PLoS ONE: Mellemøsten Infrarød stråling inducerer G2 /M cellecyklusstop i A549 Lung Cancer Cells

Abstrakt

Der var studier, der undersøger effekten af ​​bredbånd infrarød stråling (IR) på kræft celle, mens de påvirkninger af midt-infrarød stråling (MIR) er stadig ukendt. I denne undersøgelse blev en MIR emitter med emissionsbølgelængde band i 3-5 um regionen udviklet til at bestråle A549 lunge adenokarcinomceller. Det blev konstateret, at MIR eksponering inhiberede celleproliferation og inducerede morfologiske ændringer ved at ændre den cellulære fordeling af cytoskeletale komponenter. Brug af kvantitativ PCR, fandt vi, at MIR fremmet ekspressionsniveauerne for ATM (ataxia telangiectasia muteret), ATR (ataxi-telangiectasia og Rad3-relaterede og Rad3-relateret), TP53 (tumor protein p53), p21 (CDKN1A, cyclin-afhængig kinase inhibitor 1A) og GADD45 (vækststandsning og DNA-beskadigelse inducerbar), men faldt ekspressionsniveauerne af cyclin B kodende gener, CCNB1 og CCNB2 samt CDK1 (cyclin-afhængig kinase 1). Reduktionen af ​​protein ekspressionsniveauer af Cdc25C, cyclin B1 og phosphoryleringen af ​​CDK1 ved Thr-161 helt tyder G

2 /M arrest forekom i A549-celler ved MIR. DNA-reparation foci dannelsen af ​​DNA dobbelt-strenget pauser (DSB) markør γ-H2AX og sensor 53BP1 blev induceret af MIR behandling, det indebærer MIR inducerede G

2 /M cellecyklusstop resulterede fra DSB. Denne undersøgelse illustrerer en potentiel rolle for anvendelse af MIR i lungekræft terapi ved at initiere DSB og blokering cellecyklusprogression

Henvisning:. Chang HY, Shih MH, Huang HC, Tsai SR, Juan HF, Lee SC ( 2013) Mellemøsten Infrarød stråling inducerer G

2 /M cellecyklusstop i A549 Lung Cancer Cells. PLoS ONE 8 (1): e54117. doi: 10,1371 /journal.pone.0054117

Redaktør: Jasti Rao, University of Illinois College of Medicine, USA

Modtaget: 9. september 2012; Accepteret: December 6, 2012; Udgivet: 15 Jan 2013

Copyright: © 2013 Chang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Science Rådet, Taiwan (NSC 100-2120-M-002 til 014, NSC 99-2621-B-002-005-MY3, NSC 99-2621-B-010-001-MY3) og National Taiwan University Cutting-Edge Steering Research Project (10R70602C3 og 101R4000). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Neoplasma er den største dødsårsag på verdensplan, og lungekræft er den førende årsag til kræft død [1]. Da rygning vane falder, er forekomsten af ​​lungekræft forværret i mange lande i overensstemmelse hermed [2]. Bortset rygning, andre faktorer såsom asbest, radon eller tungmetaller eksponeringer også bidrage til lungekræft [3]. Statistik data fra en 2008 Internationale agentur for kræftforskning (IARC) risikovurdering angiver, at lungekræft dræber omkring 1,4 millioner mennesker om året på verdensplan [4]. På grund af den høje forekomst og dødelighed af lungecancer skal det tilknyttede terapi forløber at løse disse problemer.

Den elektromagnetiske stråling fra solstråling kan opdeles i flere regioner, herunder γ-ray, røntgen, ultraviolet (UV), synligt lys, infrarød (IR) stråling, mikroovn og radiobølger. Blandt de solstråling, kan IR-lys med bølgelængder der spænder fra 0,76 til 1000 um opdeles i tre regioner, nær-infrarødt (NIR, 0,76-1,5 um), middle-infrarød (MIR, 1,5-5,6 um) og langtrækkende infrarød ( FIR, 5,6 til 1000 um). Anvendelser af IR er blevet bredt etableret i daglige brug og kliniske formål, herunder kutan mikrocirkulationen, sårheling, gas sensorer, og temperaturmåling fjernbetjening [5].

Tidligere undersøgelser har indikeret, at NIR udløste et tilbageskridt mitokondrie signalering respons resulterende ROS-medieret matrixmetalloproteinase-1 (MMP-1) produktion via mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK’er) pathway [6]. Den viste også, at NIR beskyttet menneskelig dermal fibroblast fra UV-induceret cytotoksicitet ved at inducere Hsp27 som forhindrer apoptosome samling, en indledende begivenhed af apoptose [7], [8].

In vivo Salg undersøgelser viste, at NIR forøgede det angiogene inducer vaskulær endotelvækstfaktor og faldt den angiogene inhibitor thrombospondin-2, indledning dermal angiogenese i menneskehud [9]. Endvidere eksponering af FIR fremmes angiogenese i humane mikrovaskulære endotelceller sammen med aktiveringen af ​​p38 og ekstracellulært signal kinase signalering [10], forbedret blodcirkulation i huden [11], [12] og udøvede antiinflammatorisk aktivitet i vaskulært endotel [13]. Det er også rapporteret, at FIR hæmmede celledeling ved at forbedre ekspression af cyklisk AMP-afhængig transskription faktor (ATF) 3 i kræftceller, hvis basale udtryk niveau af varme shock protein (HSP) 70A var lave [14], [15].

virkningerne af MIR på kræftceller dog fortsat ukendt. Denne undersøgelse havde til formål at undersøge virkningerne af MIR med bølgelængde band i 3-5 um regimer på de meget spredt kræftceller. Til dette formål har vi udviklet en MIR emitter og hæmmet MIR bølgelængde ved 3 til 5 um. Da den molekylære C-H, kan N-H og O-H-bindinger exciteres at generere stretching vibrationer med 3-5 um infrarød, forventes det, at den vigtige biokemiske reaktion vil blive påvirket af bestråling af infrarøde med bølgelængde i dette interval [16]. Vi viste, at MIR reducerede cellelevedygtigheden, forårsagede betydelige ændringer i cytoskelet arrangement, og induceret G

2 /M cellecyklusstop, som kan bidrage med induktion af dobbelt-tråde pauser (DSB) i DNA langs ATM /ATR-p53 -p21 akse.

Resultater

bølgelængden af ​​MIR blev Constrained på 3-5 um og Temperatur Kulturministeriet Medium var Konsekvent ved 37 ° C

det brede bånd sortlegeme kilde blev fremstillet til at give bredt bånd MIR og sat i en metal kammer for at undgå forstyrrelser fra miljøet (figur 1). Med den stigende opvarmning temperatur blev emissioner af siliciumsubstratet forhøjet tilsvarende. Strålingen intensiteten var sat til 3 mW /cm

2 ved at justere opvarmning temperatur og måle størrelsen af ​​THORLAB PM100D energimåler. At fjerne varmen virkninger af MIR, vi indstille recycle køligere maskinen ved 28 ° C for at afkøle luften i kammeret, hvor billede MIR kilden således holde temperaturen af ​​dyrkningsmedium ved 37 ° C. Arrangementet af apparatet er vist i figur 1B.

(A) sidebillede af brede bånd sortlegeme kilde. (B) Skematisk diagram, der viser opsætningen for MIR bestråling eksperimentet. Cellerne blev udsået på plader med 12 brønde og dyrket i en inkubator med 100% fugtighed, ved 37 ° C og med 5% CO

2.

The Cell Proliferation af A549 celler uændret i MIR Exposed medium

for at skelne, om virkningerne af MIR forekom direkte på dyrkede celler eller indirekte gennem at ændre cellemediet, blev dyrkningsmediet udsat for MIR i 48 timer før dets tilsætning til cellekulturen. Efter A549-celler (2 x 10

4 celler per brønd) blev podet på en plade med 12 brønde, vi substitueret dyrkningsmediet med MIR-eksponerede eller ueksponerede medium i yderligere 48 timer og derefter bestemt cellelevedygtighed ved MTT-assayet. Vi observerede, celleproliferation af A549-celler ikke blev ændret signifikant under MIR-eksponerede medium sammenlignet med ueksponerede medium (fig S1). Herfra, vi anvendte en 48-timers periode med eksponering til cellerne for alle eksperimenter, medmindre andet er angivet.

MIR Hæmmet Cell Proliferation og Ændret morfologi A549 Cells

For at undersøge effekten af MIR på cancerceller, blev lungeadenocarcinom celler A549 anvendes til at vurdere cytotoksiciteten af ​​MIR og de normale lungefibroblaster MRC-5 blev testet til sammenligning. Celler (2 x 10

4) blev udpladet i 12-brønds dyrkningsplader natten over forud for MIR eksponering. Cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-assay og trypan blåt baseret celletælling efter MIR eksponering. Resultaterne viste, at proliferation af A549-celler blev signifikant undertrykt af MIR eksponering i 48 timer (figur 2A), mens væksten og morfologien af ​​MRC-5-celler ikke var påvirket af MIR behandling (fig S2A, S2B). Interessant nok afslørede vi morfologiske ændringer af A549 celler efter MIR eksponering. Vi observerede, MIR-eksponerede A549-celler var mere afrundet form, udvidet i størrelse, og dannede en radial forklæde under fase-kontrast mikroskopi (figur 2B). Resultaterne betyder, at MIR kunne regulere cytoskelettet dynamik der bestemmer cellemorfologien.

(A) celletal blev målt ved 0, 24 og 48 timer efter MIR eksponering ved hjælp af trypanblå og et hæmocytometer. De gennemsnitlige celleantal kontrolmetoder (ueksponeret) og MIR eksponering behandlinger blev udtrykt som middelværdier ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. **

P

0,01. (B) Cell billeder blev observeret af fase-kontrast mikroskopi efter 48 timer MIR eksponering. Pile angiver de radiale forklæder af forstørrede celler. Scale søjle repræsenterer 50 um.

MIR Eksponering Aktiveret reorganisering af Actin Filament, Vinculin og mikrotubulus

cytoskelettet spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​celle form [17], [18] , og begge actinfilamenter og mikrotubuli er kendt for at påvirke dannelsen og distribution af celle fokale sammenvoksninger [17], som bestemmer celle morfologi og motilitet. For at skelne virkningerne af MIR på cytoskelet, udførte vi immunfluorescensfarvning at undersøge, om de to vigtige komponenter i cytoskelettet, actinfilamenter og mikrotubuli, såvel som omdrejningspunkt adhæsionsmolekyle vinculin involveret i denne morfologiske ændring. Resultaterne viste, at MIR inducerede et signifikant fald i F-actin indeholdende stress fibre som bestemt ved farvning med rhodamin-mærket phalloidin (figur 3). Endvidere actinfilamenter udviste en tæt meshwork af upolariseret arrangement og vinculin blev aggregeret rundt om cellen periferien i MIR-eksponerede celler (figur 3), hvilket betyder, at MIR kan inhibere cellemigrering ved at regulere reorganisering af actinfilamenter og distribution af vinculin [ ,,,0],19]. På den anden side, blev mikrotubuli fordelt på perinukleære cytoplasmatiske regioner efter MIR behandling (figur 4). Denne specifikke fordeling af uregelmæssige mikrotubuli fragmenter tyder på, at MIR kan forårsage G

2 /M cellecyklusstop som tidligere demonstreret [20], [21].

Celler blev podet på dækglas i 12-brønds plader , udsat for MIR i 48 timer, der er fastsat for farvning og visualiseret ved fluorescensmikroskopi. Actinfilamenter blev tagget med rhodamin-mærket phalloidin (rød), blev vinculin mærket med muse-anti-vinculin antistof og den tilsvarende FITC- konjugeret sekundært anti-mus IgG antistof (grøn), og kerner blev farvet med DAPI (blå). Scale bar repræsenterer 10 um. Pile viser positionen af ​​vinculin.

Celler blev podet på dækglas i 12-brønds plader, udsat for MIR i 48 timer, fikseret til farvning og visualiseret ved fluorescensmikroskopi. Mikrotubuli blev mærket med α-tubulin antistof og den tilsvarende FITC-konjugeret sekundært antistof (grøn), og kerner blev mærket med DAPI (blå). Scale søjle repræsenterer 10 um.

MIR Eksponering Reguleret mRNA Expression niveau af G

2 /M regulerede gener i A549 Celler

Da fordelingen af ​​cytoskelettet indebærer en mulig rolle af MIR i regulering cellecyklusprogression, er det kritisk at undersøge ekspressionen af ​​gener involveret i G

2-M overgang blev yderligere udvalgt skal valideres. G

2 /M cellecyklus checkpoint reagerer på DNA-skader og involverer aktivering af ataksi-telangiectasia muteret (ATM) og ataksi-telangiectasia og Rad3-relaterede (ATR) proteiner [22]. Både ATM og ATR aktivere p53 ved phosphorylering af Ser15 som respons på DNA-skade, hvilket øger transkriptionen af ​​vækststandsning og DNA-skader inducerbart gen (GADD45) og p21, som er nødvendige til inhibering ekspression af de centrale regulatorer af G

2 /M overgang, cyklin-afhængige kinase 1 (CDK1) og cyclin B [23], [24], [25], [26]. Ekspressionen af ​​gener involveret i at inducere G

2 /M arrest blev forøget i MIR-behandlede A549-celler, herunder ATM, ATR, p53, GADD45A, GADD45B, og p21 (figur 5A). I modsætning hertil blev mRNA ekspressionsniveauer af CDK1, CCNB1 og CCNB2 faldt efter MIR eksponering (figur 5A). Resultaterne viser, at MIR eksponering aktiverer udtrykkene for ATM, ATR, p53, og p21-gener som respons på DNA-skade og regulerer generne til at styre G

2 /M cellecyklusprogression. Salg

Celler blev eksponeret til MIR i 48 timer og høstes til RNA og protein ekstraktion. (A) Gen-ekspression af gener involveret i reguleringen af ​​G

2 /M overgang (x-aksen). Y-aksen viser de relative transcript mængder, der fremkommer ved anvendelse af ΔΔCt metoden med GAPDH som reference-genet amplificeret fra hver prøve. Dataene er præsenteret som gennemsnit ± S.D. (

n

= 3). *

P

0,05, **

P

0,001. (B) Protein ekspressionsniveauerne blev undersøgt ved Western blot med actin som intern kontrol. Alle forsøg blev gentaget tre gange. (C) Flowcytometrisk analyse af DNA-indhold. Celler blev udsat for MIR i 48 timer. Celler fra seks uafhængige forsøg blev opsamlet til analyse cellecyklusfordeling. (D) Procentdelen af ​​celler i hver fase blev opnået ved multicycle analyse.

MIR Eksponering afskaffet Angivelse af Cdc25C og cyclin B1, og faldt Phosphorylering af CDK1

Cellen cyklus progression fra G

2 til M-fasen er reguleret ved aktivering af CDK1, hvis aktivitet er en samordning med cyklin B [27], [28]. Aktiveringen af ​​CDK1 /cyclin B-kompleks opretholdes gennem phosphorylering ved Thr161 og dephosphorylering ved Thr14 og Tyr15 af CDK1 [27], [28]. Dephosphorylering af Thr14 og Tyr15 rester i CDK1 katalyseres af phosphatase Cdc25C. Den er tænkt som et hastighedsbegrænsende trin for G

2 træder i mitose [27], [29]. I betragtning af den rolle, som CDK1 /cyclin B-kompleks og Cdc25C i regulering G

2 til M faseovergang, vi vurderet, om MIR eksponering ændret protein ekspression af CDK1, cyclin B1, og Cdc25C, samt phosphorylering af CDK1. Resultaterne viste, at phosphorylering af CDK1 protein ved Thr161 og niveauerne af cyclin B1 og Cdc25C alle blev reduceret i celler behandlet med MIR (figur 5B). Det indikerer, at MIR eksponering inducerede en typisk G

2 /M cellecyklusstop i A549 celler ved at regulere cyklin B1 og Cdc25C udtryk, og CDK1 fosforylering.

MIR Eksponering medført cellecyklusstop på G

2 /M fase

Vi næste undersøgt, om cellecyklus distribution af A549 blev ramt af MIR bestråling. For at opnå den DNA-indhold, udførte vi flowcytometri for at analysere PI-mærkede celler. Resultaterne viste, at cellerne i G

2 /M befolkning blev forøget under MIR eksponering. Koordineret, G

2 /M regulatorer blev begge aktiveres i deres transskriptionelle, translationelle og post-translationelle niveau, hvilket fører til akkumulering af celler i G

2 /M-fasen.

MIR eksponeringsudløst colokalisering af 53BP1 og γ-H2AX Nuclear Foci i Response to reaktive oxygenarter (ROS) medieret DNA Damage

Siden MIR aktiveret ATM /ATR-p53-p21-aksen, som er den DNA beskadigelse checkpoint pathway, er det afgørende at undersøge, om MIR forårsagede DNA-skader i A549-celler. Tidligere undersøgelser har vist, at tumor suppressor p53 protein (53BP1) og γ-H2AX deltage i ATM-afhængige DNA-beskadigelse-signalvejen og danner nukleare foci som reaktion på ioniserende stråling forårsaget DNA-beskadigelse [30], [31]. For at undersøge dette, blev A549-celler fikseret med acetone og farvet for 53BP1 og γ-H2AX efter MIR eksponering. Vi udstillede at 53BP1 (figur S3A) og γ-H2AX (figur S3B) dispersedly blev lokaliseret i kerner af ueksponerede celler, men dannede talrige fornemme subnuclear foci som reaktion på MIR. Vi påviste også, at de 53BP1 og γ-H2AX foci blev colocalized i nucei af MIR eksponerede celler. Dannelsen og co-lokalisering af 53BP1 /γ-H2AX foci blev formindsket efter forbehandling eller samtidig behandling af 10 mM ROS scavenger NAC (figur 6). Vi kan postulere, at MIR inducerede G

2 /M cellecyklusstandsning kan skyldes ROS-medieret DNA-beskadigelse af hvor skaden markører 53BP1 og y-H2AX foci blev observeret i denne undersøgelse.

Celler blev podet på den dækglas i 12-brønds plade, eksponering af MIR i 48 timer i nærvær eller fravær af 10 mM N-acetyl-cystein (NAC). Cellerne blev behandlet med NAC i 1 time forud for MIR eksponering (NAC 1 H) eller cotreated hele eksponering i 48 timer (NAC). Celler blev fikseret i farvning og visualiseret ved fluorescensmikroskopi. 53BP1 blev mærket med kanin-anti-53BP1 antistof og svarede FITC-konjugeret anti-kanin IgG-antistof (grøn), γ-H2AX blev mærket med muse-anti-γ-H2AX antistof efter korresponderer PE-konjugeret anti-muse-IgG-antistof (rød), og kerner blev mærket med DAPI (blå). Scale søjle repræsenterer 10 um.

Diskussion

Fordi de molekylære ændringer, der er involveret i regulering af cellecyklus progression er ledsaget af en undladelse af at anholde spredning i kræftceller, hæmning af celleproliferation ved at gribe med cellecyklussen er en lovende fremgangsmåde til anticancerterapi. I denne undersøgelse observerede vi, at MIR eksponering kan inhibere proliferation af A549-celler (figur 2A), og også føre til en forstørret radial forklæde og afrundet form cellemorfologi (figur 2B) ved at påvirke arrangementet og fordelingen af ​​actinfilamenter (fig 3), fokal adhæsion (figur 3), og mikrotubuli (figur 4). Den perinukleære fragmenterede fordeling af mikrotubuli er i overensstemmelse med cellemorfologien observeret under G

2 /M cellecyklusstandsning, som blev yderligere valideret ved at analysere cellecyklusfordeling, genekspressionen og protein regulering af regulatorer af G

2 /M kontrolpunkt (figur 5). Ved fremskreden, vi også vist, at MIR kunne inducere dannelsen af ​​og colokalisering 53BP1 og γ-H2AX nuklear foci (figur 6) som respons på DNA-skade, som typisk aktiverer ATM /ATR-p53-p21 pathway resulterende G

2 /M celle cellecyklusstandsnings.

MIR er den del af lyset fra solstråling, som kan forårsage DNA-beskadigelse ved direkte excitation af DNA eller indirekte mekanisme, der involverer excitation af andre cellulære kromoforer [32]. Den direkte excitation proces er forårsaget af kortbølget stråling, såsom UVB (280-315 nm) og UVC (100 til 280 nm) og for det meste fører til generering cyclobutan pyrimidin dimerer og fotoprodukter, som produceres ved absorption af stråling ved DNA [32 ]. På den anden side er den indirekte mekanisme bidrager med reaktive oxygenarter (ROS), som er genereret af endogene fotosensibilisatorer. Den indirekte DNA-skader er forårsaget af længere bølgelængde stråling over 320 nm, såsom UVA (315-400 nm) og nær-synligt lys, hvor DNA absorberer kun svagt [33], [34]. Stråling med længere bølgelængde således absorberes af fotosensibilisatorer til at generere ROS. Efter UVA lysabsorption, endogen fotosensibilisator krydse over til en triplet tilstand og overføre energi til at generere singlet oxygen [35]. Disse UVA bestrålet fotosensibilisatorer omfatter flaviner [36], NADH /NADPH [37], urocansyre [38] og nogle steroler [39]. På grund af den korte halvleg i celler, singlet oxygen er kun til stede efter stråling [40]. Imidlertid kan ROS præsenteres i en længere periode efter eksponering for stråling, eftersom den yderligere ROS kan fremstilles ved indledende arter [41]. Superoxidanionen radikal (

• O

2

-), hydrogenperoxid (H

2O

2), og hydroxylradikal (

• OH) er tilhørt ROS gruppe, som alle kan frembringes ved endogen mekanisme som biprodukter fra normal mitokondriel aktivitet eller exogen stress [42].

Når det exogene stress induceret ROS niveau er dramatisk højere end den celle kan eliminere, oxidativ stress opstår og resultater i oxidative DNA-skader ved DNA protein krydsbinding, base og sukker modifikation, depurinering eller deprimidination [43], [44], [45], [46], [47]. Den oxidative DNA-skader fremkaldt af ROS kan udløse cellecyklus checkpoint respons herunder rekruttering af 53BP1 og γ-H2AX efterfulgt af nedbrydning af Cdc25C for G

2 /M anholdelse, som vi observerede, giver således yderligere tid til DNA-reparation [48], [49]. Desuden NIR har vist sig at generere ROS afledt fra mitokondrier, og cytochrom

c

oxidase er blevet foreslået som en mulig fotoreceptor [6], [50]. Beviserne foreslår, at IR kunne accelerere den oxidative phosphorylering reaktion i mitokondrier ved bestråling fotoreceptorer såsom cytochrom c oxidatse og NADH. Den forbedrede sats i oxidativ fosforylering genererer højere ROS bidrager dermed til indirekte skader i DNA.

I denne undersøgelse fandt vi, at MIR eksponering undertrykte proteiner niveau af Cdc25C og cyklin B1, og hæmmede phosphorylering af CDK1. Nedregulering af Cdc25C ville blokere aktiveringen af ​​CDK1, hvilket resulterer i dissociation af cyclin B1 og forebyggelse af cellecyklusprogression fra G

2 til M-fasen. Desuden udstillede vi, at 53BP1 andγ-H2AX danner talrige subnuclear foci som reaktion på MIR behandling. 53BP1 deltager i ATM-afhængige DNA-skader-signalvejen og danner nukleare foci som reaktion på ioniserende stråling forårsaget DNA-skader [30], [31], mens γ-H2AX letter rekrutteringen af ​​en række skader respons proteiner, såsom BRCA1, MDC1 og RAD51 for DNA reparation [51], [52]. Det er muligt, at MIR eksponering induceret G

2 /M arrest er forårsaget af DNA-beskadigelse, selv om bølgelængden af ​​MIR er tæt på NIR som er svært at forårsage direkte skade på DNA. Her vil vi postulere, at MIR udsættelse kan absorberes af endogene fotosensibilisator dermed opløftende ROS og forårsager oxidative DNA-skader.

Tidligere undersøgelser viste, at hydrogenperoxid induceret G

2 /M cellecyklusstop og påvirket organiseringen af mikrotubuli og actinfilamenter relæ på kapaciteten til reduktion de oxiderede cytoskeleton proteiner eller balance af thiol forstyrrelser [51], [52], [53]. Hydrogenperoxid øget monomere tubulin, men faldt det polymeriserede tubulin tyder hydrogenperoxid forårsaget depolymerisering af mikrotubuli. I denne undersøgelse MIR eksponering forårsagede perinukleære fordeling og tæt sammenlægning af mikrotubuli hvorved den mikrotubulus-netværk. Denne observation svarer til mikrotubuli målretning lægemidler, såsom Vincaalkaloider [54]. Den perinukleære fordeling af mikrotubuli medfører, at MIR eksponering kan fremkalde oxidativ stress således foruroligende mikrotubuli netværk.

I denne undersøgelse fandt vi, at MIR eksponering inducerede DNA-skader reaktion. Tidligere undersøgelser har vist, at γ-H2AX nuklear foci viste sig at være colocalized med reparation proteiner involveret i homologi rekombination og nonhomologousend-sammenføjning (NHEJ) [55]. Andre reparation proteiner, herunder MCD1 /NFBD1 og 53BP1, blev også dokumenteret at interagere med γ-H2AX at danne nukleare foci [56]. Tidligere rapporter viser, at konformationsændringer i 53BP1 skyldes phosphorylering af 53BP1 via ATM derved udsatte kromatin-bindende domæne, der deltager direkte i reparation af DNA DSB’er ved at aktivere DNA-ligase IV /XRCC4-kompleks i NHEJ pathway [57]. I denne undersøgelse fandt vi, at MIR eksponering dannet nuklear foci af 53BP1 og γ-H2AX (figur 6), at MIR eksponering inducerer DNA-reparation som respons på DAN skader.

Sammenfattende denne undersøgelse udviser MIR af bølgelængde i 3-5 um kan ændre organiseringen af ​​actin filamenter, mikrotubuli og vinculin, og forårsage hæmning på cellecyklusprogression gennem aktivering ATM /ATR-p53-p21-aksen i respons på DNA-skade, også Cdc25C regulerer vej parallelt hvilket resulterer i nedregulering af dephosphorylering i CDK1 og cyklin B. især vores undersøgelse viser det første bevis på den hæmmende effekt af MIR i lungekræft celler og giver nyttige oplysninger til cancerbehandling.

Materialer og Metoder

melleminfrarøde stråling (MIR) Sender

bølgelængden af ​​MIR genereret fra det brede bånd sortlegeme kilde var begrænset i intervallet mellem 3 til 5 um ved anvendelse af en 3-5 um band pass safir wafer (SingHuang Technology Co., Ltd., Taipei, Taiwan) (figur 1A). Den brede båndpasfilter designet til at isolere 3-5 um atmosfæriske vinduer med en diameter på 25,4 mm ± 0,1%. De 50% snit på /afskåret transmission punkter blev sat til 3,0 um ± 4% og 5,0 um ± 4%, hhv. Filteret udstillet gennemsnitlige transmission i pass-båndet højere end 60% og mindre end 0,1% transmission niveauer uden for pass-båndet. En 300 nm tyk molybdæn film blev afsat ved plasma deposition på bagsiden af ​​en n-typen silicium substrat som en varmekilde (figur 1A). Strålingen intensiteten blev målt ved THORLAB PM100D power meter til at være 3 mW /cm

2. For at opretholde den cellekultur temperatur, genbruge køler maskinen blev indstillet til at holde temperaturen af ​​dyrkningsmedium ved 37 ° C som vist i figur 1B. Celler podes på 12 brønds vævskulturplader (Corning Costar, Corning, NY, USA), før 24 timers IR-eksponering blev placeret på filteret som vist i figur 1B.

Cell Culture

Menneskelig lungeepitelceller A549 (ATCC, CCL-185) og human føtal lunge-fibroblastceller MRC5 (ATCC, CCL-171) blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). A549-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA) suppleret med 10% kalvefosterserum (Biological Industries, Beit Haemek, Israel). De MRC5 celler blev dyrket i Minimum Essential Medium (Gibco) suppleret med 1 mM natriumpyruvat (Gibco), 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer (Gibco), og 10% føtalt bovint serum (Gibco). Både cellelinierne var fri for mycoplasma som påvist ved PCR-metode og dyrket ved 37 ° C med 5% CO

2.

immunfluorescensfarvning

A549-celler blev podet på glasset dækglas i 12-brønds dyrkningsplade, dyrkes i 1 dag, og afsløret af MIR eller dyrket i mørke i yderligere 48 timer. Celler blev fikseret og permeabiliseret med forkøling acetone i 5 min ved -20 ° C og derefter inkuberet med 1% BSA (BioShop, Burlington, ON, Canada) i PBS som blokeringsbuffer i 30 minutter ved stuetemperatur. Efterfølgende blev celler mærket med monoklonalt muse-anti-tubulin-antistof (Millipore, Billerica, MA, USA; 1:1000), monoklonalt muse-anti-vinculin antistof (Millipore, 1:200), kanin polyklonalt anti-53BP1 antistof (GeneTex, San Antonio, TX, USA; 1:500) eller muse-anti-γ-H2AX antistof (Abcam, Cambridge, MA, USA; 1:500) ved 4

oC natten over. Efter vasket med PBST (PBS indeholdende 0,05% Tween-20, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tre gange, cellerne blev mærket med tilsvarende sekundære anti-muse-IgG-Alexa 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA; 1:1000 ), anti-muse-IgG-PE (Abcam, 1:1000), eller sekundært anti-kanin-FITC-IgG (Millipore; 1:200) i 1 time i mørke ved stuetemperatur. Celler mærket med anti-vinculin blev modfarvet med TRITC-konjugeret Phalloidin (Millipore; 1:1000) i 15 minutter i mørke ved stuetemperatur. Cellerne blev derefter vasket med PBST tre gange, og monteret med ProLong® Gold-reagens med DAPI (Invitrogen). Billeder blev erhvervet af fluorescens mikroskop med Leica HCX FL PLAN 100 × /1,25 olie målsætning ved hjælp af et SPOT-kamera (Diagnostiske Instrumenter, Sterling Heights, MI, USA) og SPOT Avanceret software (Diagnostiske Instrumenter).

Cell Levedygtighed Assay

2 × 10

4-celler blev podet på plader med 12 brønde per brønd og lodes binde natten over før MIR eksponering. MTT pulver (3 [4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl- tetrazoliumbromid, Sigma-Aldrich) blev fremstillet som lager i PBS ved en koncentration på 5 mg /ml og filtreres. Efter afsløret af MIR i 48 timer blev 150 pi MTT-opløsning tilsat til hver brønd. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 3 timer, indtil krænker krystal dannet. Formazankrystaller blev opløst med 500 pi dimethylsulfoxid (DMSO, Scharlau Chemie, Barcelona, ​​Spanien) og omrøres undgås fra lys i 15 minutter for fuldstændigt at solubilisere krystallerne. Absorbansen blev målt ved 570 nm på en ELISA-læser (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA). Alle forsøg blev gentaget tre gange.

RNA-ekstraktion og revers transkription

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invotrogen) efter 48-timers udsættelse. Kort fortalt blev 400 pi TRIzol-reagens (Invitrogen) tilsat til hver brønd af 12-brønds TC plade, når mediet blev fjernet. Prøver blev indsamlet fra tre uafhængige forsøg og opbevaret ved -80

oC. RNA-ekstraktion blev udført ifølge vejledningen og RNA koncentration og kvalitet blev bestemt ved NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Montchanin, DE, USA). mRNA blev reverstranscripted af RevertAid ™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA). 1 ug totalt RNA var blandet oligo (dT)

18 primer og denatureret. Efterfølgende blev RNA-prøven blandedes med 5X reaktionspuffer, dNTP, RiboLock ™ RNase Inhibitor, og RevertAid ™ H Minus revers transkriptase. Revers transkription blev udført ved 42

oC i 60 minutter og termineret ved 70

oC i 5 minutter. Den revers transkription Produktet blev anvendt direkte i PCR-amplifikation eller opbevares ved -20

oC.

Real Time PCR

De gen-specifikke primere til real time PCR blev designet af Beacon Designer 7 program (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA), og sekvenserne er anført i tabel 1. Real-time kvantitativ PCR blev udført under anvendelse af SYBR Green Supermix (BIO-RAD, Hercules, CA) i 40 amplifikationscykler i en iCycler iQ5 ™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories). Relative transcript mængder blev beregnet under anvendelse af ΔΔCt (tærskelcyklus) metode med GAPDH som reference-genet amplificeret fra prøverne. Alle reaktioner blev kørt tredobbelt.

Protein Extraction og Western Blotting

Efter MIR eksponering i 48 timer blev samlet protein ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Protein blev solubiliseret i lysispuffer (7 M urinstof (Boehringer, Mannheim, Tyskland), 2 M thiourinstof, 4% CHAPS (JT Baker, Phillipsburg, NJ, USA) og 0,002% bromphenolblåt (Amersco, Solon, OH, USA)) og proteinkoncentrationen blev bestemt ved BCA-metoden (Pierce Biotech Inc., Rockford, IL, USA).