PLoS ONE: Differential Virkninger af lægemidler rettet mod kræft stamceller (CSC) og Non-CSC Befolkninger på Lung primære tumorer og Metastasis

Abstrakt

Kræft stamceller (CSCS) menes at være ansvarlig for tumor initiering og tilbagefald efter kemoterapi. Målretning CSCS og ikke-CSCS med specifikke forbindelser kan være en effektiv strategi til at reducere lungekræft vækst og metastase. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge effekten af ​​salinomycin, en selektiv inhibitor af CSCS, med eller uden kombination med paclitaxel, i et metastatisk model. At evaluere virkningen af ​​disse lægemidler i metastase og tumor mikromiljø tog vi fordel af immunkompetente og meget metastatisk LLC musemodel. Aldefluor assays blev anvendt til analyse af ALDH +/- populationer i murine LLC og human H460 og H1299 lungecancerceller. Salinomycin reduceret andelen af ​​ALDH + CSCS i LLC celler, mens paclitaxel øgede sådan befolkning. Den samme virkning blev observeret for H460 og H1299 cellelinier. Salinomycin reducerede tumorsphere dannelse kapacitet LLC med mere end 7 gange, men paclitaxel viste ingen effekt. I

in vivo

eksperimenter, paclitaxel reducerede primær tumor volumen, men øget antallet af metastatiske knuder (p 0,05), hvorimod salinomycin havde ingen effekt på primære tumorer, men reducerede lunge metastase (p 0,05). Kombination af begge lægemidler ikke forbedre virkningen af ​​enkelte behandlinger. ALDH1A1, Sox2, CXCR4 og SDF-1 mRNA-niveauer var højere i metastatiske læsioner end i primære tumorer, og var signifikant forhøjet i begge steder ved paclitaxel behandling. Tværtimod blev sådanne niveauer reduceret (eller i nogle tilfælde ikke ændre), når mus blev administreret med salinomycin. Antallet af F4 /80 + og CD11b + -celler blev også reduceret ved indgivelse af begge lægemidler, men især i metastase. Disse resultater viser, at salinomycin henvender ALDH + lunge CSCS, der har vigtige terapeutiske virkninger

in vivo

ved at reducere metastatiske læsioner. I modsætning hertil paclitaxel (selvom reducere primær tumorvækst) fremmer udvælgelsen af ​​ALDH + celler, der sandsynligvis ændre lunge mikromiljø at fremme metastase

Henvisning:. Larzabal L, El-Nikhely N, Redrado M, Seeger W, Savai R, Calvo A (2013) Differential Virkninger af lægemidler rettet mod kræft stamceller (CSC) og ikke-CSC populationer på Lung primære tumorer og metastase. PLoS ONE 8 (11): e79798. doi: 10,1371 /journal.pone.0079798

Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA

Modtaget: Marts 27, 2013; Accepteret: September 25, 2013; Udgivet: 20. november 2013 |

Copyright: © 2013 Larzabal et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er finansieret af “UTE projekt CIMA”, ISCIII-RTICC RD06 /0020/0066 tilskud, PIUNA (ref. 12.028.402) og Gobierno de Navarra (ref. 2179) (til AC). LL blev understøttet af en Gobierno Vasco fællesskab. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de førende årsager til dødelighed på verdensplan og den mest almindelige årsag til kræftdødsfald hos mænd og kvinder [1]. De fleste af lungekræft tilfælde hører til den ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) type (85% af dem). Prognosen for mere end 60% af patienter med NSCLC er dårlig, dels fordi fremskredent stadium ved diagnose udelukker helbredende operation, og dels fordi medicinske behandlinger er ineffektive. I 2007 5-års overlevelsesraten for mænd og kvinder diagnosticeret med lungekræft var 16%. Desværre har disse procenter ikke ændret sig væsentligt i løbet af flere årtier på trods af betydelige fremskridt i diagnosticering og behandlingsmuligheder [2]. Selv om brugen af ​​målrettede behandlinger for lungekræft har været et gennembrud i kræftforskning, kun en lille andel af patienter gavn af dem. Der er derfor et klart behov for nye terapeutiske alternativer for en mere effektiv behandling af denne tumortype. En ny terapeutisk avenue, der er ved at blive testet i prækliniske forsøg for en række solide tumorer er rettet mod cancer stamceller (CSCS). Den CSCS hypotese, at CSCS er ansvarlige for tumor initiering, celle overlevelse efter terapi, metastatisk spredning og tumor tilbagefald [3]. Selvom nye oplysninger tyder på, at menneskelige lungekræft, ligesom andre tumorer, kan også havnen CSC befolkninger, identifikation af humane lunge CSCS er blevet hæmmet af manglen på pålidelige stamcelle markører. Ekspression og aktivitet aldehyddehydrogenaser (ALDH) tjener som CSC markører i bryst [4] og lunge [5] tumorer. Endvidere øgede ALDH aktivitet er blevet fundet, i stamcellepopulationer i forskellige tumortyper, herunder human myelomatose, akut myeloid leukæmi, hjerne, bryst, lever, colon, pancreas [6], [7] og på det seneste i lungen, hvor ALDH1A1 ekspression er forbundet med dårlig overlevelse i en kohorte af trin i NSCLC-patienter [8]. Den ALDH + fraktionen beriget i tumorfremkaldende celler med øget migration, adhæsion evne og metastatisk potentiale [9]. Sammen disse resultater tyder på, at måling af ALDH niveauer eller enzymatisk aktivitet kan tjene som en lunge CSC markør.

CSCS er resistente over for mange nuværende kræftbehandling, herunder kemoterapi og strålebehandling [10], [11]. Dette tyder på, at mange cancerterapier, samtidig med at dræbe hovedparten af ​​tumoren, kan i sidste ende mislykkes, fordi de ikke eliminerer CSCS, der formår at overleve og at regenerere nye tumorer. Seneste eksperimentelle beviser tyder også på en stor plasticitet både CSC og ikke-CSC befolkning [12]. Dette har ført nogle forfattere til hypotesen, at målrettet både CSC og ikke-CSC befolkninger sandsynligvis vil være nødvendigt for en mere effektiv behandling, selv om dette spørgsmål ikke er blevet eksperimentelt afprøvet endnu.

Salinomycin, kalium ionofor, var nylig identificeret som en selektiv hæmmer af human brystkræft stamceller

in vitro

[13]. Selvom virkningsmekanismen for salinomycin er endnu ikke klart, det synes at fungere som en potent inhibitor af multilægemiddelresistens P-glycoprotein (P-gp /MDR1 /ABCB1) [14].

Tumor cellevandring og metastase, som vigtige elementer i tumor biologi deler mange ligheder med leukocyt menneskehandel, som er kritisk reguleret af kemokiner og deres receptorer. Akkumulerende data antyder, at CXCR4 (CXC kemokinreceptor-4) og SDF1 (stroma celleafledt faktor-1, eller CXCL12) kunne regulere migration og metastase i en række lunge-, bryst- og prostatacancerceller [15]. Desuden CXCR4 overekspression korreleret med dårlig prognose i mange tumortyper [16]. CSCS ekspres CXCR4-receptoren og svare en kemotaktisk gradient af dens specifikke ligand SDF-1 [17], hvilket antyder, at CSCS repræsenterer sandsynligvis en subpopulation stand til at initiere metastase [18]. En bedre forståelse af den vandrende mekanisme, der involverer kræftceller og CSCS ville give mere hensigtsmæssige redskaber til udvikling af nye behandlingsformer til at reducere både lokale og fjerne gentagelser.

CSCS interagerer med omgivende ikke-maligne celler og begge celletyper er samarbejde reguleres inden for tumormikromiljøet [19]. Celler fra tumormikromiljøet ikke kun kunne øge væksten af ​​den primære tumor, men også lette dens metastatiske spredning til fjerne organer. Vellykket metastatisk udvækst afhænger således af evnen hos cancerceller til at drage fordel af den omgivende mikromiljø på hvert trin i den metastatiske proces. Tumormikromiljøet omfatter talrige celler, herunder endotelceller, stromale fibroblaster og en række knoglemarvsceller afledte celler (BMDCs) sådanne os makrofager, myeloide-afledte dæmpere celler, Tie2-udtrykkende monocytter og mesenkymale stamceller [20]. Når tumorceller ankommer til stedet for metastase skal de få tilpasset en ny mikromiljø, der er forskellig fra den af ​​den primære tumor [21]. De præcise tumor-stroma interaktioner i primær tumor og metastase stedet er stort set ukendt.

Forrige banebrydende arbejde har vist, at salinomycin og paclitaxel udviste tydelige virkemåder i en musemodel af brystkræft, med salinomycin besidder CSC-specifikke inhiberende aktiviteter [13]. I betragtning af at CSCS kan være vigtige mediatorer af metastase, vi hypotese, at specifikt er rettet mod CSCS med salinomycin vil reducere metastatiske potentiale af tilbageværende tumorceller. For at løse denne hypotese undersøgte vi effekten af ​​den formodede CSC-specifikt lægemiddel salinomycin på væksten og metastatisk spredning af NSCLC. Vi rapporterer her, at salinomycin differentielt påvirker NSCLC primær tumor vækst og metastatisk potentiale i forhold til de af den konventionelle kemoterapeutiske middel paclitaxel, biologiske aktiviteter korrelerer med foranstaltninger af CSC træk. Også ved hjælp af Lewis lungekræft (LLC) musemodel, rapporterer vi, hvordan disse forbindelser påvirker tumor mikromiljø i både primære og metastatiske tumor sites.

Materialer og metoder

Cell Kultur og forbindelser

Cellelinier anvendt i denne undersøgelse omfattede muse Lewis lungecarcinom (LLC) og human H460 og H1299. Alle cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og blev opretholdt i RPMI (Sigma, St. Louis, MO, USA) med 10% føtalt bovint serum (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og 1% penicillin-streptomycin (Lonza, Basel, Schweiz), ved 37 ° C og 5% CO

2 atmosfære. Salinomycin og paclitaxel blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO, USA) og blev opløst i 20% DMSO i PBS (køretøj). De endelige koncentrationer af salinomycin og paclitaxel anvendes i alle

in vitro Salg assays blev 1 ug /ml for salinomycin og 40 ng /mL for paclitaxel. Celler behandlet med vehikel blev anvendt som kontroller. Disse doser blev brugt baseret på tidligere publikationer [13].

Sphere Formation Assay

For sfære dannelse, blev cellerne dyrket i serum dyrkningsmedium DMEM /F12 + GlutMAX ™ (Gibco, Paisley, UK ) suppleret med vækstfaktorer (MEGM SingleQuots, Lonza, Basel, Schweiz) og B27 (Gibco, Paisley, UK). Celler blev udpladet i 6-brønds ultralave fastgørelsesplader (Corning, Lowell, MA, USA) ved en densitet på 1000-5000 celler pr afhængig af cellelinien og dyrkes i 7-10 dage. For at vurdere selvfornyelse potentiale i disse celler, blev den første generation af kugler opsamlet ved forsigtig centrifugering, dissocieres i encellede suspensioner og dyrket under betingelserne beskrevet ovenfor i yderligere 7 til 10 dage. For at teste virkningen af ​​lægemidler på området dannelse evne blev celler udpladet i tilstedeværelsen af ​​20% DMSO (vehikel), salinomycin (1 ug /ml) eller paclitaxel (40 ng /ml) ved begyndelsen af ​​forsøget, uden yderligere tilsætning af medikamentet. Efter 7 dage blev pladerne analyseret for lunge tumorspheres dannelse og antallet af kugler per brønd blev kvantificeret ved anvendelse af et omvendt mikroskop (Olympus, Hamburg, Tyskland). For at evaluere effekten af ​​lægemiddelbehandling i ALDH + -populationen i LLC-afledte sfærer blev de dannede kugler behandlet med paclitaxel (40 ng /ml) eller vehikel i 72 timer. Efter inkubering blev Aldefluor assays udføres ved flowcytometri.

ALDH Farvning og Celle Sortering

Aldefluor kit (StemCell Technologies, Durham, NC, USA) blev anvendt til at profilere og separate celler med høj og lav ALDH enzymatisk aktivitet. Forsøgene blev foretaget ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt, 1 x 10

6-celler blev inkuberet i Aldefluor puffer indeholdende ALDH proteinsubstrat (Baaa, BODIPY-aminoacetaldehyd, 1 mmol /l) i 30 minutter ved 37 ° C. Celler, som kunne katalysere Baaa til dets fluorescerende produkt (BAA) blev anset ALDH +. Sortering porte til FACS blev trukket i forhold til celle basisliniefluorescensen, som blev bestemt ved tilsætning af ALDH-specifikke inhibitor diethylaminobenzaldehyde (DEAB) under inkubationen. 7-aminoactinomycin D (7-AAD, Sigma-Aldrich) blev anvendt til optælle levedygtige, apoptotiske og døde celler (Figur S1a). Celler blev sorteret i en FACSAria Ilu (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) og renheden af ​​sorterede celler blev analyseret efter processen var fuldført (figur S1B). Data blev analyseret ved Cell Quest Pro (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) og FlowJo software (Ashland, USA).

CXCR4 flowcytometri

Efter inkubationen af ​​LLC-celler med køretøj, salinomycin (1 ug /ml) eller paclitaxel (40 ng /ml) i 72 timer blev cellerne vasket en gang med PBS og derefter høstet med 0,05% trypsin /0,025% EDTA. Løsnede celler blev vasket med PBS /EDTA /BSA (vaskebuffer) og resuspenderet i vaskebuffer (10

6 celler /100 pi). CXCR4-antistof (Sigma) eller dets respektive isotypekontrol blev tilsat til cellesuspensionen på 1:50 koncentration og inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter. De mærkede celler blev vasket igen og det sekundære antistof konjugeret til FITC (BD Bioscience) blev tilsat og inkuberet ved 4 ° C i mørke i 30 min. Celler blev vasket og analyseret på en FACSCalibur (BD Biosciences).

Klonogen Assay

For at evaluere den klonogene potentiale ALDH positive og negative populationer af LLC-celler efter sortering blev 500 celler pr forgyldt i plader med 6 brønde i adhærente betingelser. Efter 10 dage i kultur blev kolonier fikseret med 4% bufret formalin (Panreac, Barcelona, ​​Spanien) og farvet med 2% krystalviolet. Antallet af kolonier pr brønd blev bestemt.

celleproliferation og cytotoksicitetsanalyse

Celleproliferation blev bestemt ved MTT-assay (Roche, Palo Alto, USA). Sorterede ALDH positive og negative populationer af LLC-celler eller usorterede LLC-celler blev podet i 96-brønds dyrkningsplader (1000 celler pr brønd) i 100 pi medium. 24, 48, 72 og 96 timer senere 10 pi MTT blev tilsat. Spektrofotometrisk absorbansen blev målt ved 570 nm.

I cytotoksicitet assay LLC-celler dyrket i vedhængende eller anoikis-resistente (sphere-dannende) betingelser blev udpladet i plader med 96 brønde (1000 celler per brønd) og behandlet med serielt fortyndet paclitaxel (0-100 nM). Tooghalvfjerds timer efter inkubation blev MTT-assays udført ved at følge fabrikantens protokol. Procentdelen af ​​celleoverlevelse blev normaliseret ved at dividere den endelige absorbans af behandlede prøver ved den for den ubehandlede kontrol, og IC

50 blev beregnet.

RNA-ekstraktion og kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA blev isoleret fra celler, sfære-holdige pellets eller frosne vævsprøver ved hjælp QIAamp RNeasy Minikit (Qiagen, Chatsworth, CA). Efter DNase I-behandling, revers transkription blev udført med Superscript II revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) for at danne komplementær DNA (cDNA). QRT-PCR blev kørt i en Applied Biosystems 7900 Real-time PCR maskine. QRT-PCR-reaktioner blev udført med SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Forster City, CA, USA) og GAPDH niveauer blev anvendt som kontroller. Middelværdien tærskelcyklus (Ct) for genet af interesse, normaliseret til Ct værdi husholdning genet (GAPDH) blev anvendt til at beregne genekspression værdier. Assays blev udført for at kvantificere mRNA niveauer af muse og /eller humane ALDH1A1, SOX2, CXCR4, SDF-1, CD11b, VEGF og VEGFR1 gener. Primersekvenserne er vist i tabel S1. Data er givet som 2

-ΔΔCt eller 2

-ΔCt.

Migration Assay (Boyden Afdeling)

Migration analyser blev udført i et Boyden kammer. 20000 celler pr brønd i serum-frit medium blev podet i den øvre Transwell af plader med 24 brønde (Costar) i nærværelse af vehikel, salinomycin (1 ug /ml) eller paclitaxel (40 ng /ml). Medium med 10% serum, anvendes som en kemoattraktant, blev anbragt i det nedre rum. Efter 48 timer blev cellerne i det øverste kammer aftørres med en vatpind, og cellerne i det nedre kammer blev fikseret med 4% formalin og farvet med krystalviolet. Antallet af migrerende celler blev evalueret med et Leica DMIL LED mikroskop ved brug af LAS EZ-softwaren (Leica Microsystems).

Animal Studies

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de etiske retningslinjer, der fastsættes af vores institutioner (University of Navarra), under en godkendt dyr protokol fra udvalget om den etiske dyreforsøg ved universitetet i Navarra (069/11). Alle dyr blev anbragt i microisolator bure og i SPF forhold. Alle kirurgi procedurer blev udført under bedøvelse og blev gjort alt for at minimere dyrenes lidelser.

Til vurdering af den tumorfremkaldende evne CSC, seks uger gamle NSG (NOD SCID IL2Rg mus fra The Jackson Laboratory, USA) blev anvendt. Tusind eller fem tusinde ALDH positive eller negative Language LLC-celler blev injiceret subkutant i flankerne af musene i PBS. Tumorvolumen blev målt efter 3 uger med en elektronisk skydelære. Ved afslutningen af ​​eksperimentet blev dyrene aflivet ved CO

2 inhalation. Fire mus per gruppe blev anvendt.

For at teste effekten af ​​salinomycin og paclitaxel

in vivo,

5 × 10

5 LLC celler blev injiceret subkutant i flanken af ​​8 uger gamle C57BL /6-mus. Drug-behandling påbegyndt 6 dage efter tumorcelleinjektion, hvornår den primære tumor nåede ca. 50 mm

3. Dyr blev administreret med enten 20% DMSO i PBS (bærer), salinomycin (5 mg /kg), paclitaxel (5 mg /kg), eller en kombination af begge lægemidler hver 2 dage, ved intraperitoneal injektion, i 5 uger. Disse doser og behandlingsplaner blev udvalgt baseret på tidligere publikationer [13]. Tumorer blev målt hver 2. dag med en elektronisk skydelære. Når primære tumorer nåede ca. 300 mm

3, tumorer blev fjernet kirurgisk, og indsnit blev syet. Operationen blev udført med bedøvede mus ved hjælp af isofluran (Esteve, Barcelona, ​​Spanien) og i aseptiske forhold. For at reducere dyrs lidelser blev de administreres med ketoprofen (5 mg /kg) hver 24. time i 3 dage efter operationen. Tre uger senere blev dyrene aflivet ved CO

2 indånding og lunger blev fjernet til yderligere analyse af metastatiske knuder. Hver gruppe omfattede 5 mus, og forsøget blev gentaget to gange for at bekræfte resultaterne.

Farvning og Image Analysis

Vævssnit blev fikseret i 4% pufret formalin, indlejret i paraffin, og snit (5 um i tykkelse). Objektglas blev farvet med H 0,05 (*), P 0,01 (**), og P . 0,001 (***)

Resultater

identifikation af ALDH + CSC-lignende Befolkning i LLC celler

Vi og andre har tidligere vist, at målingen af ​​ALDH aktivitet er en passende metode til identifikation af lungekræft stamceller (CSCS) [22] , [23], men om denne markør kan anvendes til at isolere og karakterisere LLC CSC populationen var ukendt. At vurdere tilstedeværelsen af ​​denne population i LLC-cellelinje baseret på deres ALDH enzymatisk aktivitet, blev Aldefluor assay efterfulgt af FACS analyse. Som vist i figur 1A, LLC cellelinien havde i gennemsnit 11.43 ± 0.38% ALDH positive celler, hvilket er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte resultater for andre humane cellelinjer og primære celler fra patienter [5]. Anvendelsen af ​​DEAB (en specifik ALDH inhibitor) tjente som negativ kontrol.

A. Den ALDH + cellefraktion (målt ved Aldefluor assays) repræsenterer ~11% af de samlede celler i LLC-cellelinje. B. Isoleret LLC ALDH + celler besidder selvfornyelse evne, som vist ved deres evne til at skabe både ALDH +/- populationer efter 8 dage i kultur, mens ALDH- celler kun give anledning til negative celler. C. Antal kloner dannet af LLC ALDH + og ALDH- celler efter sortering. Den ALDH + befolkning viser højere klonogene kapacitet end deres negative modstykke. D. Antal af kugler genereret af LLC ALDH +/- celler. E. QRT-PCR-analyse af ALDH1A1 mRNA-niveauer i LLC celler dyrket i vedhængende forhold, primære sfærer (S1) og områder af anden generation (S2). F. kemoresistens til paclitaxel af LLC dyrket i enten adhærerende forhold eller i kugler (S1) blev målt med et MTT-assay. IC

50 for adhærente LLC-celler: 35,8 nM; IC

50 for LLC S1 sfærer: 93,6 nM. Data- og fejlsøjler: middelværdi ± SD. * P 0,05. ** P 0,01. *** P 0,001. Alle forsøg blev gentaget mindst 3 uafhængige gange (hver af dem i tre eksemplarer).

Typiske egenskaber for CSC omfatter deres kapacitet til selv-fornyelse og differentiering,

in vivo

tumorigen potencial og resistens mod kemoterapi [24]. For at verificere disse funktioner i LLC celler, vi først undersøgte selvfornyelse evne ALDH + befolkning. Efter ALDH cellesortering blev både positive og negative cellefraktioner udpladet separat. Efter 8 dage i kultur, blev Aldefluor assay udført for at analysere fænotypen af ​​den resulterende cellepopulation. Dyrket ALDH + celler var i stand til at regenerere både ALDH positive og negative cellepopulationer. Tværtimod dyrkede ALDH- celler var ude af stand til at generere ALDH + -populationen (figur 1B). Dette resultat viser, at kun ALDH + celler er i stand til at rekonstruere hele cellepopulationen, en typisk egenskab ved CSCS. MTT-assays viste, at der ikke var nogen forskel i vækstraterne mellem ALDH + og ALDH- cellepopulationer (Figur S1c). Der blev ikke konstateret mellem usorteret forældrenes befolkning og ALDH + eller ALDH- populationer (data ikke vist).

At sammenligne tumorigent potentiale ALDH + og ALDH- LLC celler blev NSG mus injiceret subkutant med 1 × 10

3 eller 5 × 10

3 celler. Som vist i tabel 1, blev der observeret tumorvækst i 3 ud af 4 mus efter podning med 1 × 10

3 ALDH + celler, hvorimod ikke blev observeret nogen tumorvækst i de ALDH- celler. Efter injektion af 5 x 10

3 ALDH + -celler, 3/4 mus præsenteret en tumormasse med en gennemsnitlig tumorvolumen af ​​235,3 ± 64,6 mm

3, mens kun 2/4 mus udviklet en lille tumor efter injektion af ALDH- population (med en tumor volumen på 27,45 ± 5,47 mm

3).

Vi analyserede derefter klonogene potentiale LLC ALDH + og ALDH- cellefraktioner ved udpladning 500 celler per brønd i en 6-brønds plade og dyrkning deraf ved klontæthed i 10 dage. ALDH + celler gav anledning til en betydeligt højere antal kolonier end ALDH- celler (p 0,05, figur 1C), hvilket viser, at ALDH + celler vise øget clonogenicity. Den klonogene evne parentale cellelinje var mellemliggende mellem ALDH + og ALDH- fraktioner (data ikke vist)

ALDH + celler produceret et større antal kugler end ALDH- celler. (P 0,01; Figur 1D). Vi analyserede også evnen af ​​hele LLC population for at danne kugler og selv-fornyelse, hvilket giver anledning til en sekundær sfære population (S2). Efter 7 dage i serum og vedhængende fri tilstand, LLC-celler dannede primære sfærer (S1). Disaggregering af S1 kugler og kultur i de samme betingelser demonstrerede dannelsen af ​​en sekundær (S2) sfære befolkning. For at bekræfte, at sfærer blev beriget i CSCS, vi kvantificeret ALDH-mRNA-niveauer i celler dyrket i adhærente og ikke-adhærente (S1 og S2 sfærer) betingelser. Ved QRT-PCR-analyse observerede vi, at S1 kugler havde signifikant højere (p 0,001) ALDH mRNA niveauer end celler dyrket i adhærente betingelser, og at S2 sfærer blev også beriget med ALDH ekspression (p 0,05) sammenlignet med S1 kugler (fig 1E). Endvidere Aldeflour analyse viste et højere antal ALDH + celler i kugler (34,2% ± 6,56%) end i celler dyrket i adhærente betingelser (11,43 ± 0,38%) (Suplemmentary Figur 1D og figur 1A). Derfor er disse eksperimenter bekræftede, at de anoikis-resistente kugler indeholdt en beriget ALDH + CSC-lignende befolkning, der var i stand til at undergå selv-fornyelse.

Et andet kendetegn ved CSCS er deres modstand mod konventionelle kemoterapeutiske midler. , Anvendes således vi paclitaxel, et almindeligt anvendt lægemiddel mod NSCLC, at evaluere kemoresistens af LLC-celler dyrket i kugler eller adhærente betingelser. Som vist i figur 1F, LLC-celler dyrket som kugler udviste højere overlevelsesrater ved behandling med forskellige doser af paclitaxel end celler dyrket i adhærerende betingelser. IC

50 værdier for begge cellepopulationer var signifikant (p 0,01) forskellig: IC

50 for vedhængende LLC celler var 38,5 nM og 93,6 nM for LLC-afledte kugler (Figur 1F). For at løse hvorvidt S1-afledte celler svarede til den ALDH + population med forøget modstand mod paclitaxel, vi analyseret ved Aldefluor procentdelen af ​​ALDH + celler i sfærer efter lægemiddelbehandling. Uventet, vi ikke oplever en betydelig stigning i andelen af ​​ALDH + celler som respons på paclitaxel i LLC modellen i sfære dyrkningsbetingelser. Men, som vi beskriver nedenfor, dette fænomen var tydelig i humane NSCLC-modeller, støtter den forudsætning, at S1-afledte celler indbefatter paclitaxel-resistente ALDH + celler. Tilsammen alle disse resultater tyder på, at ALDH + brøkdel af LLC celler svarer til et lægemiddel resistent CSC befolkning.

Differential Effekt af salinomycin og Paclitaxel på Målretning CSC vs ikke-CSC populationer

efter at have vist, at LLC celle linje har en ALDH + delpopulation med CSCS funktioner, vi ønskede at undersøge effekten af ​​salinomycin, en nylig identificeret forbindelse, som selektivt hæmmer human brystkræft stamceller

in vitro

[13] . Vi sammenlignede effekten af ​​salinomycin med paclitaxel i CSC vs non-CSC populationer.

Til efterfølgende

in vitro

eksperimenter, behandlede vi LLC celler med 1 pg /mL salinomycin eller 40 ng /ml paclitaxel, mulighed for at restituere i 24 timer i fravær af lægemidlet. For at bestemme de konkrete virkninger af salinomycin og paclitaxel på ALDH +/- cellepopulationer blev Aldefluor analyser efterfulgt af FACS analyse. Efter cellesortering blev ALDH positive og negative celler udpladet separat og administreres med salinomycin (1 ug /ml) eller paclitaxel (40 ng /ml) i 72 timer og cellelevedygtigheden blev vurderet ved MMT assays. Som vist i figur 2A, overlevelsen af ​​ALDH + -celler efter salinomycin behandling var signifikant lavere end den for ALDH- celler (p 0,05). I modsætning hertil efter overlevelse ALDH + celler paclitaxel behandling ikke var påvirket, mens kun 67,7% ALDH- celler var i live (p 0,05). Disse resultater viser, at salinomycin er meget cytotoksisk for ALDH + celler, men paclitaxel påvirker ALDH negative population.

A. * P 0,05. * P 0,05. * P 0,05.