PLoS ONE: Overekspression af Pirna Pathway Gener i Epithelial kræft i æggestokkene

Abstrakt

Betydningen af ​​Piwi-interagerende RNA (Pirna) vej for kønsceller vedligeholdelse, genom integritet, DNA methylering og retrotransposon kontrol rejser mulige roller denne vej i kræft. Faktisk afvigende ekspression af humane PIWI ortologer og er blevet observeret

Maelstrom

i forskellige kræftformer. I denne undersøgelse udforskede vi udtryk og funktion af Pirna pathway gener i human ovariecancer, baseret på vores seneste arbejde, som viste udbredt udtryk for Pirna pathway gener i pattedyr. Vores arbejde viser, at

PIWIL1

og

MAEL

udtryk øges betydeligt i ondartet EOC (n = 25) i forhold til godartede tumorvæv (n = 19) og normalt ovarievæv (n = 8) . Ekspressionen af ​​

PIWIL3

er lavere i maligne og benigne væv sammenlignet med normalt ovarie. Sekventering af

PIWIL1

transskript afsløret, at i mange tumorer deletion af exon 17 fører til indførelse af en præmatur stopkodon i PIWI domæne, sandsynligvis på grund af en splejsning fejl.

In situ

hybridisering på tumor sektioner viste, at

L1

,

PIWIL1

,

2

og

MAEL

er specifikt udtrykt i epitelial celler (cancrøse celler) af EOC. Desuden

PIWIL2

og

MAEL

er co-udtrykkes i stromacellerne støder op til tumorceller. Da

PIWIL1

og

MAEL

er op reguleret i ondartet EOC og udtrykt i de epitelceller, vi undersøgte, om disse to gener påvirker invasiv af æggestokkene kræftcellelinjer der ikke normalt udtrykker disse gener.

PIWIL1

og

MAEL

var forbigående overudtrykt i kræft i æggestokkene cellelinje SKOV3, efterfulgt af tidstro målinger af celle invasiv. Overraskende både

PIWIL1

og

MAEL

overekspression faldt invasiviteten af ​​SKOV3 celler. Vores resultater understøtter en voksende mængde af beviser, der viser, at gener i denne vej er opreguleret i cancer. I æggestokkræft viser vi for første gang, at

kan Piwil1

udskrift ofte være unormal resultat i ikke funktionelt produkt. I modsætning til, hvad der er blevet observeret i andre celletyper, fandt vi, at

PIWIL1

MAEL

have en undertrykkende effekt på celle invasionsevne

Henvisning:. Lim SL, Ricciardelli C, Oehler MK, De Arao Tan IMD, Russell D, Grutzner F (2014) Overekspression af Pirna Pathway Gener i Epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (6): e99687. doi: 10,1371 /journal.pone.0099687

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA

Modtaget: Januar 16, 2014 Accepteret: 19 maj 2014; Udgivet 16. juni, 2014

Copyright: © 2014 Lim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af University of Adelaide. F.G. understøttes af en ARC (Australian Research Council) fællesskab. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den mest dødelige gynækologiske kræft, og den femte hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt kvinder i den vestlige verden [1]. Den femårige relative overlevelse for kvinder med kræft i æggestokkene er kun omkring 40% [1]. Ovariecancer er heterogene tumorer, som udviser distinkte morfologiske karakteristika, genetiske mutationer og oprindelse. Der er tre hovedtyper af kræft i æggestokkene – epitel, kim celle og køn ledningen stromale tumorer. Ovarietumorer kimcelletumorer og køn ledningen stromale tumorer udgør 10% af ovariecancere, og er afledt af primitive æggestokkene kimceller eller mesenchymalceller i sex-ledningen afledt væv i æggestokkene, henholdsvis [2]. EOCs tegner sig for mere end 90% af æggestokkene maligniteter. Baseret på histologi EOCs inddeles i fire overordnede undertyper (serøs, mucinous, endometroid og klare celle carcinomer) med over 70% af de diagnosticerede tilfælde som serøse carcinomer (SCs) [3].

Ændringer af epigenetiske landskab såsom global DNA hypometylering og gen DNA hypermethylering ofte rapporteret i cancerceller [4]. Global DNA hypometylering høj grad påvirker intergeniske og intron regioner af genomet, især gentage sekvenser og transposoner (TES), der tegner sig for omkring 55% af det menneskelige genom [5], herunder 17%

L1

gentager [ ,,,0],6]. I somatiske celler, DNA methylering af TES er afgørende at forhindre deres ekspression hvilket kan bringe integriteten af ​​genomet. Under kimcelle udvikling, der er en forbigående periode med global DNA hypometylering som resulterer i midlertidig aktivering af TES [7].

Pirna pathway er evolutionært højt konserverede i Metazoa og består af 21-26 nt piRNAs som binder PIWI proteiner til at mediere posttranslationel kontrol med TE-ekspression og spille en rolle i epigenetiske ændringer (såsom DNA-methylering) via interaktion med andre proteiner (f.eks MAEL eller HP1) [8], [9]. Hos pattedyr er der flere

Piwi ligesom Hotel (

Piwil

) gener (tre i mus, fire i mennesker). Angivelse af

Piwil

gener og Pirna pathway tilhørende gener er blevet påvist på forskellige stadier af kønsceller udvikling især i testiklerne.

Piwil1 Hotel (

Miwi

) er tidligere blevet identificeret som et gen udelukkende udtrykkes i mus testis og afgørende for spermatogenesen [10]. For nylig ekspression af

Piwil1

er også blevet påvist i muse og human ovarie [11]. Mutation af

Piwil2

,

Piwil4

og

Mael

i mus fører til lignende fænotyper, herunder afskaffelse af TE DNA methylering og mandlig sterilitet [8]. Der er nu voksende beviser for Pirna aktivitet også i pattedyrs æggestok, men knock out eksperimenter af Pirna pathway gen i mus hidtil kun har ført til hansterilitet [12] – [14].

Der er stadig flere beviser af Pirna pathway aktivitet i forskellige kræftformer. Ekspression af

PIWIL1

PIWIL2

er blevet fundet i et bredt spektrum af humane cancere, såsom mave, bryst, mave-tarmkanalen og endometrium [15] – [18] og for nylig også i ovariecancer [19]. Øget ekspression af

PIWIL1

er forbundet med øget tumor vækst [20] øget tumor kvaliteter [21], dårlige diagnostiske resultater [22] og dødelighed [23].

PIWIL2

er almindeligt udtryk i den tidlige fase brystkræft og livmoderhalskræft og forstadier til kræft stamceller er involveret i tumorigenese [18]. Udtrykket mønster af

PIWIL3

og

4

er kun blevet undersøgt i tyktarmskræft [24].

Maelstrom Hotel (

MAEL

) er en kendt testikel kræft-gen [25].

Vores fund af udtryk i æggestokkene somatiske celler [11] sammen med nedsat DNA methylering ved

L1

promotorregion forbundet med progressionen af ​​cervikale og livmoder kræft [26] og dårlig prognose i ovariecarcinomer [27] førte os til at undersøge, om Pirna pathwaygener kunne spille en rolle i EOCs. I denne undersøgelse undersøgte vi udtryk for

PIWIL1

–

4

og

MAEL

i 25 EOC, 19 godartede tumor prøver, og 8 normale æggestokkene væv. Vi fandt signifikant forhøjet udtryk for

PIWIL1

og

MAEL

i EOC forhold til godartede og normale æggestokkene væv. Men

PIWIL1

udskrifter i EOC kan ikke være funktionel skyldes sletninger identificeret i PIWI domæne denne udskrift. Desuden overekspression af

PIWIL1

og

MAEL

foreslår en rolle af disse gener i at reducere ovariecancerceller invasiv

in vitro

.

Materialer og metoder

væv

i alt RNA fra human testis og præ-overgangsalderen æggestokkene væv blev købt fra Stratagene (USA). Ondartede, godartede og normale æggestokkene væv (tabel 1 og tabel S3) blev indsamlet med informeret skriftligt samtykke fra patienten og godkendelse fra den etiske komité for Royal Adelaide Hospital, Adelaide, South Australia.

Cell linjer

Humane ovariecancer cellelinjer SKOV3 og OVCAR3 blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC, USA), mens OVCAR5 blev opnået fra Dr. Thomas Hamilton (Fox Chase cancer center, Philadelphia, PA) Johnson et al cancer Res 57: 850-856 1997. Cellelinier blev opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med L-glutamin (2 mM), penicillin-streptomycin (100 U /ml, 100 pg /ml) (Sigma). SKOV3 og OVCAR3 celler blev suppleret med 5% FBS (Invitrogen), mens OVCAR5 celler blev suppleret med 10% FBS og 7,5 ug /ml insulin. Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C i et fugtigt kammer med 5% CO

2.

RNA-isolering og cDNA-syntese

RNA blev isoleret fra væv og cellelinjer under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. RNA blev resuspenderet i nuklease frit vand og opbevaret ved -80 ° C. RNA blev behandlet med DNase I (New England Biolabs), før revers transkription. 1 pg af RNA blev anvendt til at opnå cDNA under anvendelse af Super Script III Første streng syntese System (Invitrogen) ved at følge fabrikantens protokol. Kort beskrevet blev RNA inkuberet med 1 pi af 50 pM oligo (dT)

20 og 1 pi 10 mM dNTP’er i 10 minutter ved 65 ° C. Efter inkubation blev 4 pi 5x RT-buffer, 2 pi dithiothreitol (DTT, 0,1 M), 1 pi RNaseOUT (40 U /ul) og 1 pi af Super Script III RT-enzym (200 U /pl) tilsættes og inkuberes i 50 minutter ved 50 ° C. Reaktionen blev afsluttet ved 85 ° C i 5 minutter. cDNA’er blev opbevaret ved -20 ° C.

Genekspression analyser

RT-PCR blev udført for at bestemme niveauet af mRNA for de fem Pirna pathway-gener (Tabel S1) og beta actin (

ACTB

) i 52 patientprøver og 3 æggestokkene kræft cellelinjer. Hver 25 pi reaktion indeholdt 200 ng cDNA, 5 pi 5x Go Taq Green Master Mix (Promega), 1 pi af 5 mM dNTP-opløsning (Roche), 0,5 pi af hver primer (20 pmol /pl) og 0,5 pi Taq DNA polymerase. PCR-betingelserne var de samme for alle gener, undtagen annealing temperatur (tabel S1), og var som følger: indledende denaturering ved 95 ° C i 2 min, 95 ° C i 30 sek, annealing ved genspecifik temperatur i 30 sek ( tabel S1), forlængelse ved 72 ° C i 1 min, 32 cyklusser. PCR af

ACTB

kontrol blev udført med 27 cyklusser, efterfulgt af 5 minutter af den endelige forlængelse ved 72 ° C. PCR-produkterne blev visualiseret på en 1,5% agarosegel farvet med ethidiumbromid. Båndintensitet blev målt (Mængde One program, version 4, Bio-Rad), og den relative intensitet af hvert gen blev normaliseret til den for

ACTB

. PCR-produkter blev bekræftet ved sekventering (Big Dye Terminator v3.1 cyklus sekventering kit, Applied Biosystems). RT-PCR blev udført tre gange for hvert primerpar.

Statistiske analyser af genekspression

Data er præsenteret som median relative ekspression (første kvartil til tredje kvartil). Udskriften for hver genet blev normaliseret mod

ACTB

. Kolmogorov-Smirnov og Shapiro-Wilk test foreslog, at ekspressionsniveauet af hvert gen fra alle de 52 prøver, ikke er normalfordelt. Således er en Kruskal-Wallis test, som anvender en ikke-parametrisk metode blev anvendt til at sammenligne genekspressionen fra maligne, benigne og normale grupper. Den Spearmans korrelation test blev udført for at undersøge sammenhængen mellem en patients alder og deraf følgende genekspression. R-værdi tættere på 1 angiver en stærkere positiv korrelation, mens en R-værdi tættere på -1 viser en stærkere negativ korrelation. I Kruskal-Wallis og Spearman tests, en P-værdi på 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

RNA

situ

hybridisering

i

​​Sonder blev mærket med digoxigenin-. 11-UTP (Roche Diagnostics) i henhold til fabrikantens protokol. Formalinfikseret paraffinindlejrede vævssnit blev deparaffinised i xylen og efterfølgende vasket i gradueret ethanol. Alle opløsninger blev fremstillet i diethylpyrocarbonat (DEPC) -behandlede H

2O at inaktivere RNase aktivitet. mRNA-bundne nukleoproteiner blev fjernet ved proteinase K inkubering (1.2μg /ml) (Roche Diagnostics) i 30 minutter ved 37 ° C. Objektglas blev vasket med 1 x PBS og acetyleret (1 M triethanolamin /0,178% HCI /0,25% eddikesyreanhydrid). Objektglas blev præhybridiseret ved 65 ° C i 2 timer med præhybridiseringsbuffer (50% deioniseret formamid /2 x SSC /1x Denhardts opløsning /0,005 M phosphatpuffer /10% dextransulfat /1 mg /ml gær total RNA /1 mg /ml laksesperma DNA) og hybridiseret med ca. 200 ng cRNA probe i præhybridiseringsbuffer natten over ved 50 ° C i et fugtigt kammer. Objektglas blev vasket i 2 x SSC, 1 x SSC, 0,5x SSC og 0,1 x SSC i 15 minutter hver ved 50 ° C. For at fjerne ubundne cRNA prober blev vævet underkastet RNase A (150 ug /ml) fordøjelse i 30 minutter ved 37 ° C. Specifikt bundne cRNA prober blev detekteret ved anvendelse af et anti-DIG-antistof koblet til alkalisk phosphatase med nitrobluetetrazolium rid /X-phosphat-5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat (NBT /BCIP) (Roche Diagnostics) som kromogent substrat.

Kloning og konstruere forberedelse til invasionen analyser

MAEL

(CCDS1257) og

PIWIL1

(CCDS9268) cDNA sekvenser blev opnået fra NCBI CCDS databasen. Fuldlængde-cDNA-sekvensen blev amplificeret ved anvendelse af Expand High Fidelity PCR System (Roche) ifølge producentens protokol og klonet ind i en pcDNA3.1 pattedyrekspressionsvektor. Plasmid DNA’er herunder pcDNA 3.1 (Invitrogen) eller pEGFP-N1 tomme vektorer (Clontech) blev transficeret ind SKOV3-celler under anvendelse af Lipofectamine LTX (Invitrogen) ved at følge fabrikantens instruktion. SKOV3 celler blev selekteret på grund af deres endogene

L1

ekspressionsniveauer og det faktum, at de ikke viste Pirna pathway genekspression (fig. 1C). For hver transfektion, 8 × 10

4 SKOV3-celler podedes på en plade med 24 brønde 14 timer før transfektion og blev dyrket i RPMI 1640/5% FBS uden penicillin-streptomycin. Plasmid-DNA (500 ng) blev fortyndet i 100 pi Opti-MEM-medium (Invitrogen) og inkuberet med 0,5 pi Plus reagens (Invitrogen) og 2 pi Lipofectamine LTX (Invitrogen) i 30 minutter før tilsætning til hver brønd. Efter 6 timer blev cellekulturmediet udskiftet med nye RPMI 1640/5% FBS-medium, og cellerne blev inkuberet i 24 timer ved 37 ° C, 5% CO

2 før høst efter

in vitro

invasion analyser. Transfektion af pEGFP-N1 tomme vektorer i SKOV3-celler tilladt transfektionseffektiviteten der skal måles, som med succes transficerede celler udtrykte GFP-proteinet. PEGFP-N1-vektoren blev underkastet de samme vækst- og transfektionsbetingelser som skitseret ovenfor, for at bestemme transfektionseffektiviteten som var ca. 70% efter 24 timer.

RT-PCR-analyser af

PIWIL1-4

og

MAEL

ekspression i (A) malign EOC, godartede ovariecancere (B) normale ovarier og (C) æggestokkene cancercellelinjer. Dette er en repræsentation af 4 ud af 25 malign EOC og 19 benigne ovariecancer væv. Øget ekspression af

PIWIL1, 2, 4

og

MAEL

, men ikke

PIWIL3

, findes i maligne kræftformer sammenlignet med godartede tumorer. Alle normale æggestokke viser

PIWIL2

og

PIWIL4

udtryk, men kun nogle har

PIWIL1, 3 fotos og

MAEL

udtryk. Ingen endogene

PIWIL1, 2, 4

og

MAEL

udtryk er påvist i OVCAR3 og SKOV3 celler. Ova * angiver væv fra en 20-årig pre-menopausal æggestok mens andre æggestokke er fra personer i alderen 44-76 år.

In vitro

invasion analyser med xCelligence

Cell invasion blev testet med realtid invasion assay overvågning ved hjælp af CIM-enheder og xCelligence DP-systemet (Roche Diagnostics) [28]. Kort beskrevet 4 timer før invasionen assayet blev et CIM-plade (Roche) overtrukket med 1:20 fortyndet Vækstfaktor reduceret Matrigel basalmembranmatrix (~450μg /ml) (BD Biosciences). Derefter 40.000 celler, utransficerede eller transficeret med tom vektor (Ev) eller

MAEL

eller

PIWIL1

vektorer, blev podet i hver belagt godt. Celle aktivitet blev fulgt over en periode på 72 timer ved at måle impedansen signal i CIM plade. Cellen blev registreret hvert minut i de første 12 timer og hver 5 minutter for de følgende 12 timer. Derefter fra 24 timer og indtil slutningen af ​​eksperimentet blev celleaktivitet registreret hver 30 minutter. I hver CIM plade blev triplikater i hver gruppe udføres for at opnå middelværdien og standardafvigelsen. Forsøget blev gentaget tre gange.

PIWIL1

udskrift sekventering

PIWI domæne

PIWIL1

afskrift blev PCR-amplificeret og produkter af forskellig størrelse blev klonet i pGEM-T Easy-vektoren (Promega). I alt 30 positive kolonier fra forskellige PCR bånd blev udvalgt fra hver ligeringsreaktion og plasmid-DNA’er blev oprenset under anvendelse af standard alkalisk lyse metoder (Qiagen) [29]. 200 ng plasmid-DNA blev sekventeret (Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems) ved hjælp af SP6 og T7 universelle primere.

Resultater

Angivelse af Pirna pathway gener øges i maligne EOC sammenlignet med godartede tumorer eller normale æggestokkene væv

Pirna pathway gener konsekvent udtrykt i pattedyrs æggestok [11]. For at undersøge en mulig rolle af denne vej hos EOC, vi udførte semi-kvantitativ RT-PCR til at undersøge ekspressionen af ​​

PIWIL1

,

PIWIL2

,

PIWIL3

,

PIWIL4

og

MAEL

i fremskredent stadium serøs EOC (n = 25), godartede tumorer i æggestokkene (n = 19) og normal ovarievæv (n = 8) (tabel 1, tabel S3 og fig. 1A, B). Semi kvantitativ analyse viste, at de relative ekspressionsniveauer af

PIWIL1

og

MAEL

var signifikant højere i maligne EOC sammenlignet med benigne og normale væv (Fig. 2A, B). De relative ekspressionsniveauer af

PIWIL2

og

PIWIL4

i maligne grupper var ikke signifikant anderledes end i godartede eller normale æggestokkene væv (Fig. 2C, D). Imidlertid er ekspressionen af ​​

PIWIL2

og

PIWIL4

er væsentligt lavere i godartede tumorer sammenlignet med normale ovarievæv, hvilket antyder en ændring af genekspression under progressionen af ​​EOC. Den relative ekspression af

PIWIL3

er anderledes end andre

PIWIL

gener, således at ekspressionen af ​​dette gen er signifikant højere i normalt ovarie sammenlignet med både maligne og benigne væv (fig. 2E) . Endvidere den relative ekspression af

PIWIL3

i normalt ovarie er positivt korreleret med patientens alder ved normal ovarie væv (n = 8) (r = 0,750, P = 0,05) (tabel 2). I modsætning til

PIWIL3

,

PIWIL1

udtryk er negativt korreleret med en alder af patienter (r = -0,737, P = 0,037).

PIWIL1

udtrykkes i voksende follikler i præmenopausale æggestokke, men i denne undersøgelse halvdelen af ​​de testede æggestokke var fra kvinder under 50 år og vil kunne være præmenopausale.

Semi-kvantitativ RT-PCR-analyse af mRNA-ekspression (i forhold til

ACTB

) af (A)

PIWIL1

, (B)

MAEL

, (C)

PIWIL2

, (D)

PIWIL4

og (E)

PIWIL3

. (F) P-værdien for hver sammenligningsgruppen. Malign EOC (n = 25), benigne ovariecancer væv (n = 19) og normale ovarier (n = 8). Kruskal-Wallis test blev udført for at sammenligne genekspressionen plan mellem to grupper. Fyldt prik viser middelværdien for hver gruppe. * Angiver 0,001 P 0,05; *** Angiver P 0,001; NS, ikke signifikant.

L1

og Pirna pathway gener er overudtrykt i EOC celler

For at analysere udtryk mønster af Pirna pathway gener og

L1

i EOC, RNA

in situ

hybridisering blev udført i ondartet EOC (n = 5) og godartede tumorer i æggestokkene (n = 2) (tabel 3, fig. S1). Vi fandt stærke udtryk for

L1

i epitelceller, men

L1

var fraværende i de stromale celler i alle prøver (fig. 3A, E). Vi bemærkede også, at ekspressionen af ​​

L1

er variabel i forskellige patienter (Fig. 3A). Stærk udtryk for

PIWIL1

blev fundet i epitelceller i alle EOC væv (fig. 3B, F), mens

MAEL

PIWIL2

udviste kraftig udtryk i de epitelceller og stromale celler i alle EOC undersøgt (fig. 3C, G og D, H henholdsvis).

In situ

analyse af (A, A ‘, E)

L1

, (B, B ‘, F)

PIWIL1

, (C, C’, G)

MAEL

, (D, D ‘, H)

PIWIL2

i to ondartet EOC (AD fra SC3 mens EH fra SC2). (A’-D ‘) Amplification billeder af A-D hhv. Stærk udtryk for Pirna pathway gener og

L1

blev fundet i skællede-til-terningformet som epitelceller både maligne EOC undtagen

PIWIL1

som kun udtrykkes i SC2, men ikke SC3.

L1

har spredt ekspression i nogle EOC således at nogle epitelceller synes at have stærkere

L1

ekspression sammenlignet med andre.

MAEL

PIWIL2

men ikke

PIWIL1

er også til udtryk i de stromale celler i både EOC. (E’-H) Negative kontroller med sans sonde af

L1

,

PIWIL1

,

MAEL

PIWIL2

hhv. Ep = epitelceller; S = stromaceller. Scale bar = 50 um.

Multiple

PIWIL1

udskrift varianter findes i ondartet EOC

PCR-amplifikation af PIWI domænet fra EOC cDNA’erne produceret to forskellige bands sammenlignet med cDNA fra normal testikel eller ovarie (fig. 4), hvilket tyder på tilstedeværelsen af ​​flere

PIWIL1

udskrift varianter i ondartet EOC. PCR-produkter fra testis og maligne EOC blev ekstraheret, klonet og sekventeret. Multiple alignments af klon-sekvenser viste mange ændringer inden for PIWI domæne på nukleotidniveau sammenlignet med testiklerne og offentliggjort

PIWIL1

cDNA-sekvens. Enkelt baseændringer pair er blevet identificeret i

PIWIL1

udskrifter af maligne EOCs (tabel S2). Desuden er de fleste af disse kloner har exon deletion og ikke-splejsede introner der indfører præmature stopkodoner. Vigtigere en 75-nt deletion der omfattede hele exon 17 blev fundet i de fleste af de sekventerede kloner i 5 ud af 28 EOC patienter (fig. 4B). Endvidere viste nogle kloner delvis splejsning af introns 15 og 16 (fig. 4B), således at 17 bp og 20 bp fra 5′-enden af ​​intron 15 og 16, henholdsvis, er ikke-splejset. For at bekræfte at mutationerne skyldes splejsning, blev genomisk DNA fra tumorprøver isoleret og sekventeret ved den tilsvarende region. Ingen mutationer blev identificeret mellem exoner 15-18 (hvor splejsning fejl fundet sted) i det genomiske

PIWIL1

sekvens (fig. S2). For at forudsige, om de ovennævnte post-transkriptionelle forandringer påvirker PIWIL1 funktion, blev sekvenser oversættes og sammenlignet med kontrollen (testis cDNA) og offentliggjort peptidsekvens (AAC97371.2). Tab af hele exon 17 (73 nt deletion) i 11 kloner indført en præmatur stopkodon i PIWI domæne (fig. S3). Tilsvarende stopkodoner blev fundet i kloner, der har usplejsede introner (ikke vist).

(A)

PIWIL1

ekspression i kontrol væv (human testis, normalt ovarie (OV) 1, 2) og EOC væv SC1 og 2. i den positive kontrol blev et 500 bp band amplificeret, men i maligne SC1, opnåedes to bånd. (B) -cDNA multiple alignment (delvis), der viser, at de fleste af klonerne har en deletion af exon 17 (ΔΔ3) og 3 kloner har delvis splejsning af intron 15 og 16 (). PIWIL1_ccds: publiceret cDNA af

PIWIL1

(CCDS9268); Testis C1: testis udskrift klon 1; B1-3, B6, B9-B14, C6, C8, C9, C10-C15, D1-D10: kloner med

PIWIL1

udskrifter

Over udtryk for Pirna pathway gener. reducerer invasionsevne

in vitro

for at undersøge den mulige rolle af Pirna pathway gener i cancer progression, fuld længde

PIWIL1

eller

Mael

udskrifter blev klonet og transficeret transient i æggestokkene cancercellelinie SKOV3 og analyseret for invasivitet efter 24 timers transfektion. RT-PCR blev udført for at validere indføringen af ​​plasmider ind i disse celler. RT-PCR bekræftede

GFP

,

PIWIL1

eller

MAEL

overekspression (fig. S4A). Angivelse af

MAEL

PIWIL1

konstruktioner fortsat høj i de transfekterede celler 50 timer efter transfektion (fig. S4A).

MAEL

,

PIWIL1

tom vektor (EV) transfekterede celler og utransficerede SKOV3 celler blev anvendt på xCELLigence system til at undersøge deres effekt på celle invasionsevne [30]. Overraskende invasiviteten af ​​

MAEL

PIWIL1

transfekterede celler var lavere i forhold til utransficerede eller tomme vektor celler (Fig. 5). Celle invasionsevne fra hver gruppe begyndte at nå et plateau efter 30 timer, således kun celle aktivitet af de første 30 timer er vist. Vores resultater tyder på, at overekspression af

PIWIL1

MAEL

have en undertrykkende effekt på SKOV3 celle invasiv.

PIWIL1

og

MAEL

transfekterede celler har lavere invasionsevne forhold til utransficerede celler og

Ev

transfekterede celler. I hvert forsøg blev hver gruppe udført tre gange og dette forsøg blev gentaget tre gange. Dette er en kombineret data plot af tre uafhængige eksperimenter for alle grupper. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse.

WT

indikerer utransficerede SKOV3 celler; tom vektor (Ev),

MAEL

PIWIL1

indikerer celler transficeret med

MAEL

eller

PIWIL1

vektorer.

Ingen

indikerer godt uden celler.

Diskussion

Pirna vej er vigtig for TE lyddæmpning, epigenetisk regulering og stamceller selvfornyelse i en bred vifte af organismer [31], [32]. Global DNA hypometylering og TE derepression, såsom

L1,

er et fælles træk ved kræft genomer [33], [34] hos mennesker

PIWIL1

og

2

overekspression har blevet observeret i tumorer fra forskellige væv [15] – [18], [21] – [23]. Det er dog stadig uklart, om Pirna pathwaygener udtrykkes forskelligt i ovariecancer eller har en rolle i æggestokkene tumorprogression. Vi undersøgte udtryk for Pirna pathway gener

PIWIL1

–

4

,

MAEL

L1

i ondartet EOC, godartede tumorer og normale ovarie væv, og også undersøgt mulige roller

PIWIL1

og

MAEL

i æggestokkene kræftceller

Angivelse af

PIWIL1

-.

2

er blevet undersøgt i forskellige ondartede væv [15] – [18], [21], [23], [35], men ikke

MAEL

,

PIWIL3

og

PIWIL4

. Selv udtryk for

PIWIL2

og

4

dukkede højt i tumorprøver dette ikke var signifikant, sandsynligvis på grund af det faktum, at

PIWIL2

og

PIWIL4

var stærkt udtrykt i normal ovariale væv (fig. 1B) og deres ekspression blandt maligne væv er meget varierende. Udtrykket af

PIWIL1

og

MAEL

dog er steget betydeligt i ondartet EOC sammenlignet med godartede tumorer.

PIWIL1

og

MAEL,

men ikke

PIWIL2

og

4,

var betydeligt op reguleret i forhold til normale æggestokke. I modsætning til

PIWIL2

og

4 Hoteller, som udtrykkes i alle normale æggestokkene væv undersøgt, udtryk for

PIWIL1

og

MAEL

kun findes i en delmængde af normale ovariale væv fra patienter, der var under 50 år. I normal æggestok,

PIWIL1

og

MAEL

udtrykkes i cumulus celler voksende follikler i human [11]. De normale æggestokkene væv testet er fra personer i alderen 44-76 år, og halvdelen af ​​disse prøver blev afledt fra individer mindre end 50 år. Således variable udtryk for

PIWIL1

og

MAEL

i de normale æggestokke kunne forklares ved forskellen i overflod af voksende follikler, som udtrykker Pirna pathway gener på tværs af prøverne.

MAEL

er kendt som en cancer /testis-genet som det udtrykkes i testis og en række cancercellelinier [36]. Her identificerede vi for første gang den øgede udtryk for

MAEL

i ondartet EOC og godartede tumorer i æggestokkene. Svarende til PIWI, MAEL er afgørende for at sikre en ordentlig kønscellelinie stamcelle differentiering i

Drosophila

andre hvirveldyr [37]. Overekspression af Pirna pathwaygener i EOC kan indikere, at nogle stamcelle kendetegn er til stede i tumorceller, eller at Pirna pathway er blevet aktiveret for eksempel ved aktivitet af retrotransposoner. Ekspression af disse gener kan også være en underskrift af tilstedeværelsen af ​​æggestokkene cancer stamceller [38].

Udtrykket for Pirna pathway gener i normal æggestok og visse former for EOC kan give et nyt perspektiv på oprindelsen af livmoderhalskræft. Somatiske celler af modning follicle kan komme i kontakt med æggestokkene overfladeepitelet under ægløsning eller kan være til stede i cyste integration, som menes at spille en rolle i oprindelsen af ​​epitelial ovariecancer [3], selv om tilstedeværelsen af ​​inklusionslegemer cyster synes at ikke i sig selv øge risikoen for at udvikle ovariecancer [39]. Hypometylering af

L1

promoter region er korreleret med øget

L1

mRNA udtryk i maligne brystkræft væv og cellelinjer [40], [41]. Udtrykket af

PIWIL

gener og

MAEL

i både normal æggestok og ondartet EOC korrelerer med øget ekspression af gentagne elementer og øger muligheden for, at Pirna pathway kan have været udløst af TE udtryk. bemærkede vi dog, at

L1

udtryk var fraværende i tidligere stadier maligne tumorer (n = 6), men konstant til stede på alle trin 3c tumorprøver. Dette giver nogle indicier, at aktiveringen af ​​Pirna pathway gener kan gå forud for

L1

udtryk under tumorprogression. Dette er i overensstemmelse med arbejde i andre tumorer, der korrelerer

L1

udtryk med kræft progression [42].

Maelstrom

udskæres resulterer i nedsat DNA methylering i kønskirtlerne, men ikke i somatisk væv. I gonader fører dette til en dramatisk stigning i overføres element udtryk i kimceller [43]. Vores observation af

MAEL

overekspression i fravær af påviselig

L1

udtryk i tidlige stadie tumorprøver rejser muligheden for, at ikke-funktionelle

MAEL

kan spille en rolle i faldende DNA methylering fremme efterfølgende

L1

udtryk.

Selvom

PIWIL1

udskrift niveau blev øget betydeligt i maligne EOC forhold til godartede og normale væv, kloning og sekventering af disse udskrifter foreslog, at disse transkripter kan frembringe afvigende og ikke-funktionel PIWIL1 protein. Flere mutationer blev fundet i

PIWIL1

udskrifter herunder usplejsede introns, tab af exons samt enkelt baseændringer par. Enkelt basepar ændringer måske et resultat af RNA-redigering [44].