PLoS ONE: Effekter af eicosapentaensyre og docosahexaensyre om prostatakræft Cell Migration og invasion induceret af tumorassocierede makrofager

abstrakt

eicosapentaensyre (EPA) og docosahexaensyre (DHA) er de primære n-3 polyumættede fedtsyrer (PUFA’er) i fiskeolie, der reducerer risikoen for prostatacancer. Tumorassocierede makrofager (TAM’er) er de vigtigste leukocytter intratumoral infiltration, og øget TAM’er korrelerer med dårlig prognose prostatacancer. Imidlertid er den mekanisme af n-3 PUFA’er på prostatacancercelle progression induceret af TAM’er ikke godt forstået. I denne undersøgelse undersøgte vi virkningerne af EPA og DHA på modulering af migration og invasion af prostatacancerceller induceret af TAM’er-lignende M2-type makrofager. PC-3 prostatacancerceller blev forbehandlet med EPA, DHA, eller peroxisomproliferatoraktiveret receptor (PPAR) -γ antagonist, GW9662, før udsættelse for konditioneret medium (CM). CM blev afledt fra M2-polariserede THP-1 makrofager. De vandrende og invasive evner PC-3 celler blev vurderet ved hjælp af et cokultur system M2-typen makrofager og PC-3 celler. EPA /DHA administration faldt migration og invasion af PC-3-celler. Den PPAR-γ DNA-bindende aktivitet og cytosol hæmmende faktor κBα (kBa) proteinekspression steget, mens den nukleare faktor (NF) -κB p65 transkriptionel aktivitet og nuklear NF-KB-p65 protein niveau faldt i PC-3 celler inkuberet med CM i tilstedeværelse af EPA /DHA. Endvidere EPA /DHA nedregulerede mRNA udtryk for matrixmetalloproteinase-9, cyclooxygenase-2, vaskulær endotelvækstfaktor, og makrofag-kolonistimulerende faktor. Forbehandling med GW9662 afskaffede de gunstige virkninger af EPA /DHA på PC-3 celler. Disse resultater indikerer, at EPA /DHA administration reducerede migration, invasion og makrofag kemotaxi af PC-3-celler induceret af TAM-lignende M2-type makrofager, som delvis kan forklares ved aktivering af PPAR-γ og faldt NF-KB p65 transkriptionel aktivitet.

Henvisning: Li CC, Hou YC, Yeh CL, Yeh SL (2014) Virkninger af eicosapentaensyre og docosahexaensyre om prostatakræft Cell Migration og invasion induceret af Tumor-associerede makrofager. PLoS ONE 9 (6): e99630. doi: 10,1371 /journal.pone.0099630

Redaktør: Rolf Müller, Philipps Universitet, Tyskland

Modtaget: December 27, 2013; Accepteret: 17. maj 2014 Udgivet: 12 Jun 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Science Rådet tilskud NSC 100-2320-B-038-009 Taipei, Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige kræftform diagnosticeret blandt mænd i de udviklede lande og er den førende årsag til kræftdødsfald i verden [1]. Trods forbedringer i forskellige terapeutiske tilgange i de seneste år, terapi for patienter med fremskreden prostatacancer mangler stadig effekt. Den faste tumor er sammensat af neoplastiske celler og stromale komponenter, herunder fibroblaster, endotelceller og migrerende hæmatopoietiske celler. Makrofager er de mest udbredte immunceller i tumormikromiljøet, såkaldte tumorassocierede makrofager (TAM’er) [2], [3]. TAM’er er hovedsagelig M2-type makrofager fordi de udtrykker en række overflademarkører, såsom CD36 og CD163 [4]. Også TAM’er blev vist at spille afgørende roller i overlevelse, proliferation og metastase af cancerceller, og højere TAM’er infiltration er ofte korreleret med en dårlig prognose i mange tumorer, såsom prostatakræft. Et klinisk studie udført af Lissbrant et al. [5] fandt positive korrelationer tætheden af ​​TAM’er med prostata tumorcelleproliferation og mikrokar tæthed. Desuden kan TAM’er lette kræft cellemigration og invasion ved secernerende faktorer, såsom vækstfaktorer, cytokiner, kemotaktiske faktorer, og matrixmetalloproteinaser (MMP’er) [6] -. [9] Salg

peroxisomproliferatoraktiveret receptorer ( PPAR’er) er nukleære receptorer og ligandaktiverede transkriptionsfaktorer i steroid superfamilien. PPAR familien består af tre forskellige undertyper: PPAR-a, PPAR-p /δ, og PPAR-y. De heterodimerisere med retinoid X receptor (RXR) og regulere målgenprodukter udtryk ved binding til peroxisomproliferator responselementer (PPREs) placeret i promotorregionen [10]. PPAR-γ er primært udtrykkes i fedtvæv og spiller vigtige roller i reguleringen af ​​glucose og lipidmetabolisme og adipocytdifferentiering [11]. Det blev rapporteret, at PPAR-γ-aktivering kan modulere inflammatoriske reaktioner og inhibere udviklingen og progressionen af ​​en bred vifte af epitel-afledte humane cancerceller, herunder prostata, bryst og tyktarmskræft [12] – [14]. Derudover induktion af PPAR-γ-ekspression blev korreleret med inhibering af nuklear faktor (NF) -κB aktivitet og nedsat udtryk for angiogene proteiner i ikke-småcellet lungecancer-celler. Disse fund antyder, at inaktivering af NF-KB kan være involveret i en PPAR-γ-afhængige vej [15].

eicosapentaensyre (EPA) og docosahexaensyre (DHA) er de to mest almindelige langkædede n- 3 polyumættede fedtsyrer (PUFA) i fiskeolie. Epidemiologiske data viste, at indtagelse af fisk er omvendt forbundet med forekomsten af ​​og dødeligheden af ​​prostatacancer, især metastatisk cancer [16] – [18]. Serum EPA og DHA-niveauer i patienter med prostatacancer var lavere end patienter med benign prostatahyperplasi [19]. Voksende beviser har vist, at n-3 PUFA udøver antitumoregenskaber. Men lidt opmærksomhed er blevet betalt, til forholdet mellem n-3 PUFA og prostatakræft celle progression fremkaldt af TAMer. En tidligere undersøgelse viste, at EPA hæmmer human HT-29 coloncancer cellevækst, og denne virkning var resultatet af PPAR-γ-aktivering [12]. Desuden blev n-3 PUFA’er vist at inducere apoptose ved aktivering af PPAR-γ i prostatacancerceller [20]. Siden N-3 PUFA’er er blevet vist at binde effektivt til det ligandbindende domæne af PPAR-γ og aktivere PPAR responselement-reporter assays i forskellige cellelinier [12], [21], vi hypotese, at EPA og DHA administration undertrykke progressive egenskaber af prostatacancer via aktivering af PPAR-γ involveret pathway. Således har vi brugt PC-3-celler behandlet med konditioneret medium (CM) fra M2-typen makrofager eller i en ikke-kontakt for at fastslå virkningerne og mulige mekanismer EPA og DHA på prostatacancer cellemigration og invasion induceret af TAM’er.

Materialer og metoder Salg

Cellelinier og dyrkningsbetingelser Salg

Prostata PC-3 cancerceller og humane THP-1 monocytiske celler blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Celler blev opretholdt i RPMI 1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin-streptomycin (10 ng /ml penicillin og 10 U /ml streptomycin), og 2,5 mM glutamin ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 incubator.

Fremstilling af fedtsyre-bovint serumalbumin (BSA) komplekser

EPA, DHA, og BSA blev erhvervet fra Sigma ( St. Louis, MO, USA). Fedtsyre-BSA-komplekser blev fremstillet som 10 mmol /l bestande med et forhold mellem fedtsyrer til BSA på 04:01 og blev opløst ved en sonikator i et køligt vandbad i 60 min. Fedtsyre-BSA lagrene blev opbevaret ved -20 ° C under argon indtil den er klar til brug [22].

Cell levedygtighed assay

levedygtighed PC-3 celler blev bestemt ved en Alamar blå assay (Invitrogen). PC-3-celler blev podet i plader med 96 brønde (1000 celler /brønd) natten over og derefter behandlet med forskellige doser af EPA eller DHA (0~400 uM). BSA køretøj blev anvendt som en kontrol (C). Efter 20 timers behandling blev cellerne inkuberet i medium indeholdende 10% Alamar blåt farvestof ved 37 ° C i 4 timer, og den kolorimetriske ændring blev målt med en mikropladelæser ved 570 og 600 nm.

CM præparater og behandlinger

Makrofag differentiering blev udført i overensstemmelse med tidligere etablerede protokoller [23]. THP-1-celler (5 x 10

6) blev podet i 75-cm

2 vævskulturkolber og dyrket med 320 nM phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA; Sigma) i 4 timer. For M2-typen makrofag differentiering, blev THP-1-celler behandlet med 320 nM PMA, 20 ng /ml interleukin (IL) -4, og 20 ng /ml IL-13 (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) i yderligere 20 h. For at generere M1-typen makrofager blev THP-1-celler behandlet med 320 nM PMA i 4 timer og derefter behandlet med 320 nM PMA, 20 ng /ml interferon (IFN) -γ (PeproTech), og 100 ng /ml lipopolysaccharid ( LPS) fra

Escherichia coli

serotype 0111: B4 (Sigma) i 20 timer. Efter stimulering blev cellerne vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) to gange og dyrket med frisk medium i 24 timer, og derefter CM blev opsamlet.

PC-3 prostatacancerceller blev podet ved 5 x 10

5 i 6-brønds plader 1 dag før behandling. Til behandling af celler blev celler placeret i medium indeholdende forskellige koncentrationer af EPA, DHA (0, 25, og 50 uM) eller 10 uM GW9662 i 24 timer og derefter celler blev behandlet med CM indeholdende den samme koncentration af fedtsyrer i yderligere 24 h. PC-3 celler blev høstet til yderligere analyse.

Migration og invasion analyser

De vandrende og invasive evner PC-3-celler (2 × 10

4 for migration assay og 10

5 celler til invasion assay) blev hver bestemt ved anvendelse af plader med 24 brønde med Millicell dyrkningsplade Inserts (8 um porestørrelse; Millipore, Billerica, MA, USA) i 12 timer og Matrigelcoatede (BD Biosciences, Bedford , MA, USA) indsætter i 24 timer. Kort fortalt blev PC-3-celler tilsat til de øvre kamre i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS, og THP-1-celler (10

5) blev differentieret til M2-type makrofager i de nedre kamre. Efter PC-3-celler havde fæstnet, blev mediet fra det øvre og nedre kammer erstattet med serumfri RPMI 1640 indeholdende forskellige koncentrationer af EPA, DHA, eller GW9662 (10 uM). Derefter blev celler på den øvre insert overflade af membranen fjernes med vatpinde efter inkubation. Efter fiksering med 4% paraformaldehyd, trækkende og invasive celler blev farvet med 0,5% krystalviolet i 2% methanol. Membraner blev vasket tre gange med PBS, og farvestoffet blev elueret med 30% eddikesyre. Absorbansen blev aflæst ved 595 nm med en mikropladelæser. Mindst tre uafhængige forsøg blev udført for hver analyse.

DNA-bindende aktiviteter af PPAR-γ og NF-KB p65

Nuclear ekstrakter fra celler blev høstet under anvendelse af NE-PER cytoplasmatisk og nuklear proteinekstraktion kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) ifølge producentens anvisninger. DNA-bindende aktivitet af PPAR-γ blev analyseret under anvendelse af et enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) -baseret Trans-AM Transcription Factor Assay PPAR-γ Kit (Active Motif, Carlsbad, CA, USA). Et oligonukleotid, der indeholdt en peroxisomproliferator responselement (PPRE) (5′-AACTAGGTCAAAGGTCA-3 ‘) blev coatet på brøndene i Mikroteststrimmel forudsat. PPAR indeholdt i den nukleare ekstrakt specielt binder sig til PPRE. Den primære PPAR-γ antistof genkender en vurderbare epitop på PPAR-γ protein ved DNA-binding og derefter et sekundært antistof konjugeret til peberrodsperoxidase (HRP) blev tilsat. Absorbansen blev aflæst ved anvendelse af et spektrofotometer ved 450 nm.

For at kvantificere det DNA-bindende aktivitet af NF-KB p65, 5 ug af det nukleare ekstrakt blev målt under anvendelse af et ELISA-baseret Trans-AM Transcription Factor Assay NF -κB p65 Kit (Active Motif). Brøndene i ELISA kits blev immobiliseret med et oligonukleotid, der indeholdt NF-KB p65 konsensus (5′-GGGACTTTCC-3 ‘). Ifølge producentens anvisninger, 10 ug af det nukleare ekstrakt blev tilsat til hver brønd, og derefter inkuberet med et specifikt primært antistof anvendes til påvisning NF-KB, som genkender en epitop på p65, der er tilgængelig, når NF-KB aktiveres og bundet til dets mål-DNA. Efter inkubation med et HRP-konjugeret sekundært antistof, blev den kolorimetriske reaktion kvantificeret under anvendelse af spektrofotometri ved 450 nm. Salg

proteinekstraktion og Western blot-analyse

Celler blev vasket med iskold PBS og skrabet i lyseringsbuffer (50 mM Tris ved pH 7,4, 1% natriumdodecylsulfat (SDS), 1% Nonidet P-40, 0,5% Na-deoxycholat, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA og 50 mM NaF) indeholdende en proteasehæmmer cocktail ( Komplet, Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) for at forberede helcellelysater. At indsamle de nukleare og cytoplasmiske ekstrakter blev cellerne høstet under anvendelse af NE-PER cytoplasmatisk og nukleært protein ekstraktion kit (Pierce Biotechnology) ifølge producentens anvisninger. Proteinkoncentrationer af supernatanten blev bestemt med et Bradford Protein Assay Reagent Kit (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Proteiner blev elektroforeret på 4% ~12% SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE), og overført til polyvinylidendifluorid-membraner i en våd-transfer-apparat. Membraner blev blokeret med 5% fedtfri mælk i TBS-Tween (TBS-T) i 1 time og derefter inkuberet med et specifikt primært antistof natten over ved 4 ° C. Membraner blev vasket tre gange med TBS-T og inkuberet med HRP-konjugeret sekundære antistoffer i 1 time, og blots blev fremkaldt med forøget kemiluminescens reagenser (PerkinElmer Life Sciences, Waltham, MA, USA) og eksponeret for røntgenfilm. Relative intensiteter blev målt for at kvantificere proteinniveauer med Image-Pro Plus software (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA). Alle blots blev kvantificeret og normaliseret mod en intern kontrol til at justere for mængden af ​​proteiner indlæst.

RNA ekstraktion og real-time polymerasekædereaktion (PCR) analyse

Samlet RNA fra cellerne blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen). Koncentrationer af RNA blev bestemt og kvantificeret ved måling af absorbansen ved 260 og 280 nm på et spektrofotometer. Komplementære (c) DNA blev syntetiseret fra totalt RNA under anvendelse af et cDNA-syntese kit (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA). A real-time PCR-analyse blev udført under anvendelse af ABI 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) med Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Foster City, CA, USA) for at bestemme hver mRNA udtryk. Primere til CD36, CD163, PPAR-γ, MMP-9, vævsinhibitor af metalloproteinase (TIMP) -1, VEGF, cyclooxygenase (COX) -2, makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF), og β-actin er opført i tabel 1. Reaktioner blev udført i et samlet volumen på 25 pi indeholdende 1 × Maxima SYBR Green qPCR Master Mix, 400 nM af hver primer, og 100 ng cDNA. Cykliseringsbetingelserne var som følger: 50 ° C i 2 minutter og 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. mRNA udtryk blev kvantificeret i to eksemplarer. Data blev beregnet af ligning 2

-ΔΔCT og præsenteres som multipla af forandringer i genekspression normaliseret til p-actin.

enzymmaerket assay (ELISA)

Niveauer af tumornekrosefaktor (TNF) -α, IL-1β og IL-6, transformerende vækstfaktor (TGF) -β, monocyt- kemoattraktant protein (MCP) -1, og IL-8 blev målt ved anvendelse af ELISA-kits (eBioscience San Diego, CA, USA). Overfladerne af mikroplader overtrukket med et MCP-1 eller IL-8 humant monoklonalt antistof. Prostaglandin (PG) E2-koncentrationer blev analyseret ved en kompetitiv sandwich-ELISA-kit (R 0,05 blev betragtet som signifikant forskellig

Resultater

Angivelse af overflademarkører og cytokiner niveauer i CM fra PMA-behandlede THP-1 makrofager

For at bestemme om TAM’er-lignende M2-type makrofager held blev produceret, THP-1-celler blev co-behandlet med PMA og Th2-cytokiner (IL-4 og IL-13). Resultatet viste, at sammenlignet med PMA-behandlede kun og M1-polariserede THP-1 makrofager, M2-type makrofager signifikante højere mRNA udtryk for M2 makrofagmarkører CD36 og CD163 (figur 1). Eftersom M2-type makrofager producerer relativt lavere niveauer af TNF-α, IL-1β og IL-6 og højere niveauer af TGF-β i forhold til M1-typen makrofager. Niveauerne af disse cytokiner i CM kan anvendes til at evaluere polarisering af THP-1 makrofag. Vi fandt, at CM fra PMA og M2-grupper havde signifikant lavere TNF-α, IL-1β og IL-6 niveauer end M1-gruppen. Derudover cm fra M2-grupper havde signifikant højere TGF-p-niveauer end i PMA og M1-grupper (figur 2).

mRNA-ekspression blev analyseret ved en real-time PCR. Multipla af mRNA ændringer blev kvantificeret ved den sammenlignende CT metode. Alle data præsenteres som gennemsnit ± SD,

n

= 6. Midler med forskellige bogstaver signifikant forskellig (

s

0,05).

CM fra PMA-behandlede THP-1 makrofager og M2-polariseret THP-1 makrofager begge havde signifikant lavere niveauer af tumornekrosefaktor (TNF) -α (A), interleukin (IL) -1β (B), og IL-6 (C) og et højere niveau af transformerende vækstfaktor (TGF) -β (D) sammenlignet med dem for M1-polariserede THP-1 makrofager. TNF-α, IL-1β, IL-6, og TGF-β blev målt ved ELISA’er. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD,

n

= 6. Midler med forskellige bogstaver signifikant forskellig (

s

0,05)

PC-3. prostata levedygtighed cancercelle

virkningerne af EPA og DHA på PC-3 cellelevedygtigheden blev bestemt ved en Alamar blue assay og resultaterne er vist i figur 3. levedygtighed PC-3-celler blev signifikant reduceret ved en 24-h udsættelse for EPA og DHA i en koncentrationsafhængig måde over 150 og 100 uM.

PC-3-celler blev inkuberet med EPA (a) og DHA (B) i 24 timer efterfulgt af en Alamar blue assay udført i fire eksemplarer. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD,

n

= 6. * Signifikant forskellig fra kontrolgruppen (

s

0,05)

migrerende og invasiv. evner i PC-3 prostatacancerceller samdyrket med M2-typen makrofager

For at afgøre, om EPA og DHA er involveret i M2-typen makrofager-induceret prostata kræftceller migration og invasion, PC-3-celler blev dyrket sammen med M2 -type makrofager i en berøringsfri apparat. Migrerende og invasive evner blev opreguleret i PC-3 celler dyrket sammen med M2-typen makrofager. EPA og DHA både væsentligt reduceret de vandrende og invasive evner PC-3 celler dyrket sammen med M2-typen makrofager i dosisafhængige mode. Ca. 80% af reduktionen i de migrerende og invasive celler blev vendt i overværelse af GW9662, støtte PPAR-γ-aktivering er involveret i at hæmme de vandrende og invasive evner PC-3 celler dyrket sammen med M2-typen makrofager (figur 4, 5 ).

PC-3-celler blev podet i de øvre kamre og dyrket sammen med M2-polariserede THP-1 makrofager i nærvær af 50 uM EPA, DHA, eller GW9662 (10 uM) i 24 timer. Invaderede celler blev fikseret i 4% paraformaldehyd og farvet med 0,5% krystalviolet. Membraner blev vasket, og farvestoffet blev elueret med en violet ekstraktionsmiddel (50% ethanol, 0,1% eddikesyre, og 49,9% ddH

2O). Absorbansen blev målt ved 595 nm under anvendelse af en mikrotiterpladelæser. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD,

n

= 3. Midler med forskellige bogstaver signifikant forskellig (

s

0,05).

For invasionen assay, PC-3-celler blev podet i de øvre kamre overtrukket med Matrigel og dyrket sammen med M2-polariserede THP-1 makrofager i nærvær af 50 uM EPA, DHA, eller GW9662 (10 uM) i 24 timer. Invaderede celler blev fikseret i 4% paraformaldehyd og farvet med 0,5% krystalviolet. Membraner blev vasket, og farvestoffet blev elueret med en violet ekstraktionsmiddel (50% ethanol, 0,1% eddikesyre, og 49,9% ddH

2O). Absorbansen blev målt ved 595 nm under anvendelse af en mikrotiterpladelæser. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD,

n

= 3. Midler med forskellige bogstaver signifikant forskellig (

s

0,05).

EPA og DHA opreguleres DNA-bindende aktivitet og protein og mRNA udtryk for PPAR-γ i PC-3-celler inkuberet med CM fra M2-type makrofager

EPA og DHA begge er ligander af PPAR-γ. For at bestemme om EPA og DHA reduceret vandrende og invasive evner PC-3 celler gennem aktivering PPAR-γ, vi analyserede PPAR-γ DNA-bindende aktivitet, mRNA og protein udtryk i PC-3 celler dyrket med CM fra M2-typen makrofager . PPAR-γ-DNA-bindingsaktivitet blev undertrykt i PC-3-celler inkuberet med CM fra M2-type makrofager. Behandling med EPA og DHA både signifikant forøget DNA-bindende aktivitet, og mRNA og protein udtryk for PPAR-γ i PC-3-celler sammenlignet med PC-3-celler sammen med CM fra M2-type makrofager. GW9662 delvist blokeret PPAR-γ-aktivering i PC-3-celler (figur 6).

PPAR-γ-bindende aktivitet blev analyseret ved en transkriptionsfaktor ELISA (A). PPAR-γ proteinniveauer blev bestemt ved Western blotting (B). Lig protein loading blev bekræftet under anvendelse β-actin. mRNA-ekspression af PPAR-γ blev analyseret ved en real-time PCR (C). mRNA ændringer blev kvantificeret ved den sammenlignende CT metode. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD,

n

= 3, og betyder med forskellige bogstaver signifikant forskellig (

s

0,05).

EPA og DHA reduceret NF-KB-aktivering i PC-3-celler inkuberet med CM fra M2-type makrofager Salg

PPAR-γ-aktivering kan nedsætte DNA-bindingsaktivitet af NF-KB p65. Som vist i figur 7A, blev NF-KB p65 DNA-bindingsaktivitet opreguleres i fravær af EPA /DHA, og faldt med administration af EPA /DHA. Behandling med EPA og DHA begge faldt betydeligt nukleare NF-KB p65-proteinekspression og øget cytosolisk kBa proteinekspression i dosisafhængige måder. Administration af GW9662 vendes betydeligt ØPA eller DHA-medieret inaktivering af NF-KB i PC-3-celler dyrket med CM fra M2-type makrofager (figur 7B, C).

NF-KB-DNA-bindende aktivitet blev analyseret ved en transkriptionsfaktor ELISA (a). Protein-niveauer i kBa underenhed (B) og NF-KB p65 (C) blev bestemt ved Western blotting. Lige belastning af proteiner illustreres af tubulin bands i den cytosoliske fraktion. Histon H1 udtryk er vist som en intern kontrol med nukleare ekstrakter. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD,

n

= 3, og betyder med forskellige bogstaver signifikant forskellig (

s

0,05).

Angiogenic- relaterede faktor udtryk i PC-3 celler dyrket med CM fra M2-typen makrofager

TAM’er kan forstærke den angiogene potentiale af kræftceller. Vi analyserede angiogene-relaterede faktorer i PC-3-celler inkuberet med CM fra M2-type makrofager. TAM’er induktion af mRNA udtryk for MMP-9, VEGF, COX-2, og højere niveauer af PGE2 og IL-8 blev fundet i PC-3-celler dyrket med CM fra M2-type makrofager (figur 8). Disse angiogene-relaterede faktorer blev nedreguleret i tilstedeværelsen af ​​EPA /DHA. Behandling med EPA /DHA effektivt opreguleres mRNA-ekspression af TIMP-1. Regulering af angiogene-relaterede faktorer udtryk af EPA /DHA i PC-3 celler dyrket med CM fra M2-typen makrofager blev afskaffet ved samtidig behandling med GW9662.

mRNA udtryk blev analyseret af en real-time PCR. mRNA ændringer blev kvantificeret ved den sammenlignende CT metode. Niveauer af PGE2 og IL-8 blev analyseret ved ELISA’er. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD,

n

= 6, og betyder med forskellige bogstaver signifikant forskellig (

s

0,05).

Gen-ekspression af M-CSF og MCP-1 niveauet i PC-3 celler dyrket med CM fra M2-typen makrofager

Vækstfaktorer og kemokiner er vigtige for regulering af makrofag rekruttering til tumor sites. Vores resultater viste, at genekspression af M-CSF og koncentrationer af MCP-1 i PC-3-celler dyrket med CM fra M2-type makrofager blev opreguleret (Figur 9). Genekspressionen af ​​M-CSF og produktion af MCP-1 blev reduceret med EPA /DHA administration. Men behandling med GW9662 kunne vende EPA /DHA-medieret nedregulering af M-CSF og MCP-1.

MCP-1-niveau blev analyseret ved en ELISA. M-CSF blev analyseret ved en real-time PCR. mRNA ændringer blev kvantificeret ved den sammenlignende CT metode. Data er præsenteret som gennemsnit ± SD,

n

= 6, og betyder med forskellige bogstaver signifikant forskellig (

s

0,05)

Diskussion

Tidligere undersøgelser rapporteret, at N-3 PUFA’er inhiberer prostatakræft cellevækst ved at inducere apoptose. I denne undersøgelse undersøgte vi de potentielle mekanismer af n-3 PUFA’er i modulering af PC-3-celler dyrket med CM fra M2-type makrofager. Vores undersøgelse er den første til at rapportere, at i forhold til PC-3 celler dyrket med CM fra M2-typen makrofager, administration af EPA /DHA reduceret vandrende og invasive evner ved at forbedre PPAR-γ DNA-bindende aktivitet, nedregulere aktiveringen af ​​NF-KB, og undertrykker ekspressionen af ​​NF-KB-målrettede gener. Salg

Makrofager har flere undertyper og kan polariseres ved distinkte stimuli. M1-typen makrofager har anti-tumor egenskaber og er kendetegnet ved produktion højt niveau af TNF-α, IL-1β og IL-6. M2-type makrofager viser tumor-vækstfremmende egenskaber og udtrykke højere immunosuppressive cytokiner, såsom TGF-β. Disse cytokiner markører blev anvendt til at definere M1- og M2-type makrofager polarisering. Vi observerede, PMA-, IL-4- og IL-13-behandlede THP-1-celler viste M2-type makrofag overflademarkører af CD36 og CD163 og M2-type makrofager cytokinprofiler (lavere koncentrationer af TNF-α, IL-1β og IL-6, og en højere koncentration af TGF-β). Inden tumormikromiljøet, TAM’er udviser primært en M2-type makrofager funktionel profil, og denne foretrukne polarisering skyldes stimulation af Th2-cytokiner [24], [25]. TH2-afledte cytokiner, IL-4 og IL-13, inducerer M2 polarisering af TAM’er fører til tumor fremme og udvikling [26], [27]. Makrofag rekruttering og differentiering af M2-type makrofager reguleres af vækstfaktorer, såsom M-CSF og chemokiner inklusiv MCP-1 [28]. Overekspression af M-CSF og MCP-1 i flere typer af kræft, herunder prostatakræft, øger makrofag rekruttering og tumor progression, og accelererer hastigheden af ​​metastaser [29] – [32]. M-CSF-binding til kolonistimulerende faktor-1-receptoren kan stimulere makrofag differentiering og forudsige caner metastase. En langsommere hastighed for tumorprogression og inhibering af metastase blev fundet i brystkræft efter genetisk ablation af M-CSF [33]. Blev også reduktioner i vækst og makrofag rekruttering findes i PC-3-celler efter MCP-1-antistof neutralisering [30]. Resultaterne af denne undersøgelse viste, at EPA /DHA kan nedsætte evnen af ​​makrofag rekruttering i PC-3-celler dyrket med CM fra M2-type makrofager ved nedregulering M-CSF og MCP-1.

En tidligere undersøgelse viste, at M2-polariserede THP-1 makrofager kan inducere invasion og angiogenese af humane basal carcinomaceller [23]. Vi fandt også, TAM-lignende M2-type makrofager forhøjede migration og invasion af PC-3 prostatacancerceller. Endvidere administration af EPA /DHA undertrykt de migrerende og invasive egenskaber af PC-3-celler induceret af TAM-lignende M2-type makrofager, hvorimod -80% af denne effekt blev blokeret ved co-behandling med GW9662, en PPAR-γ-specifik antagonist. Tyder på, at den endogene PPAR-γ-ligand, 15-deoxy-Δ

12,14-prostaglandin J

2 (15d-PGJ

2) undertrykte proliferation af og androgen signalering ved prostatacancerceller [34] , [35]. Også behandling med 15d-PGJ

2 og den syntetiske ligand, pioglitazon, blev rapporteret til at hæmme proliferation og invasion evne af humane colon cancerceller [36]. PPAR-γ udtrykkes i den humane prostata epitel. Selvom prostatacarcinomer viste sig at overudtrykke PPAR-γ [13], aktivering af PPAR-γ blev vist at hæmme væksten af ​​prostatacancerceller og kræft progression [37].

transkriptionsaktivitet af NF-KB er hovedsageligt moduleret ved phosphorylering og nuklear translokation af NF-KB-p65 [38] – [40]. Unormal NF-KB-aktivering blev identificeret i cancerceller, der fremmes invasion og migration ved at øge udtryk for MMP’er og vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) i prostatacancer PC-3-celler [41]. Tidligere undersøgelser indikerede, at PPAR-γ konkurrerer med NF-KB til at binde co-aktivatorer af steroidreceptoren co-aktivator (SRC) -1 eller cAMP-responselement-binding (CREB) protein, som inhiberer NF-KB-medieret genekspression [ ,,,0],42]. Ligeledes kan PPAR-γ-aktivering inducerer syntesen af ​​kBa, der direkte binder til p65 indeholdende NF-KB dimerer i cytoplasmaet og inhiberer den nukleare translokation af NF-KB [43], [44]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at EPA og DHA øget cytosolisk kBa ekspression i PC-3-celler dyrket i CM. Disse data tyder på, at EPA og DHA modulere vandrende og invasive egenskaber af PC-3-celler induceret af M2-type makrofager delvist ved at øge PPAR-γ-DNA-bindingsaktivitet og mindske NF-KB p65 transkriptionel aktivitet. For nylig blev n-3 PUFA’er rapporteret at aktivere G-protein-koblede receptorer (GPR) 120 og inhibere NF-KB-aktivitet, som kan følgelig svække proinflammatoriske cytokiner sekretion og modulere fedtvæv inflammation [45]. Vi fandt ikke den hæmmende virkning af NF-kB af n-3 PUFA via GPR120 fordi den gavnlige effekt af n-3 PUFA næsten blev afskaffet ved co-behandling med GW9662. Selvom interaktionen mellem n-3PUFA og GPR120 ikke kan udelukkes, kan vores undersøgelse bevise, mindst, at aktivering af PPAR-γ er en af ​​de mekanismer, der er ansvarlige for reduktion vandrende og invasive evner prostatacancerceller induceret af TAM’er.

Nedregulering af NF-KB downstream mål som MMP-9, COX-2, VEGF, og IL-8 spiller en vigtig rolle i inhibering af cancercelle migration, invasion, og metastase [46], [47]. MMP-9 er en af ​​de mest afgørende MMP’er, som nedbryder den ekstracellulære matrix (ECM) og yderligere stimulere andre vækstfaktorer kan lette migration og invasion af cancerceller [48]. Den vigtigste naturlige inhibitor af MMP-9 er TIMP-1. Det C-terminale domæne af TIMP-1 binder til hæmopexin-lignende domæne af MMP-9 [49].