 min, 94 ° C 0,5 min, 55 ° C 0,5 min, efterfulgt af 7 minutter ved 72 ° C. Pfu (Stratagene) blev anvendt som DNA-polymerase og dimethylsulfoxid ved 10% slutkoncentration blev anvendt i amplifikationsreaktionen. En 1345 bp amplifikationsprodukt blev indsat i EcoRV-spaltet pBluescript II vektor til automatiseret dideoxy-sekvensanalyse. One Skp2 klon blev valgt til sekvensverificering og blev anvendt i alle efterfølgende eksperimenter. Den Skp2 cDNA blev overført fra denne pBluescript-klon til pMV7 retroviral vektor til konstitutiv ekspression i LNCaP 104-R1-celler.

Stald retroviral infektion af Skp2

104-R1-celler blev inficeret med pMV7 retrovirus indeholdende Skp2 skær, der blev genereret i ΦNX-ampho pakkeceller under anvendelse af fremgangsmåder beskrevet tidligere [10]. Den ΦNX-ampho pakning cellelinje blev leveret af Garry Nolan fra Stanford University. Stabilt inficerede celler blev udvalgt af G418.

Angivelse af GST-Skp2 protein

SmaI-HindIII fragmenter af Skp2 cDNA’erne blev indsat i SmaI-HindIII-cut pGEX-KG [40]. Plasmiderne blev transficeret ind i E. coli BL-21-CodonPlus-RIL-celler (Stratagene) for isopropylthiogalactosid-induceret ekspression af glutathion svovl transferase (GST) -Skp2 fusionsproteiner.

In Vitro

assay af Cdk2 aktivitet Salg

Cellelysater blev fremstillet ud fra LNCaP 104-R1-celler inficeret med MV7 tom virus og LNCaP 104-R1 celler, der overudtrykker Skp2 dyrket i 3 dage i nærvær eller fravær af 10 nM R1881. Assay af Cdk2-aktivitet under anvendelse histon H1 som substrat blev beskrevet tidligere [10]. For Cdk2 phosphorylering af et syntetisk Skp2 peptid, to 12 peptider restkoncentrationer (GHPESPPRKRLK og GHPEAPPRKRLK) svarende til positionerne 60 til 71 i vildtype Skp2 protein og blev anvendt som substrater i kinasereaktioner med immunpræcipiteret Cdk2. Cellelysater blev fremstillet ud fra LNCaP 104-R1 celler dyrket i 4 dage i nærvær eller fravær af 10 nM R1881. Portioner af lysat (1 mg totalt protein) fremstillet som beskrevet tidligere [10] blev inkuberet med 2 mg Cdk2 antistof bundet til protein G-agarose-perler. Efter vask 3 gange i lyseringsbuffer og 2 gange i kinasepuffer (50 mM HEPES, pH 7,5; 10 mM MgCI2, 0,5 mM DTT og 0,02% Triton X-100), blev perlerne inkuberet med 10 mCi [g-32P] ATP og 20 mM peptid i et samlet volumen på 25 ml til 30 minutter ved 30 ° C. Reaktioner blev afsluttet ved tilsætning af 3 ml 0,5 M EDTA og 10 ml prøver blev spottet på 2,5 cm P-81 filterskiver (Whatman). Skiver blev vasket 5 gange med 0,5% H3PO4 og en gang med 50% ethanol /0,05% H3PO4 for at fjerne ikke-inkorporeret ATP. Inkorporeret etiket blev bestemt ved væskescintillationsspektrofotometri. Blindprøver bestod af kinasereaktioner anvendelse af antistof-loaded agaroseperler der ikke er inkuberet med cellelysat. Reaktioner blev udført i fire eksemplarer.

AR og Skp2 overekspression i PC-3-celler

PC-3-celler blev transficeret med LNCX-2 plasmid indeholdende vildtype humane Ar eller LNCaP-celler ‘mutant AR cDNA og selekteret med neomycin G418 som tidligere beskrevet [32]. PC-3 celler, der overudtrykker vildtype AR eller LNCaP mutant AR blev derefter betegnet som PC-3

AR eller PC-3

LNCaP-AR. PC-3

AR celler yderligere transfekteret med LPCX plasmid indeholdende Skp2 cDNA eller LPCX kontrol plasmid blev udvalgt med puromycin. Antibiotika-resistente kolonier blev udvidet og screenet for øget target protein-ekspression ved Western blot analyse.

Offentlig domæne data

Expression profiler af selektive gener fra datasæt, der indeholder tumor og tilstødende normale væv fra PCA patienter, herunder GSE6919 [41], som indeholder 23 normal prostata og 89 prostata karcinom væv og Singh prostata datasæt [42], som indeholder 50 normale prostata kirtel prøver og 52 prostata carcinoma prøver, blev hentet fra Oncomine (http: //www.oncomine .com) uden yderligere behandling.

Dataanalyse

data er præsenteret som gennemsnit +/- SD af mindst tre eksperimenter eller er repræsentative for eksperimenter gentages mindst tre gange. Students t-test (to-halet, parret) blev anvendt til at evaluere den statistiske signifikans af resultaterne fra proliferationsassay eksperimenter. Salg

Resultater

Androgen behandling undertrykt proliferation af AR-rige CRPC celler

Behandling med syntetisk androgen R1881 dosisafhængigt undertrykt celleproliferation af AR-rige LNCaP 104-R1, PC-3 overudtrykker vildtype AR (PC-3

AR), og PC-3 overudtrykker LNCaP mutant AR (PC -3

LNCaPAR) celler, men ikke kontrol AR-negative PC-3-celler (PC-3

LNCX-2) (fig. 1A). Antiandrogen Casodex blokerede androgen undertrykkelse, der bekræfter, at androgen hæmning på celleproliferation var gennem AR (fig. 1A). Behandling med 10 nM R1881 faldt procentdelen af ​​cellepopulation i S-fasen og induceret G1-fasen cellecyklusstop i LNCaP 104-R1, PC-3

AR, og PC-3

LNCaPAR celler, men ikke kontrol PC-3

LNCX-2 celler (fig. 1B, 1C).

(A) LNCaP 104-R1 celler, PC-3 celler med kontrol plasmid LNCX-2 (PC-3

LNCX-2) , PC-3 celler, der overudtrykker vildtype AR (PC-3

AR), og PC-3 celler overekspression LNCaP AR (PC-3

LNCaP-AR) blev behandlet med stigende koncentration af syntetisk androgen R1881 eller antiandrogen Casodex i 96 timer. Relative celleantal blev bestemt ved fluorometrisk DNA-assay beskrevet i Materialer og metoder og blev normaliseret til celleantal af kontrolcellerne (ingen behandling). LNCaP 104-R1, PC-3

LNCX-2, PC-3

AR, og PC-3

LNCaP-AR-celler blev behandlet med eller uden 10 nM R1881 i 96 timer. Procentdel af cellepopulationen af ​​LNCaP 104-R1, PC-3

LNCX-2, PC-3

AR, og PC-3

LNCaP-AR celler i S-fase (B) og G1-fasen (C ) blev bestemt ved PI-farvning flowcytometri. Værdier repræsenterer middel +/- standardfejl afledt fra 5 uafhængige eksperimenter. Asterisk *, **, og *** betegne signifikant forskel

s

0,05,

s

0,01,

s

0,001 henholdsvis den behandlede celler i sammenligning med kontrolceller.

Androgen behandling påvirker cellecyklus regulering proteiner i CRPC celler Salg

Androgen behandling let øget AR ekspression men dramatisk forøget cellecyklusinhibitor p27

Kip1 i LNCaP 104-R1, PC-3

AR, og PC-3

LNCaPAR celler (fig. 2). I den modsatte, androgen behandling faldt protein ekspression af Skp2, Cdk2, phospho-Cdk2 Tyr15, phospho-Cdk2 Thr14, phospho-Cdk2 Thr160, Cdk7, cyclin A, cyclin H, og c-myc i LNCaP 104-R1, PC-3

AR, og PC-3

LNCaPAR celler (fig. 2). Protein niveau af p27

Kip1 blev invers-korreleret til Skp2 i disse CRPC celler, som var konsistent med, at Skp2 målretter p27

Kip1 for ubiquitinering og nedbrydning [18] – [20]. Overflod af p21

Cip1 blev faldet lidt i LNCaP 104-R1 celler, men blev øget i PC-3

AR og PC-3

LNCaPAR celler ved androgen. Overflod af E2F-1 var faldet lidt i LNCaP 104-R1 celler, men blev dramatisk reduceret i PC-3

AR og PC-3

LNCaPAR celler ved androgen. Overflod af cyklin E blev ikke signifikant påvirket af androgen behandling. Aktivering af Cdk2 komplekser kræver dephosphorylering af Thr14 og Tyr15 på Cdk2 ved cdc25 phosphatase og phosphorylering af Thr160 på Cdk2 [26], [27], som medieres ved CAK, et kompleks af Cdk7 og cyclin H [28]. Selvom phosphorylering af Thr14 og Tyr15 svagt reduceret med androgen behandling blev phosphorylering af Thr160 dramatisk undertrykt af androgen behandling, muligvis på grund af reduktionen af ​​Cdk7 og cyclin H proteinekspression (fig. 2). Androgen behandling øget p27

Kip1, cyklin A, og c-myc mens faldt p21

Cip1 og Skp2 i kontrol AR-negative PC-3

LNCX-2 celler. Da androgen ikke påvirkede udbredelsen og cellecyklus progression af PC-3

LNCX-2 celler, roller disse proteiner i PC-3

LNCX-2 celler ikke var klart. Skp2 mål p27

Kip1 for ubiquitinering og nedbrydning [18] – [20]. Men under behandling af 0,1 og 10 nM R1881, genekspression niveau af CDKN1B (p27

Kip1) steg 1,3 og 1,7 gange henholdsvis (fig. 3A). Som c-myc er blevet rapporteret at undertrykke FOXO3a-medieret transkription af CDKN1B [43], reduktion af c-Myc forårsaget af androgen behandling kan bidraget til stigningen af ​​CDKN1B genekspression (fig. 2). Vi mener derfor, at reduktion af nedbrydning protein og forøgelse af gentranskription både bidrog til stigningen af ​​P27

Kip1 proteinniveauet, som derfor kan fremkalde G1 cellecyklusstop i CRPC celler.

Protein udtryk for AR, Skp2, Cdk2, phospho-Cdk2 Tyr15, phospho-Cdk2 Thr14, phospho-Cdk2 Thr160, Cdk7, cyklin E, cyclinA, cyklin H, p21

cip, p27

Kip, c-myc, og E2F-1 var bestemt ved Western blotting assay i LNCaP 104-R1, PC-3

LNCX-2, PC-3

AR, og PC-3

LNCaP-AR celler behandlet med forskellige koncentrationer af R1881 for 96 timer. Protein overflod af α-tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol.

(A), Gene ekspression af CDKN1B blev bestemt i LNCaP 104-R1 celler behandlet med 0, 0,1 eller 10 nM R1881 i 96 timer under anvendelse af QRT-PCR. LNCaP 104-R1-celler behandlet med 10 nm R1881 i nærvær eller fravær af 5 um antiandrogen Casodex i 96 timer. Asterisk * angiver signifikant forskel

s Restaurant 0,05 af de behandlede celler i sammenligning med kontrolceller. (B) Relativ celleantal blev bestemt ved fluorometrisk DNA-assay. (C) Procentdel af cellepopulationen i S-fase blev bestemt ved flowcytometri analyse. Asterisk * angiver en signifikant forskel (

s Restaurant 0,05) af de behandlede celler i sammenligning med kontrolceller. (D) histon H1 phosphorylering blev analyseret under anvendelse Cdk2 immunopræcipiteret fra cellelysat indeholdende 2 mg protein. Relativ radioaktivitet blev bestemt ved scanning med en Storm 860 phosphoimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, USA). Proteinekspression niveau af Cdk2, p27

Kip1, og β-actin blev bestemt ved Western blotting af de samme cellelysater. Overflod af β-actin-protein blev anvendt som indlæsning kontrol.

Androgen behandling undertrykt Cdk2 aktivitet

Cdk2 er en histon H1 kinase ansvarlig for phosphorylering af histon under cellecyklussen overgangen fra G1 til S-fase [44] – [46]. For at bekræfte, at Cdk2-aktivitet blev undertrykt af androgen behandling, anvendte vi histon H1 som substrat for kinaseaktiviteten assay. Reduktion af celleproliferation (fig. 3B) og fald i S-fase cellepopulation (fig. 3C) i LNCaP 104-R1 celler forårsaget af androgen behandling var tæt forbundet med nedgangen af ​​Cdk2-aktivitet som detekteret ved nedsættelsen af ​​phosphorylering af histon H1, formindskelsen af ​​en hurtigere-migrerende form af Cdk2, og en stigning i Cdk inhibitor p27

Kip1 overflod (fig. 3D). Jo hurtigere migrerende Cdk2 er tidligere identificeret som en aktiv form af Cdk2, der er phosphoryleret ved Thr160 [47]. Antiandrogen Casodex behandling blokeret virkningerne af androgen på celleproliferation, cellecyklus, phosphorylering af histon H1, og aktiviteten af ​​Cdk2 (fig. 3B, C, D).

Overekspression af Skp2 blokeret androgen suppression i LNCaP 104- R1 celler

Skp2 phosphoryleres og aktiveres af Cdk2 [20] samt danner et stabilt kompleks med cyclin a og Cdk2 [20]. Vi har tidligere rapporteret, at overekspression af Skp2 delvist blokeret proliferationen af ​​LNCaP 104-R2-celler [15]. I denne undersøgelse, vi bestemt forholdet mellem overekspression Skp2 og Cdk2 aktivitet. Overekspression af Skp2 i LNCaP 104-R1-celler lettet androgen undertrykkelse af Cdk2-aktivitet som bestemt af

in vitro

phosphorylering af histon H1 immunopræcipiteret med Cdk2 (fig. 4A). Måling af kinaseaktivitet i Cdk4 immunpræcipitater fremstillet ud fra disse celler viste ikke forskel (data ikke vist). Overekspression af Skp2 i LNCaP 104-R1-celler delvist reducerede induktionen af ​​p27

Kip1 (fig. 4A), væksthæmning (fig. 4B), og G1 cellecyklusstop (fig. 4C) forårsaget af androgen behandling. Det basale niveau af p27

Kip1 i Skp2-overeksprimeres 104-R1-celler var meget mindre sammenlignet med kontrol 104-R1-celler (Fig. 4A). Dette kan forklare, hvorfor de 104-R1 celler, der overudtrykker Skp2 prolifererede 1,42 gange hurtigere end kontrollen 104-R1-celler (fig. 4B).

(A) Proteinekspression niveau af Skp2 og p27

Kip1 i LNCaP 104-R1-celler inficeret med pMV7 tom retrovirus (kontrol) eller pMV7 retrovirus indeholdende Skp2 blev bestemt ved Western blotting. Celler blev dyrket i 3 dage i nærvær eller fravær af 10 nm R1881. Cdk2 aktivitet blev målt ved

in vitro

phosphorylering af histon H1 ved hjælp af Cdk2 immunpræcipitater. Overflod af β-actin-protein blev anvendt som indlæsning kontrol. (B) Cell proliferation af LNCaP 104-R1-celler inficeret med pMV7 tom retrovirus (kontrol) eller pMV7 retrovirus indeholdende Skp2 behandlet med eller uden 10 nM R1881 i 96 timer blev bestemt ved anvendelse af fluorometriske DNA-assayet og blev normaliseret til celletallet af kontrol gruppe (ingen behandling). (C) Procentdel af LNCaP 104-R1-celler i S-fase blev bestemt ved flowcytometri. Celler blev dyrket i 3 dage i nærvær eller fravær af 10 nm R1881. Asterisk angiver en signifikant forskel (

s

0,05) fra kontrol celler. (D) LNCaP 104-R1-celler blev behandlet med eller uden 10 nM R1881 i 3 dage. Fusionsproteiner af kontrol GST (bane 1-3) og bakterielt udtrykte GST-Skp2 (bane 4-6) bundet til glutathion-agarose-perler blev inkuberet med 200 ug helcellelysater fra ubehandlede og androgen-behandlet 104-R1 celler i nærvær af 10 uCi [

32P] -ATP i 30 minutter ved stuetemperatur. “Nl” repræsenterer som ingen lysat. Phosphorylerede proteiner blev elueret i Laemmli gel loading buffer og separeret på en 10% SDS-PAGE-gel, der derefter blev tørret og eksponeret for Kodak X OMAT AR-film i 3 dage. (E) 104-R1-celler blev behandlet med eller uden 10 nM R1881 i 3 dage. Phosphorylering af elueret GST (bane 1-3) og GST-Skp2 (bane 4-6) fusionsproteiner blev bestemt ved immunpræcipiteret Cdk2. Cdk2 blev immunpræcipiteret fra aliquoter af lysat indeholdende 1 mg protein fremstillet ud fra ubehandlede (bane 2, 5 og 8) eller R1881-behandlede (bane 3, 6 og 9) 104-R1-celler. Kontrol baner (bane 1, 4, og 7) mærket “ni” angivet nogen immunopræcipiteret Cdk2. Cdk2-aktivitet blev bestemt ved metoder beskrevet i Materialer og Metoder.

Androgen regulerer phosphorylering af Skp2 gennem Cdk2

Desværre antistoffer detekterer phosphoryleringen af ​​Ser64 eller Ser72 på Skp2 er ikke kommercielt tilgængelige . For at bestemme om androgenbehandling påvirker phosphorylering af Skp2, inkuberet vi bakterielt udtrykte GST-Skp2 fusionsproteiner bundet til glutathion-agarose-perler med helcellelysater fra ubehandlede og androgen-behandlede LNCaP 104-R1-celler i nærvær af [g-

32P] ATP. Vi fandt, at lysatet fra androgen-behandlet 104-R1-celler indeholdt mindre kinaseaktivitet stand til at phosphorylere de 74 kDa GST-Skp2 fusionsproteiner sammenlignet med lysatet fra ubehandlede celler (fig. 4D). Dette resultat indikerede, at androgen behandling reducerede samlede phosphorylering på Skp2. Vi undersøgte derefter, hvis Cdk2 faktisk phosphorylere Skp2. Når GST-Skp2 fusionsproteiner blev anvendt som substrater i kinasereaktioner med Cdk2 immunopræcipiteret fra LNCaP 104-R1 cellelysater, blev lignende resultater observeret som det fra fig. 4D (fig. 4E). Dette resultat afslørede, at Cdk2 phosphoryleret Skp2 og aktiviteten af ​​Cdk2 til phosphorylering Skp2 blev undertrykt af androgen behandling i LNCaP 104-R1-celler.

Overekspression af Skp2 blokeret androgen suppression i PC-3

AR og PC 3

LNCaPAR celler

Svarende til LNCaP 104-R1 celler, overekspression af Skp2 delvist blokerede de dosisafhængige virkninger af androgen hæmning på celledeling og cellecyklus progression af PC-3

AR celler ( fig. 5).

(A) Protein ekspression af Skp2 blev analyseret ved Western blotting i PC-3-celler re-udtrykkende vildtype AR (PC-3

AR) celler og overudtrykker enten kontrolvektor eller Skp2 i fravær eller nærvær af 10 nM R1881 i 96 timer. Virkning af androgen på celleproliferation (B) eller cellecyklusprogression (C) af disse kloner behandlet med stigende koncentration af R1881 i 96 timer blev bestemt ved 96-brønd proliferationsassay og PI-farvning flowcytometrianalyse hhv. Stjernerne * og ** betegne en signifikant forskel

s

0,05 og

s

. 0,01 henholdsvis mellem behandlingen og kontrol celler

korrelation mellem Skp2, Cdk2, cyclin A, og Cdk7 i PCA tumorer Salg

Ifølge den kendsgerning, at ekspression og aktivitet af Skp2 reguleres af Cdk2 og cyclin A i PCA-celler, og at Skp2, Cdk2 og cyclin A koordineret regulere celleproliferation i PCA celler, vi hypotese, at genekspression niveau af Skp2 (SKP2), Cdk2 (CDK2), og cyklin A (CCNA2) kan vise god positiv korrelation i PCA tumorer. Faktisk analyse af oncomine data viste, at genekspression niveau af SKP2, CDK2, og CCNA2 korrelerede positivt godt i både GSE6919 [41] (fig. 6A) og Singh prostata tumor datasæt [42] (fig. 6B). Som phosphorylering af Thr160 på Cdk2 medieres af Cdk7 [28], bestemte vi, hvis genekspression af CDK7 korreleret til CDK2, SKP2, og CCNA2 i PCA tumorer. Overraskende genekspression af CDK7 negativt korreleret til CDK2, SKP2, og CCNA2 i begge GSE6919 [41] (Fig. 7A) og Singh prostata tumor datasæt [42] (fig. 7B).

Scatter plots viser korrelation af angivne gener i GSE6919 (A) og Singh prostata datasæt (B). Den r-værdi er angivet korrelationskoefficient. Probe ID for CCNA2, CDK2, og SKP2 var 40697_at, 1792_g_at, og 1941_at i GSE6919, og 1943_at, 1792_at, og 39449_at Singh prostata datasæt.

Scatter plots viser korrelation af angivne gener i GSE6919 ( A) og Singh prostata datasæt (B). Den r-værdi er angivet korrelationskoefficient.