PLoS ONE: En antimitotisk og Antivaskulær Agent BPR0L075 overvinder multiresistens og inducerer Mitotisk Catastrophe i Paclitaxel-Resistant Kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

Paclitaxel spiller en stor rolle i behandlingen af ​​kræft i æggestokkene; imidlertid observeres hyppigt resistens over for paclitaxel. Således vil nye terapi, der kan overvinde paclitaxel modstand være af væsentlig klinisk betydning. Vi evaluerede antiproliferative virkninger af en antimitotisk og antivaskulær agent BPR0L075 i paclitaxel-resistente æggestokkene cancerceller. BPR0L075 viser potent og bredspektret cytotoksicitet ved lave koncentrationer nanomolære (IC

50 = 2-7 ​​nM) mod begge parentale ovariecancerceller (OVCAR-3, SKOV-3, og A2780-1A9) og paclitaxel-resistente underlinjer ( OVCAR-3-TR, SKOV-3-TR, 1A9-PTX10), uanset ekspressionsniveauerne af det multilægemiddelresistens transporteren P-gp og klasse III β-tubulin eller mutation af β-tubulin. BPR0L075 cyklus blokerer celle ved G2 /M-fasen i paclitaxel-resistente celler, mens lige koncentration af paclitaxel-behandling var ineffektiv. BPR0L075 inducerer celledød ved en dobbelt mekanisme i forældrenes og paclitaxel-resistente æggestokkene cancerceller. I de parentale celler (OVCAR-3 og SKOV-3), BPR0L075 induceret apoptose, fremgår af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) spaltning og DNA-stige-dannelse. BPR0L075 induceret celledød i paclitaxel-resistente ovariecancerceller (OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR) skyldes primært mitotisk katastrofe, dokumenteret ved dannelsen af ​​gigantiske, flerkernede celler og fravær af PARP-spaltning. Immunoblotting analyse viser, at BPR0L075 behandling induceret opregulering af cyclin B1, BubR1, MPM-2, og survivin proteinniveauer og Bcl-XL-phosphorylering i parentale celler; men i resistente celler, de endogene udtryk for BubR1 og survivin blev udtømt, BPR0L075 behandling inducerede ikke MPM-2-ekspression og phosphorylering af Bd-XL. BPR0L075 celledød i både forældre- og paclitaxel-resistente ovariecancerceller fortsætte gennem caspase-3 uafhængige mekanismer. Afslutningsvis BPR0L075 viser potente cytotoksiske virkninger i æggestokkene cancerceller med et potentiale til at overvinde paclitaxel modstand ved at forbigå effluxtransportører og fremkalde mitotisk katastrofe. BPR0L075 repræsenterer en roman mikrotubuli terapeutisk at overvinde multiresistens og udløse alternativ celledød ved mitotisk katastrofe i æggestokkene cancerceller, der er apoptose-resistente

Henvisning:. Wang X, Wu E, Wu J, Wang TL, Hsieh HP Liu X (2013) En antimitotiske og Antivaskulær Agent BPR0L075 overvinder multiresistens og inducerer Mitotisk Catastrophe i paclitaxel-Resistant ovariecancerceller. PLoS ONE 8 (6): e65686. doi: 10,1371 /journal.pone.0065686

Redaktør: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, USA

Modtaget: November 21, 2012; Accepteret: April 24, 2013; Udgivet: 6 Juni 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Texas Tech University Health Sciences center (TTUHSC) Farmaceutiske Højskole (X. Liu). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene, den mest dødbringende malignitet af gynækologiske kræft, resulterer hvert år i løbet af 14.000 amerikanske og 114.000 på verdensplan dødsfald. Trods fremskridt i diagnosticering og behandling, de fem-årige overlevelsesrate for fase IV patienter er omkring 18% [1], [2]. Den manglende evne til at overvinde medikamentresistens og inhiberer metastase repræsenterer den største årsag til behandlingssvigt [3]. Innovative og effektive nye lægemidler, der overvinde resistens er et udtalt behov for at forbedre overlevelsen og livskvaliteten for patienter med denne sygdom.

mikrotubulusstabiliserende midler såsom taxaner, epothiloner og mikrotubulus-destabiliserende midler såsom

vinca Salg alkaloider er blandt de mest effektive kemoterapeutiske midler, der anvendes i klinikken [4]. Men en af ​​de største forhindringer udviklet i klinikken er multilægemiddelresistens (MDR). Især for paclitaxel, trods betydelig første reaktion for fremskreden ovariecancer hjælp paclitaxel og cisplatin baseret kombinationsbehandling, at langt størstedelen af ​​patienterne tilbagefald og udvikle lægemiddel-resistens [5], [6]. Paclitaxel modstand er multifaktoriel, herunder opregulering af membran narkotika efflukstransporteren P-glycoprotein (P-gp) [7], [8], mutationer i β-tubulin gen [9], [10], [11], [12 ], ændringer i ekspressionen af ​​p-tubulin isotyper [13], [14], afvigende signaltransduktionsveje [15], [16], og ændringer i apoptotiske regulatoriske proteiner såsom Bd-2 [17], [18], og inhibitor af apoptose protein survivin [19]. Identifikationen af ​​nye antimitotisk middel, der kan overvinde taxan modstand, vise udholdelig aktivitet i taxan-refraktære tumorer kan potentielt give kliniske fordele for patienter med fremskreden kræft i æggestokkene.

BPR0L075 [6-methoxy-3- (3 ‘, 4 ‘, 5’-trimethoxy-benzoyl) -1 H-indol] er en hidtil ukendt syntetisk indol forbindelse, der inhiberer tubulin-polymerisation via binding til colchicin-bindingsstedet af tubulin [20]. BPR0L075 er strukturelt beslægtet med den klassiske tubulin-bindende og vaskulær forstyrre agent combretastatin. BPR0L075 har vist antimitotiske og antiangiogenisk aktivitet

in vitro

in vivo

[20], [21]. Vi rapporterede, at BPR0L075 viste vaskulær forstyrrende aktivitet ved at inducere hurtig, omend midlertidig tumor vaskulær nedlukning og fører til reduktion af tumor perfusion i ortotopisk menneskelige brystkræft xenografter [22]. BPR0L075 standser humane cervikale carcinoma KB-celler ved G2 /M mitotisk checkpoint, og inducerer celleapoptose (IC

50 = 3,6 nM) ved at forstyrre mitokondrielle membranpotentiale og aktivering af caspase-3 kaskade [20]. BPR0L075 besidder god selektivitet mellem normale celler og cancerceller, med IC

50 værdi i normale fibroblast Detroit 551-celler højere end 1 uM [20]. BPR0L075 udviser enkeltstof antitumoraktivitet mod vækst af humane gastriske og cervikale carcinomceller xenotransplantater [20]. Det også synergistisk antitumorvirkning mod human lunge, colorektal og cervikale tumorxenoplantater ved kombination med cisplatin [21].

I den aktuelle undersøgelse, vi observerede, at BPR0L075 var meget aktiv i paclitaxel-resistente ovariecancerceller og deres forældre celler med IC

50 værdier ved enkelt ciffer lave nanomolære koncentrationer. BPR0L075 induceret apoptose i forældrenes æggestokkene cancerceller. I modsætning hertil er det inducerede mitotisk katastrofe i paclitaxel-resistente ovariecancerceller dokumenteret ved dannelse af store, multikerneholdige polyploide celler. BPR0L075 repræsenterer en ny og lovende mikrotubuli terapeutisk at overvinde taxan modstand og udløse alternativ celledød ved mitotisk katastrofe i celler, der er apoptose-resistente.

Resultater

BPR0L075 Viser Potent cytotoksicitet i Paclitaxel-resistent human ovariekarcinomceller

Vi testede cytotoksiciteten af ​​BPR0L075 i humane ovarie cancer cellelinjer SKOV-3, OVCAR-3, og A2780-1A9 samt paclitaxel-resistente underlinjer SKOV-3-TR, OVCAR-3 -TR, og 1A9-PTX10, som blev udvalgt under kontinuerlig eksponering på 0,25 uM paclitaxel (SKOV-3-TR), 0,5 uM paclitaxel (OVCAR-3-TR), og 15 ng /ml paclitaxel og 5 mg /ml verapamil ( 1A9-PTX10), hhv. Figur 1A viser, at, ligesom paclitaxel, BPR0L075 udviste sammenlignelig antineoplastisk aktivitet i dræbende parentale ovariecancerceller ved lave koncentrationer nanomolære. Men BPR0L075 var mere effektivt end paclitaxel mod paclitaxel-resistente ovariecancerceller, næsten helt bevarer sin cytotoksiske styrke mod disse resistente underlinjer, hvor paclitaxel var næsten ineffektive. Figur 1B opsummerer IC

50 værdier af BPR0L075, paclitaxel og doxorubicin mod vækst af disse humane ovariecancerceller og deres resistente underlinjer efter 4 dages kontinuerlig eksponering. Den SKOV-3-TR og OVCAR-3-TR celler viste høj resistens forhold ( 400 gange) for paclitaxel sammenlignet med de tilsvarende parentale celler. 1A9-PTX10 celler udviste moderat modstand ratio (98 gange) for paclitaxel. Disse paclitaxel-resistente celler viste også krydsresistens over for doxorubicin (1,8-12 gange). BPR0L075 viste tilsvarende følsomhed i alle parrede forældrekontrol og paclitaxel-resistente æggestokkene cellelinjer med IC

50 værdier fra 2-7 nM (figur 1B).

(A) formering humane ovariecancerceller (Skov- 3, OVCAR-3, og A2780-1A9) og paclitaxel-resistente underlinjer (SKOV-3-TR, OVCAR-3-TR, og 1A9-PTX10) blev behandlet med BPR0L075 (rød cirkel) eller paclitaxel (blå firkant) ved 3 -15 nM koncentrationer i 4 dage og cytotoksiciteten blev bedømt ved SRB-assay. Fraktion af celle overlevelse i forhold til kontroller repræsenterer middel ± SD af 12 bestemmelser. (B) Sammenfatning af P-gp-ekspression, βIII-tubulin ekspression, og følsomheden af ​​parrede æggestokkene cancercellelinier til paclitaxel, doxorubicin, og BPR0L075 behandling. Tal i parentes betegner graden af ​​resistens (x-fold), udtrykt som forholdet af IC

50 værdier sammenlignet med de tilsvarende parentale linier. Alle forsøg blev gentaget tre gange.

BPR0L075 er ikke et substrat for effluxtransportører og Active i æggestokkene Cancer Cells med ændret βIII-tubulin Udtryk og β-tubulin Mutation

Immunoblotting analyse viste, at de resistente celler OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR har høj ekspression af P-gp protein mens de parentale OVCAR-3 og SKOV-3-celler, har ingen målelig P-gp-ekspression (figur 2A). For at bekræfte at BPR0L075 er ikke et substrat for efflukspumper målte vi de intracellulære BPR0L075 niveauer i de to par af cellelinier OVCAR-3 /OVCAR-3-TR og SKOV-3 /SKOV-3-TR anvendelse af en følsom LC /MS /MS-metode (figur 2B). Begge par celler opnået lignende intracellulære BPR0L075 koncentrationer efter BPR0L075 behandling (20 nM i 6 timer, figur 2C) med ingen statistisk forskel (

P

0,05). BPR0L075 er ikke et substrat for et andet ATP-bindende kassette efflukstransporteren brystkræft resistens protein (BCRP), fremgår af den sammenlignelige cytotoksicitet i humane brystcancer MCF7-celler (IC

50 = 3,5 nM) og mitoxantron-resistente MCF7 /MX-celler (IC

50 = 4,0 nM), MCF7 /MX celler vides at overudtrykke BCRP [23], [24], [25]. Sammen viser resultaterne, at efflukstransporteren P-gp bidraget til den valgte paclitaxel resistens i SKOV-3-TR og OVCAR-3-TR-celler, men BPR0L075 er ikke et substrat for efflukspumper, hvilket bidrager til dens evne til at overvinde paclitaxel resistens .

(A) Western blot analyse af P-gp og βIII-tubulin udtryk i de parrede æggestokkene kræftceller. Pan β-tubulin og β-actin blev indlæsning kontroller. (B) LC /MS /MS-analyse af intracellulære BPR0L075 niveauer med LC chromatogram, der viser retentionstiden for intern standard [1- (1H-indol-3-ylcarbonyl) -1 H-imidazol] og BPR0L075 som 2,2 og 2,8 min, henholdsvis . De masse overgange i m /z 212 → 144 for intern standard og m /z 342 → 195 for BPR0L075 blev overvåget for kvantificering. (C) De intracellulære BPR0L075 niveauer i de parrede ovarian cancer cellelinjer. Celler blev inkuberet med 20 nM BPR0L075 i 6 timer, derefter blev cellerne vasket, høstet, og lyseret for LC /MS /MS-måling. Søjler repræsenterer middelværdi ± SD af tre uafhængige tests. Ingen statistisk signifikant forskel blev observeret (

P

0,05, student

t

-test)

Paclitaxel modstand fænotype er ofte forbundet med ændring af klassen. III β-tubulin isotype-ekspression [26]. Vi observerede differentierede udtryk for tubulin-isotype βIII-tubulin i forældrenes og paclitaxel-resistente æggestokkene cancerceller. Begge OVCAR-3 og SKOV-3 celler har høje udtryk for βIII-tubulin, men efter valget med paclitaxel, udtryk for βIII-tubulin markant formindsket (figur 2A), når den ændring af βIII-tubulin udtryk i resistente celler ikke gjorde påvirker følsomheden over for BPR0L075. De 1A9-PTX10 celler er kendt for at udvise en ikke-MDR1 fænotype, de huser β-tubulin mutation med forringet paclitaxel interaktion med tubulin [27], [28], [29], [30] (figur 1B). Mutationen af ​​β-tubulin ikke negativ indvirkning på BPR0L075 inducerede cytotoksicitet i 1A9-PTX10 celler (figur 1). Sammen BPR0L075 er cytotoksisk for celler med høj P-gp og BCRP udtryk; cytotoksicitet er uafhængig af βIII-tubulin ekspressionsniveauerne eller β-tubulin mutation status.

BPR0L075 inducerer G2 /M Arrest i Både Parental og paclitaxel-resistente ovariecancerceller

Vi fulgte cellecyklus progression i både parentale og paclitaxel-resistente celler efter BPR0L075 behandling. Som vist i figur 3, BPR0L075 behandling (10-100 nM, lægemiddelniveauer kan opnås i muse-xenotransplantater [22]) i 24 timer resulterede i tab af cellepopulationen fra G0-G1 faser, med samtidig akkumulering af celler i G2 /M fase i begge OVCAR-3 og OVCAR-3-TR-celler. I sammenligning med den robuste cellecyklusstandsningen af ​​BPR0L075, paclitaxel-resistente celler udviste defekte mitotisk respons på paclitaxel, der har undladt at standse i mitose selv behandlet med 100 nM paclitaxel (data ikke vist). For OVCAR-3-TR celler, polyploide celler ( 4N DNA) viste sig efter BPR0L075 behandling sammenligne med OVCAR-3 celler. Vi undersøgte også tidsforløbet af BPR0L075 induceret cellecyklusstop når behandlet med 10 nM BPR0L075. BPR0L075 begyndte at blokere OVCAR-3 celler ved G2 /M allerede i 12 timer fase, og skred at fuldføre arrest fra 24 til 48 timer i begge OVCAR-3 og OVCAR-3-TR-celler. BPR0L075 behandlet OVCAR-3-TR celler gav anledning til en betydelig del af polyploide celler (DNA indhold 4N) på 24-48 timer (Figur 3, pile). Tilsvarende BPR0L075 behandling inducerede også koncentrations- og tidsafhængig cellecyklusstandsning i G2 /M-fasen i både SKOV-3 og SKOV-3-TR-celler, med høj brøkdel af polyploide celler i SKOV-3-TR (fig S1 ). Mitotisk celledød eller mitotisk katastrofe er ofte forbundet med vækststandsning i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus efterfulgt af dannelsen af ​​store polyploide celler [31], [32], disse polyploide celler observeret antyder, at BPR0L075 induceret mitotisk katastrofe i paclitaxel -resistente ovariecancerceller. Salg

OVCAR-3 og OVCAR-3-TR-celler blev behandlet med ethanol køretøj eller BPR0L075 (10-100 nM) i 24 timer eller 10 nM BPR0L075 for angivne varigheder (0-48 timer ), farvet med propidiumiodid og analyseret ved flowcytometer. Cellecyklussen profiler præsenteres som tredimensionale overlay. X-aksen viser intensiteten af ​​propidiumiodid fluorescens, hvilket indikerer cellulært DNA-indhold i forskellige cellecyklusfaser. Y-aksen repræsenterer celletal; og z-aksen viser koncentrationen eller tidspunkter af BPR0L075 behandling. 2N, celler, der er bosiddende i G0-G1-fasen af ​​cellecyklussen; 4N, celler i G2 fase eller mitose. BPR0L075 inducerer signifikant G2 /M anholdelse efterfulgt af fremkomsten af ​​en sub-G1 befolkning i både forældre- og resistente celler, med polyploide celler (pile) kun i de resistente celler. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

BPR0L075 forstyrrer mikrotubuluscytoskelettet og inducerer Mitotisk Catastrophe i Paclitaxel-resistent ovariecancerceller

Vi undersøgte effekten af ​​BPR0L075 om tilrettelæggelse af mikrotubuli net af ovariecancerceller efter immunfluorescensfarvning af α-tubulin (grøn). Som vist i figur 4, ethanol vehikelbehandlede OVCAR-3 og SKOV-3 celler havde velorganiseret typiske radial mikrotubulære netværk arrays; i modsætning hertil BPR0L075 (20 nM i 18 timer) behandlet OVCAR-3 og SKOV-3-celler havde afrundet form, kondenseret kromosomer, med sprængning af mikrotubuli fibre af de celler, der er ledsaget af cellulær deformation. For paclitaxel-resistente OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR celler blev de lange mikrotubuli fibre sjældent set i vehikelbehandlede celler, med endnu mindre farvning efter behandling af BPR0L075. BPR0L075 behandlede resistente celler viste også karakteristika af mitotisk katastrofe defineres af dannelsen af ​​gigantiske, flerkernede celler (figur 4, pile).

Dækglas indeholdende OVCAR-3 og SKOV-3 forældre- og paclitaxel-resistente celler blev udsat til medium indeholdende ethanol køretøj eller 20 nM BPR0L075 i 18 timer. Cellerne blev fikseret, dækglassene blev derpå farvet med anti-α-tubulin-antistof (AlexaFluor 488, grøn) til mikrotubuli og 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, blue) for cellekerner, og observeret af Olympus IX81 fluorescens mikroskop . De kontrol forældrenes celler viste typiske radiale mikrotubuli arrays. BPR0L075 behandling forstyrret mikrotubuluscytoskelettet i både forældrenes og resistente æggestokkene kræftceller. Hvide pile viser de gigantiske, flerkernede celler karakteristiske for mitotisk katastrofe. Scale bar, 10 um.

Paclitaxel-resistente ovariecancerceller Display dereguleret Mitotisk respons og Udtømning af Surviving

Vi analyserede de vigtigste molekylære begivenheder forbundet med BPR0L075 induceret cellecyklusstop. Cyclin B1 er et cellecyklusregulerende protein involveret i mitose og hovedsageligt udtrykt under G2 /M-fasen af ​​cellecyklussen. Western blot analyse viste, at de basale udtryk for cyclin B1 i paclitaxel-resistente OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR-celler var signifikant lavere end i OVCAR-3 og SKOV-3-celler. BPR0L075 behandling (10-100 nM for 24 timer) forårsagede en koncentrationsafhængig forøgelse af cyclin B1-niveauer i både parentale cellelinier og paclitaxel-resistente underlinjer (figur 5A, B). BPR0L075 behandling også induceret opregulering af mitosespindelen checkpoint protein BubR1 i forældrenes OVCAR-3 og SKOV-3 celler. I paclitaxel-resistente OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR-celler, den endogene ekspression af BubR1 blev udetekterbar (figur 5A, B). Vi overvågede også MPM-2-protein, en etableret markør af mitotiske celler, der genkender en gruppe af phosphorylerede former af proteiner, der phosphoryleres kun i mitose [33], [34]. BPR0L075 behandling (10-100 nM for 24 timer) forårsagede øjeblikkelig induktion af MPM-2 i parentale celler, men ikke i de resistente underlinjer der har mitotiske defekter (figur 5A, B). Vi observerede også den endogene ekspression af survivin, en mitose regulator og inhibitor af apoptose protein, i OVCAR-3 og SKOV-3-celler (figur 5A, B). BPR0L075 medieret mitosestandsning er associeret med induktion af survivin i en koncentrationsafhængig måde i parentale celler, som bevarer en overlevelse vej for cancerceller. I modsætning hertil blev survivin udtryk udtømt i OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR underlinjer, BPR0L075 behandling undladt at fremkalde survivin opregulering i paclitaxel-resistente celler (figur 5A, B).

behandling BPR0L075 (10-100 nM for 24 timer) inducerede ændringer i cyclin B1, BubR1, MPM-2, og survivin udtryk i OVCAR-3 /OVCAR-3-TR-celler (A) og SKOV-3 /SKOV-3- TR-celler (B). BPR0L075 behandling (10 nM) inducerede ændringer i PARP, BCL-XL, og Bcl-2-proteiner på forskellige tidspunkter (0-72 timer) i OVCAR-3 /OVCAR-3-TR-celler (C) og SKOV-3 /Skov- 3-TR-celler (D). 50 ug af proteinet lysatet blev sat på SDS-PAGE og forsøg blev gentaget og repræsentative blots er vist.

BPR0L075 inducerer Phosphorylering af Bcl-XL i parentale celler, men ikke i Paclitaxel-resistent Ovarian cancer Cells

Bcl-2-familien proteiner er vigtige regulatorer af apoptose, og deres ekspressionsniveauer har været foreslået at korrelere med følsomhed over for paclitaxel [35], [36], [37]. De OVCAR-3 og SKOV-3 cellelinier udtrykte ikke Bcl-2-protein til et immunodetectable niveau, men viste sig at udtrykke høje niveauer af Bcl-XL. I modsætning til OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR underlinjer, Bcl-2-protein-niveau var let detekterbar som forbundet med nedsat ekspression af Bd-XL (figur 5C, D). Når de behandles de parentale celler med 10 nM BPR0L075, den phosphorylerede form af Bcl-XL fremkom ved 12-72 timer, fremgår af de elektroforetiske mobilitetsforskydninger på immunoblots (figur 5C, D). Men lignende eksponering af BPR0L075 ikke inducerer Bcl-2 eller Bcl-XL-phosphorylering i OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR underlinjer. BPR0L075 behandling reducerede Bcl-XL-niveauer i OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR-celler uden at påvirke Bcl-2-niveauer (figur 5C, D).

BPR0L075 celledød er Caspase-3 Independent Både Parental og paclitaxel-resistente ovariecancerceller

BPR0L075 behandling induceret proteolytisk spaltning af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) fra en MW på 116 kDa polypeptid til en MW på 85 kDa fragment i OVCAR-3 og SKOV-3-celler på en tids- (Figur 5C, D) og koncentrations- (figur 6A, B) afhængig måde. Imidlertid blev PARP-spaltning ikke observeret i de OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR-celler (figur 5C, D, 6A, B), til trods for at den BPR0L075 behandling dræbt både parentale og resistente celler med lignende IC

50 værdier (figur 1). Vi observerede også, at BPR0L075 behandling induceret DNA-stige-dannelse, et kendetegn for celleapoptose, i SKOV-3 og OVCAR-3 celler, men ikke i SKOV-3-TR og OVCAR-3-TR underlinjer (figur 6C). Anvendelse af Western blot-analyse, observerede vi ingen aktivering af caspase-3 (tab af procaspase 3 eller udseendet af spaltet caspase-3) i begge parentale og resistente celler efter BPR0L075 behandling under anvendelse af enten antistoffer specifikke anerkendt procaspase-3 eller spaltet caspase-3 ( Figur 6A, B). For yderligere at bekræfte en caspase-3 uafhængig celledød pathway, vi forbehandlet cellerne med en caspase-3-specifikke og irreversibel inhibitor (20 uM Z-DEVD-FMK) eller negativ kontrol-inhibitor (20 uM Z-FA-FMK) 24 timer før tilsætning af BPR0L075. Der blev ikke observeret nogen statistisk signifikant forskel på cytotoksicitet for hvert par af cellelinjer (figur 6D,

P

0,05, student

t

-test); caspase-3-inhibitor forhindrede ikke celledød både de parentale og resistente celler. Mitotisk katastrofe er kendt for at resultere i celledød ved caspase-2 og caspase-3 afhængige og uafhængige mekanismer [38]. Vi kontrollerede aktiveringen caspase-2 efter behandling med BPR0L075 blev caspase-2-spaltning ikke påvist i både forældre- og resistente celler (figur 6A, B). Sammen de data indikerer, at caspase-2 og caspase-3 uafhængige celledød var involveret i både forældrenes og paclitaxel-resistente ovariecancerceller; den fremherskende celledød pathway var gennem apoptose i parentale celler, og mitotisk katastrofe i resistente ovariecancerceller.

Western blot-analyse af PARP, caspase-2, og caspase-3 efter BPR0L075 (10-100 nM) behandling i 24 timer i de OVCAR-3 /OVCAR-3-TR-celler (A) og SKOV-3 /SKOV-3-TR-celler (B). β-actin blev loading kontrol. (C) DNA-stige assays i celler behandlet med 10 nM BPR0L075 i 72 timer. Genomisk DNA blev underkastet 1% agarosegelelektroforese. Gelen blev farvet med ethidiumbromid, og DNA-bånd blev visualiseret under en ultraviolet transilluminator. (D) Virkning af caspase-3-inhibitor på BPR0L075 induceret cytotoksicitet. Celler blev forbehandlet med caspase-3 inhibitor (20 pM Z-DEVD-FMK) eller negativ kontrol-inhibitor (20 uM Z-FA-FMK) i 24 timer før inkubation med 10 nM BPR0L075 i yderligere 72 timer. Ved afslutningen af ​​inkubationen blev cellelevedygtigheden bestemt ved SRB-assay. Der blev ikke observeret signifikant forskel af cytotoksicitet for hvert par af cellelinjer (

P

0,05, student

t

-test). Data repræsenterer gennemsnit ± SD.

Discussion

Paclitaxel er en af ​​de mest succesfulde kemoterapeutiske midler og anvendes til behandling af en lang række humane maligniteter, herunder faste tumorer og hæmatologiske maligniteter [4], [39]. Paclitaxel vides at binde til p-tubulin og fremme dens samling til mikrotubuli [40], hvilket fører til standsning af cellecyklus ved G2 /M-fasen, aktiverer mitosespindelen “kontrolpunkt”, og i sidste ende fører til apoptotisk celledød [4]. Paclitaxel er en front-line agent for ovariecancer kemoterapi, sammen med platin midler. Imidlertid er behandling af fremskreden ovariecancer med paclitaxel hindres af udviklingen af ​​lægemiddelresistens. Identifikation nye midler, der overvinder er et presserende behov paclitaxel modstand. BPR0L075 er en heterocyklisk 3-aroylindole mikrotubulus-destabiliserende middel, der interfererer med tumorcelle mikrotubulusdynamik, fører til cancer cellecyklusstandsning og celledød ved caspase-3-medieret apoptose [20] og antiangiogene virkninger [21]. Desuden BPR0L075 forstyrrer tumorvaskulatur og lukker tumor blod perfusion

in vivo

[22]. I den aktuelle undersøgelse testede vi effektiviteten og mekanismen for BPR0L075 til behandling af paclitaxel-resistente ovariecancerceller.

Vores resultater viser, at ovariekræft cellelinier, modstandsdygtig over for mikrotubulusstabiliserende paclitaxel kan forblive følsomme for mikrotubulus -destabilizing agent BPR0L075. BPR0L075 viste potent cytotoksicitet i begge parentale ovariecancerceller og deres paclitaxel-resistente underlinjer med IC

50 værdier omkring 5 nM, mens lige koncentration af paclitaxel behandling var ineffektiv i stærkt resistente ovariecancerceller (figur 1). Disse paclitaxel-resistente ovariecancerceller viste også krydsresistens over for andre kemoterapeutiske midler, såsom doxorubicin (figur 1B). Denne observation er i overensstemmelse med den forudgående rapport at BPR0L075 er effektiv mod multiresistente humane cervikale carcinoma KB-celler, der er resistente over for vincristin, paclitaxel og colchicin [20]. Vores resultater viser, at BPR0L075 er en potentiel nyttig middel til at kontrollere multiresistente æggestokkene cancerceller.

Vores data viser, at BPR0L075 overvinder to vigtigste mekanismer for resistens over for paclitaxel, dvs MDR1 modstand henføres til P-glycoprotein overekspression og ændring af klasse III-β-tubulin isotype-ekspression. Paclitaxel-resistente OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR underlinjer viste overekspression af P-gp (figur 2A), en efflukspumpen kunne hæmme tilbageholdelse af taxaner og andre kationiske lægemidler [41]. BPR0L075 er ikke et substrat for P-gp og BCRP efflukspumper, fremgår af de tilsvarende BPR0L075 intracellulære niveauer opnået i de parentale og resistente underlinjer (Figur 2C) og sammenlignelig IC

50 værdier i MCF7 og MCF7 /MX celler. Begge OVCAR-3 og SKOV-3-celler har høj ekspression af klasse III β-tubulin, mens OVCAR-TR og SKOV-3-TR viste markant formindsket ekspression af klasse III β-tubulin (figur 2A), hvilket tyder på, at ændringen gruppe III β-tubulin udtryk påvirker følsomheden over for paclitaxel, men ikke BPR0L075. BPR0L075 er også yderst effektiv til aflivning 1A9-PTX10 celler med β-tubulin genmutation [27], [28] (figur 1). Vores resultater understøtter de tidligere rapporter om, at mutationer i β-tubulin og ændringer i ekspressionen af ​​klasse III beta-tubulin isotyperne resistens mod mikrotubuli-stabiliserende midler og overfølsomhed over for mikrotubuli-destabiliserende midler gennem en ændring i mikrotubulussamling og dynamik i kræftceller [42]. Sammen vore resultater antyder, at paclitaxel og BPR0L075 binder på forskellige steder af tubulin; har ikke-overlappende resistensmekanisme, hvilket potentielt tillader anvendelse af BPR0L075 for disse Ovariecancerpatienter recidiverende efter paclitaxel kemoterapi.

BPR0L075 induceret cellecyklusstandsning ved G2 /M-fasen i den parentale og paclitaxel i æggestokke cancerceller, når paclitaxel behandling var næsten ineffektive (Figur 3, Figur S1). Den flowcytometri data viser, at BPR0L075 ikke forårsager fuldstændig mitosestandsning i paclitaxel-resistente celler, hvilket indikerer, at de resistente celler stadig kan undergå DNA-syntese trods svigt af celledeling. BPR0L075 behandlede resistente celler gav anledning til en væsentlig del af polyploide celler (figur 3, figur S1), hvilket antyder, at BPR0L075 induceret celledød i paclitaxel-resistente celler fortsætte gennem mitotisk katastrofe. Mitotisk katastrofe er en anden form for celledød vej, der er forårsaget af unormal mitose og /eller uoprettelig kromosomskader [32], [43], [44], [45]. Mitotisk katastrofe opstår under eller kort efter en dereguleret eller mislykkedes mitose og kan være ledsaget af morfologisk ændring såsom micronucleation (udseendet af kromosomer eller kromosomale materiale uden for to datter kerner) og multinukleation (fremkomsten af ​​to eller flere kerner lignende eller heterogen i størrelse, som er resultatet af mangelfuld adskillelse under cytokinese) [43], [44], [45]. Dannelsen af ​​gigantiske flerkernede celler er en fænotype af mitotisk katastrofe i celler induceret af ioniserende stråling [46], [47] eller anticancerlægemidler påvirker mikrotubulus stabilitet [43], [48], [49], [50]. Immunofluorescens-farvning viser udseendet af gigantiske, flerkernede celler (figur 4) efter BPR0L075 behandling af resistente celler, hvilket antyder, at kromosom adskillelse forekommer i det mindste i et vist omfang i paclitaxel-resistente celler, men cytokinese mislykkedes.

Vores undersøgelse viser, at mitotiske respons veje er stærkt dereguleret i OVCAR-3-TR og SKOV-3-TR cancerceller, dokumenteret ved nedregulering af cyclin B1, udtømning af mitosespindelen checkpoint protein BubR1, og manglende evne til at aktivere mitotisk epitop MPM-2 i resistente celler sammenlignet med de parentale celler (figur 5A, B). Observationerne er i overensstemmelse med rapporter, der faldt udtryk for cyklin B1 og BubR1 er forbundet med svækket spindel checkpoint og paclitaxel modstand i ovariecancer celler [51]; udtømning af BubR1 med siRNA resulterede i tab af spindel samling checkpoint funktion og resistens over for paclitaxel [52].

Survivin udtynding i paclitaxel-resistente ovariecancerceller kunne spille en rolle i BPR0L075-induceret mitotisk katastrofe. Survivin er et bifunktionelt protein, der fungerer som en undertrykker af apoptose og en mitotisk regulator [53], [54], [55]. Survivin hæmmer apoptose ved at interagere med caspase og Smac /DIABLO proteiner, undertrykke aktivering af downstream caspaser, som bevarer en overlevelse vej [56]. Survivin modulerer også flere mitotiske begivenheder, herunder spindel og interfase mikrotubulus organisation, spindlen samle checkpoint og cytokinese [44]. Vi observerede tab af basal ekspression af survivin i paclitaxel-resistente celler sammenlignet med parentale celler (figur 5A, B), hvilket antyder svækkelse af spindel checkpoint i de resistente celler. Paclitaxel er kendt for at være ineffektive til behandling af survivin-udtømte cancerceller [57], [58].