PLoS ONE: tyrosinkinasen c-Src direkte formidler vækstfaktor-induceret Notch-1 og Furin Interaktion og Notch-1 Aktivering i kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

proteolytiske aktivitet af Furin ansvarlig for behandlingen fuld længde Notch-1 (p300) spiller en kritisk rolle i hak signalering. Amplituden og varigheden af ​​Notch aktivitet kan reguleres på forskellige punkter i vejen, men der har ikke været nogen rapport om regulering af Notch-1-Furin interaktion, trods dens betydning. I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at Notch-1-Furin interaktionen reguleres af den ikke-receptortyrosinkinase, c-Src. c-Src og Notch-1 er fysisk forbundet, og denne forening er ansvarlig for Notch-1 behandling og aktivering. Vi fandt også, at vækstfaktoren TGF-α, en EGFR-ligand, og PDGF-BB, en PDGFR ligand, inducere Notch-1-Furin interaktion medieret af c-Src. Vores resultater understøtter tre nye og provokerende konklusioner: (1) Sammenhængen mellem Notch-1 og Furin er en velreguleret proces; (2) Ekstracellulær vækstfaktor-signaler regulere dette samspil, som medieres af c-Src; (3) Der er cross-talk mellem plasma vækstfaktor receptor-c-Src og Notch veje. Co-lokalisering af Notch-1 og c-Src blev bekræftet i xenograft tumorvæv og i væv af pancreas kræftpatienter. Vores resultater har konsekvenser for den mekanisme, hvorved Notch og vækstfaktor receptor-c-Src signalveje regulerer carcinogenese og kræft cellevækst

Henvisning:. Ma YC, Shi C, Zhang YN, Wang LG, Liu H , Jia HT, et al. (2012) Den Tyrosin kinase c-Src direkte formidler vækstfaktor-induceret Notch-1 og Furin Interaktion og Notch-1 Aktivering i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 7 (3): e33414. doi: 10,1371 /journal.pone.0033414

Redaktør: Laszlo Buday, Ungarsk videnskabsakademi, Ungarn

Modtaget: November 3, 2011; Accepteret: 8. februar 2012; Udgivet: 30 marts, 2012 |

Copyright: © 2012 Ma et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra National Natural Science Foundation of China (30873033 til YXZ) og Major State Basic Research Development Programs (2009CB521800 og 2010CB529400 til YXZ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. FHS nu fungerer som redaktør for PLoS ONE. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft i bugspytkirtlen har den værste prognose for alle større kræftformer og er fortsat den fjerde mest almindelige årsag af cancer-relaterede dødsfald i USA og i hele verden [1]. Dette kan skyldes det faktum, at ingen effektive metoder til tidlig diagnose er i øjeblikket tilgængelige, samt manglen på effektive behandlinger. Det er blevet rapporteret, at Notch signalering netværket ofte er dereguleret i humane maligniteter, herunder pancreascancer, med op-reguleret ekspression af Notch-receptorer og deres ligander [2]. Notch signalering er involveret i celleproliferation og apoptose, der påvirker udviklingen og funktionen af ​​mange organer.

Notch

koder for proteiner, som kan aktiveres ved interaktion med en familie af ligander [3] . Notch-1 er til stede på celleoverfladen som et heterodimert molekyle (p120 /P200), mens precursorproteinet (p300) sandsynligvis ikke nå celleoverfladen og spaltes i p120 og p200 i trans-Golgi netværket (TGN) ved furin (S1 spaltning) [4], [5]. Ligand binding inducerer sekventiel spaltning af Notch-receptorer, første spaltning af det ekstracellulære domæne (ECD) af Adam (a disintegrin og metalloprotease) proteinase TACE (S2-spaltning) og derefter af det transmembrane domæne af en γ-sekretase enzymkompleks (S3 spaltning), frigive det intracellulære domæne (NiCd) [3], [6]. Sidstnævnte translokerer derefter til kernen, hvor det associerer med DNA-bindende protein CSL (CBF1 /RBPJ-κ) til at regulere transkriptionen af ​​multiple effecter gener, herunder medlemmer af HES /HEY familie [7]. For nylig, Lake et al gang vist en sammenhæng mellem tab af spaltning af Furin og tab af

in vivo

funktion af Notch-receptoren, støtter tanken om, at S1 spaltning er en

in vivo

mekanisme kontrollerende Notch-1-signalering [8]. Således den proteolytiske aktivitet ansvarlig for p300 forarbejdning spiller en kritisk rolle i Notch-1-signalering, da det bestemmer strukturen af ​​receptoren. Det er imidlertid ikke klart, om spaltning af Notch ved Furin er en stokastisk eller streng regulering proces.

Vi screenede flere kinaseinhibitorer og fundet, at Src-kinase-inhibitorer inhiberede Notch-1 og Furin binding. c-Src er en hr 60.000 ikke-receptortyrosinkinase-produktet af proto-oncogenet c-Src, og den cellulære homolog af Rous sarkomvirus transformerende protein, v-Src [10] (Ishizawar og Parsons, 2004). Akkumulerende beviser implicerer Src som en vigtig faktor for tumorigenese, invasion, og metastase [9]. c-Src overudtrykkes i over 70% af pancreas carcinoma cellelinier, og Src-kinase aktivitet er ofte forhøjet [10]. Således Src og Notch-1 er vigtige proteiner påvirker pankreatisk vækst cancercelle, invasion og metastase. I den aktuelle undersøgelse, vi har registreret direkte interaktion mellem disse proteiner. Vi fandt også, at vekselvirkningen mellem Notch-1 og Furin er ikke stokastisk, men snarere velreguleret, idet c-Src binder til Notch-1 og stimulerer Notch-1 og Furin interaktion. Vi fandt, at bindingen af ​​EGFR og PDGFR ved deres ligander også stimulerede Notch-1-Furin interaktion, hvilket indikerer, at ekstracellulær vækstfaktor signaler direkte kan regulere Notch-1-aktivering i trans-Golgi-apparatet.

Resultater

1. Virkninger af Src inhibitorer på Furin-induceret Notch-1 spaltning

For at undersøge hvilken kinase eller kinase familien er involveret i reguleringen af ​​Furin-induceret Notch-1 spaltning blev flere kinase hæmmere testet. Prolifererende BxPC-3 og HPAC celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af PP2 eller SU6656 og ekstrakterne blev elektroforeret og blottet til detektion af Notch-1. Src kinase inhibitor PP2 reduceret spaltning af fuld længde Notch-1 mere end to gange. Efter forbehandling med PP2 i 20 minutter, de 120 kD spaltningsprodukter af Notch-1 faldt og fuld længde Notch-1-protein forøget (figur 1A). Vi gav også en lysere eksponering af en lignende Western-blot i det nederste panel af figur 1A viser nedgangen i 120 kD spaltningsproduktet mere tydeligt. PP2-induceret hæmning af fuld længde Notch-1-spaltning syntes at være dosisafhængig (data ikke vist).

(A) Src-inhibitorer PP2 og SU6656 inducerer hæmning af fuld-længde Notch-1 behandling af Furin i HPAC bugspytkirtlen kræftceller. HPAC celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS. Celler blev behandlet med 10 uM PP2 eller SU6656 i 60 min. Western blots blev udført med anti-Notch-1-antistof. Nedre panel blev faldet i hak-1 /p120 er vist i en lysere eksponering fra en lignende Western-blot. Notch-1 p300, FL fuld længde Notch proteiner; Notch-1 p120, spaltet Notch proteiner. (B) Den EGFR ligand TGF-α inducerer fuld længde Notch-1-spaltning, som er reduceret med c-Src inhibitor PP2 i både HPAC og BxPC3 bugspytkirtelkræftceller. Celler blev serum-starvated i 48 timer, behandlet med 10 pM PP2 i 60 min, og derefter behandlet med 7 nM TGF-α i 20 min. Western blots blev udført med anti-Notch-1, phospho-c-Src, c-Src og p-actin-antistoffer. p-c-Src, phospho-c-Src.

Selv om det er rigtigt, at PP2 hæmmer selektivt Src kinaser, ved højere koncentrationer, er PP2 også kendt for at inhibitor EGFR. Vi har udført dosis-respons eksperimenter og fundet, at PP2 inhiberer c-Src med en IC50 på 4 uM i HPAC celler (Figur S1), men 10 uM PP2 kun inhiberede EGFR-aktivitet med 45%, hvilket indikerer PP2 inhiberer EGFR-aktivitet med en IC50 mere end 10 pM i cellekultur (figur S2). Som 10 uM PP2 inhiberede c-Src-aktivitet med 77%, synes PP2 inhiberer Notch-1-spaltning hovedsagelig gennem c-Src, men ikke gennem EGFR, selvom vi ikke kunne udelukke possibilty at den direkte inhibering af EGFR lidt bidrage til PP2 -induceret nedregulering af Notch-1 spaltning. SU6656, der tilhører en anden strukturel klasse af Src-kinase-inhibitorer havde en lignende effekt på Notch-1-spaltning som PP2 (figur 1A).

Vi har også testet, hvorvidt vækstfaktor-induceret c-Src-aktivitet påvirker hak- 1 aktivering. Prolifererende HPAC og BxPC-3-celler blev udpladet på standard vækstmedium i 24 timer og overført til serumfrit DMEM i 48 timer for at tillade receptorer at ækvilibrere på celleoverfladen. De blev derefter behandlet i 60 minutter med PP2 før stimulering med 7 nmol /L TGF-α. Efter 20 minutter blev helcellelysater fremstillet, og ekstrakterne blev elektroforeret og blottet til påvisning Notch-1, s-c-Src, og β-actin. Figur 1B viser markant aktivering af c-Src i TGF-a-behandlede celler. Forbehandling af cellerne med 10 pM PP2 i 60 minutter resulterede i næsten fuldstændig inhibering af c-Src-phosphorylering i alle de testede cellelinier (figur 1b). I HPAC og BxPC3 celler udsat for TGF-α spaltning af Notch-1 steget omkring 2 og 3 gange, henholdsvis og disse stigninger blev også hæmmet af forbehandling med PP2 (figur 1B).

2. TGF-a stigninger CSL binding til Hes-1 promotoren

Efter successiv spaltning med Furin, TACE og γ-sekretase, Notch-1 NiCd er frigjort fra plasmamembranen og transporteres til kernen, hvor det associerer med DNA-bindende protein CSL (CBF1 /RBPJ-κ) og inducerer transkription af multiple effektor gener, herunder Hes-1. For at teste om TGF-α inducerer binding af CSL til Hes-1 promotoren udførte vi chip assays. Før TGF-α behandling, blev en lille mængde CSL detekteret på CSL bindingssted Hes-1, og dette progressivt efter TGF-α behandling i 30 og 60 minutter (figur 2A). For bedre at kvantificere ændringer i CSL binding til Hes-1 promotoren, udførte vi Q-PCR-assays på chippen prøver. CSL-binding til Hes-1 igen forøget ved 30 min og 60 min efter TGF-α behandling (figur 2B).

(A) CSL CHIP assay. HPAC celler blev dyrket i serumfrit medium i 48 timer og derefter behandlet med 7 nM TGF-α i 0, 30, 60 min. Kromatin prøver blev immunopræcipiteret med CSL antistof blev DNA ekstraheret og amplificeret under anvendelse af HES-1 promotor- primere i 35 cyklusser ved PCR. M, 100 bp DNA-stige. (B) Q-PCR-analyse af chip DNA-prøver viser, at TGF-α-induceret sammenslutning af CSL-1 med Hes-1-promotor, hvilket resulterer i ca. 0,5 og 2- fold forøges med 30 min og 60 min tidspunkt , henholdsvis. Standardafvigelser er indikeret (n = 3).

Vi har tidligere vist, at overekspression af NiCd øger bugspytkirtelkræft celleproliferation og invasion [11]. I den foreliggende undersøgelse har vi gjort colonigenic assay og fundet, at overekspression af aktiv form af Notch-1, Notch Ekstracellulær trunkering (NEXT), signifikant forøget HPAC celle kolonidannelse (Fig S3).

3. Virkninger af c-Src-hæmmere og vækstfaktorer på Notch-1 og Furin interaktion

For at bestemme, om c-Src påvirker Furin aktivitet, vi målte effekten af ​​PP2 og SU6656 på Furin aktivitet i BxPC3 og HPAC celler ved hjælp et fluorescens-assay. PP2 og SU6656 kun reduceret Furin aktivitet med 30% (data ikke vist), som ikke kunne forklare 2 gange reduktion i Notch-1-spaltning. begrundet vi derfor, at c-Src-hæmmere kan påvirke samspillet mellem Notch-1 og Furin. Vi behandlede celler med 10 pM PP2 eller SU6656 i 20 minutter og derefter udført immunopræcipitationsanalyser at se på associationen mellem Furin og Notch-1. PP2 og SU6656 faktisk signifikant hæmmet Furin-Notch-1-binding (figur 3A). En kvantitativ densitometri for figur 3A er tilvejebragt i figur S4. Ved en koncentration på 10 uM, PP2 og SU6656 reducerede Furin-Notch-1 forening med 53% og 43%, henholdsvis (figur S4).

(A) Src inhibitor PP2 eller SU6656 hæmmer Notch-1 og Furin association. HPAC celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS uden serum sult. Celler blev behandlet med 10 pM PP2 eller SU6656 i 60 min. Normalt kanin IgG blev anvendt som en negativ kontrol. En densitometri for figur 3A er tilvejebragt i figur S4. (B) PDGF-BB inducerer Furin og Notch-1-interaktion. Prolifererende HPAC celler blev serum-starvated i 48 timer, derefter behandlet med 20 ng /ml PDGF-BB i 20 min. Normalt kanin IgG blev anvendt som en negativ kontrol. (C) SU6656 hæmmer PDGF-induceret Furin-Notch-1 foreningen. Prolifererende HPAC celler blev serum-starvated i 48 timer, behandlet med SU6656 i 60 min, og derefter behandlet med 20 ng /ml PDGF i 20 minutter. SS, serumudsultning; PDGF, PDGF-BB; FBS blev celler dyrket i normalt medium, DMEM suppleret med 10% FBS uden serum sult; Notch-1 p120, spaltede Notch proteiner; Notch-1 p300, FL Notch proteiner. (D) Den EGFR-ligand TGF-α inducerer Src aktivering i Golgi. RFP-B4GLT1-transficerede HPAC celler blev serum-starvated i 48 timer og derefter behandlet med 7 nM TGF-α. Cellerne blev farvet med anti-phospho-Src (

grøn Salg) antistoffer for at visualisere co-lokalisering af phospho-Src (grøn) og RFP-stil- lede TGN markør B4GALT1.

Bar,

10 um.

For at teste, om vækstfaktor-induceret Src-aktivitet påvirker Notch-1-aktivering og Notch-1-Furin interaktion, BxPC-3 og HPAC celler serum udsultet i 48 timer og efterfølgende inkuberet med 20 ng /ml PDGF-BB i 20 minutter. Resultaterne i figur 3C afslører markeret aktivering af c-Src i PDGF-BB-behandlede celler. I disse celler co-immunoudfældning af fuld-længde Notch-1 med Furin steg mere end 5-fold (figur 3B). Den vigtigste form for Notch-1 forbundet med Furin var af fuld længde (figur 3B), i modsætning til Notch-1 der interagerer med c-Src, som overvejende var p120 (figur 4A). Behandling med 7 nmol /L TGF-α havde en lignende virkning som PDGF-BB (data ikke vist).

(A) c-Src associatesd med Notch-1 i BxPC3 celler. Cellelysater blev immunpræcipiteret med anti-c-Src-antistoffer, og immunoblotteding (IB) blev udført med anti-Notch-1 og anti-c-Src-antistoffer. Normale kanin IgG’er blev anvendt som negative kontroller. (B) PP2 hæmmer TGF-α-induceret c-Src og Notch-1 foreningen. Serum-starvated HPAC-celler blev behandlet med 10 pM PP2 i 60 min, derefter behandlet med 7 nmol /L TGF-α i 20 min. Normale kanin IgG’er blev anvendt som negative kontroller for IP. Celler dyrket i normalt medium (DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum) uden serum sult blev anvendt som positive kontroller. N, normalt medium. (C) SU6656 hæmmer TGF-α-induceret c-Src og Notch-1 foreningen. Notch-1 /p300, FL Notch proteiner.; Notch-1 /p120, spaltet Notch proteiner. (D) Association af c-Src med Notch-1 er afhængig af dens kinaseaktivitet. Vildtype, Y416F, og Y527F fusioneret med et HA-mærke blev forbigående transficeret ind i HeLa-celler. Helcellelysater blev derefter fremstillet, immunopræcipiteret med anti-Notch-1-antistoffer, og immunoblottedting (IB) blev udført med anti-HA og anti-Notch-1 antistoffer. Normalt kanin IgG blev anvendt som en negativ kontrol.

Vi derefter testet virkningerne af c-Src-inhibitorer på PDGF-BB-inducerede stigning i Notch-1 og Furin binding. Forbehandling af celler med 10 pM PP2 eller SU6656 i 60 min resulterede i næsten fuldstændig inhibering af PDGF-BB-inducerede stigning i Notch-1 og Furin binding (figur 3C). Disse resultater viser, at ekstracellulære vækstfaktor signaler medieret af c-Src inducerer Notch-1 og Furin binding og aktivere Notch-1.

Det er godt accepteret, at den fulde længde Notch-1 først cleavaged af Furin i TGN. Som vækstfaktor TGF-α og PDGF-BB inducerer Notch-1-Furin interaktion, vi spurgte, om vækstfaktor inducerer c-Src aktivering i TGN. Vi transficerede HPAC celler med RFP-stil- lede B4GALT1 som TGN markør. Det blev vist, at B4GALT1 hovedsagelig ligger i TGN, og for en vis grad, mediale Golgi [12]. B4GALT1-transficerede HPAC celler blev serum-starvated i 48 timer og 7 nM TGF-α blev tilsat i 30 min. At afgøre, om CSRC er aktiveret i TGN, vi kiggede på co-lokalisering af phospho-Src og B4GALT1 hjælp konfokal mikroskopi. Vi demonstrerede colokalisering af RFP-stil- lede B4GALT1 og phospho-c-Src immunoreactivty i TGF-a-behandlede celler, men ikke i kontrolcellerne (figur 3D). Resultaterne indikerer, at TGF-α kunne hurtigt inducerer c-Src aktivering i TGN.

4. c-Src direkte forbinder med Notch-1

Vi spurgte, om c-Src kinase påvirker Notch-1 aktivering direkte, eller virker indirekte gennem andre effektorer. BxPC3 celler blev lyseret, og lysatet blev immunpræcipiteret med anti-c-Src-antistoffer, og Notch-1 blev påvist ved Western blotting. Nogle Notch-1, både i fuld længde Notch-1 /p300 og Notch-1 /p120, var forbundet med c-Src (figur 4A). Vi har også immunopræcipiteret Notch-1 og fundet signifikante mængder af c-Src i Notch-1 immunpræcipitater (data ikke vist). Disse resultater indikerer, at c-Src fysisk associerede med Notch-1.

Vi spurgte derefter, om vækstfaktor-stimuleret c-Src aktivering kan føre til øget sammenslutning af c-Src og Notch-1. HPAC celler blev serum sultet i 48 timer og efterfølgende inkuberet med 7 nmol /L TGF-α i 30 minutter. I celler behandlet med TGF-α, co-immunopræcipitation af både fuld-længde Notch-1 og Notch-1 /p120 med c-Src steg ca. 3 gange, og blev inhiberet ved forbehandling med PP2 (figur 4B) eller SU6656 (figur 4C ).

for at vise, at src kinase aktivitet er afgørende for sammenslutningen af ​​c-src med Notch-1, genererede vi kinase døde og konstitutivt aktive src mutanter. Kinase aktivitet blev deaktiveret ved at mutere Y416 tyrosin websted til phenylalanin (c-Src-Y416F), mens konstitutivt aktiv Src Y527F blev genereret ved at mutere hæmmende tyrosin 527 til phenylalanin. Vi overudtrykt disse mutanter i HeLa-celler og vurderes evnen af ​​forskellige c-Src-konstruktioner til at associere med Notch-1. Notch-1 bundet til vildtype og konstitutive former af c-Src, men binding til kinase døde mutanten blev reduceret mere end 3-fold (figur 4D). Disse resultater viser, at kinaseaktiviteten af ​​c-Src er påkrævet for effektiv binding til Notch-1.

5. Co-lokalisering af c-Src med Notch-1

in vivo

For at bestemme, om c-Src og Notch-1 co-lokalisere

in vivo

, vi udførte immunfarvning . Colokalisering af Notch-1 og c-Src immunoreaktivitet kunne ses fra den gule fluorescens, når billeder af Cy3-farvet anti-Notch-1 og FITC-farvede anti-c-Src immunoreaktiviteter blev fusioneret (figur 5A). Vi derefter testet for co-lokalisering af HA-mærket c-Src og endogene Notch-1. Vildtype HA-c-Src blev udtrykt i HeLa-celler. Konfokal fluorescensmikroskopi afsløret co-lokalisering af c-Src-HA og Notch-1 (figur 5B), og ekspressionen af ​​FLAG-mærket NEXT i HeLa-celler afslørede co-lokalisering af NEXT-FLAG og c-Src (figur 5C).

(A) intracellulær interaktion af c-Src og Notch1. c-Src og Notch-1 blev visualiseret med et konfokalt mikroskop.

Bar,

10 um. (B) Co-lokalisering af HA-mærket c-Src og Notch-1. HPAC celle blev transficeret med pcDNA3-c-Src-HA plasmid, og co-farvet med anti-Notch-1 (

rød og) og anti-HA (

Grøn

) antistoffer for at visualisere endogent Notch-1 og HA-mærkede c-Src, hhv.

Bar,

10 um. (C) Co-lokalisering af endogen c-Src og FLAG-mærket Notch ekstracellulære trunkering (NEXT) fragment. HPAC celle blev transficeret med pcDNA3-NEXT-FLAG plasmid, co-farvet med anti-c-Src (

rød og) og anti-FLAG (

Grøn

) antistoffer for at visualisere endogent c-Src og FLAG-mærket Notch-1 NÆSTE fragment hhv.

Bar,

10 um.

6. Proteindomænerne involveret i c-Src-Notch-1-binding

c-Src er sammensat af SH3, SH2 og kinasedomæner hvis evne til at binde forskellige proteiner er blevet karakteriseret. Vi udtrykte en række c-Src-deletionsmutanter i HeLa-celler til at identificere de nødvendige betingelser for association regioner med Notch-1 (figur 6A). Associering med Notch-1 blev reduceret, hvis kinasedomæne af c-Src blev slettet (figur 6B). I modsætning hertil deletion af SH3 eller SH2-domænet ikke mærkbart påvirker association med Notch-1 (figur 6B). For at bestemme hvorvidt c-Src KD domæne er tilstrækkelig til interaktion med Notch-1, udførte vi immunfældning og Western-blot-assays med en c-Src KD-HA-fusionsprotein i HeLa cellelysater. Notch-1 bundet specifikt til c-Src KD men ikke til C-Src SH3 domæne, og kun svagt til SH2-domænet (figur 6B). Synes således nødvendig og tilstrækkelig for c-Src interaktion med Notch-1 KD-domænet.

kinasedomænet af c-Src binder til Notch-1. (A) Skematisk gengivelse af strukturen af ​​c-Src deletionskonstruktioner. (B) KD domæne c-Src binder sig til Notch-1

in vitro

. De angivne fragmenter af c-Src blev fusioneret til en HA-mærke og forbigående transficeret ind i HeLa-celler. Helcellelysater blev derefter fremstillet, immunopræcipiteret med anti-HA-antistoffer, og immunoblotteding (IB) blev udført med anti-Notch-1 og anti-HA-antistoffer. Normalt kanin IgG blev anvendt som en negativ kontrol. (C) Co-immunfældning af FLAG-mærket Notch-1 NEXT og HA-mærkede c-Src. (D) Skematisk afbildning af strukturen af ​​Notch-1 deletionskonstruktioner. (E) The ankyrin repeat-domænet af Notch-1 binder til c-Src. De angivne fragmenter af Notch-1 blev fusioneret til et FLAG-tag og forbigående transficeret ind i HeLa-celler. Helcellelysater blev derefter fremstillet, immunopræcipiteret med anti-FLAG antistoffer og immunoblotteding (IB) blev udført med anti-FLAG og anti-c-Src-antistoffer. Normalt kanin IgG blev anvendt som en negativ kontrol. (F) Notch-1 er tyrosin-phosphoryleret. Notch-1 blev immunpræcipiteret med anti-phospho-tyrosin Ab 4G10. Hel-cellelysater af HPAC blev fremstillet, og immunpræcipiteret med anti-phospho-tyrosin (4G10), og anti-Notch-1-antistoffer, og immunoblotteding (IB) blev udført med anti-Notch-1. Normalt kanin IgG blev anvendt som en negativ kontrol. (G) Påvisning af tyrosinphosphorylering med anti-Notch-1 immunpræcipitater. Øvre panel: Whole-cellelysater af HPAC blev immunfældet med anti-IgG og anti-Notch-1 antistoffer. Immunopræcipitaterne blev underkastet immunoblotting-analyse med anti-phosphotyrosin-antistof 4G10. Nedre panel, blev samme blot strippet, og påvises med anti-Notch-1-antistof. (H) Src inhibitor SU6656 eller PP2 formindsker phospho-tysosine-associeret Notch-1. Hel-cellelysater af HPAC blev immunfældet med anti-IgG og anti-phosphotyrosin 4G10-antistoffer. De immunopræcipitater blev udsat for immunblotting analyse med anti-Notch-1.

Vi har også cotransficeret FLAG-mærket Notch-1 NEXT og HA-mærkede c-Src i HeLa-celler. Vores resultater viser, at NEXT er associeret med HA-mærkede c-Src (figur 6C).

Vores fund, at både fuld-længde Notch-1 (p300) og spaltes Notch-1 (p120) associeret med c- src indikerede, at Notch-1 intracellulære domæne (NiCd) har en c-src-bindingssted. At identificere domæne (r) af Notch-1 er ansvarlig for c-Src binding, genereret vi deletionskonstruktioner af NiCd (figur 6D), og udførte co-immunpræcipitering analyser med anti-FLAG-tag og c-Src-specifikke antistoffer. Resultaterne viser, at ankyrin repeat (ANK) -deletion mutant havde en stærkt reduceret bindingsaffinitet for c-Src, hvilket antyder, at ANK domænet af Notch-1 er ansvarlig for binding til c-Src (figur 6E). Derfor Notch-1 og c-Src associeret via ANK domænet af Notch-1 og KD domæne af c-Src.

For at teste om Notch-1 phosphoryleres på tyrosinrester, vi immunpræcipiteret HPAC cellelysater med anti-phospho-tyrosin antistof 4G10 og påvises Notch-1 ved Western blotting. Nogle Notch-1 /p120 var til stede i immunopræcipitatet (figur 6F). Vi immunpræcipiteret også HPAC cellelysater med anti-Notch-1-antistof og påvist tyrosin-phosphorylering med 4G10-anti-phospho-tyrosin antistof. Både Notch-1 /p300 og Notch-1 /p120 blev phosphoryleret på tyrosin (figur 6G). Vi behandlede HPAC-celler med 10 pM SU6656 eller PP2 i 30 minutter, og immunpræcipitere cellelysatet med anti-phospho-tyrosin antistof 4G10, påvises derefter phospho-tyrosin-associeret Notch-1 (figur 6H). Vi fandt, at SU6656 eller PP2 markant nedsat phospho-tyrosin-associeret Notch-1 (figur 6H). Resultaterne viste, at Notch-1 potentielt phosphoryleres af c-Src.

7. Co-lokalisering af c-Src og Notch-1 i xenograft bugspytkirtelkræft model

For at se, om systemisk terapi med PP2 kan påvirke Notch-1-c-Src interaktion i xenotransplantattumorer

in vivo

, vi etableret HPAC humane pancreas cancer xenografter i nøgne mus. Når HPAC transplantater havde udviklet sig til tydelige tumorer (200 mg), blev PP2 givet ved 4 mg /kg som s.c. injektioner til i alt 8 injektioner hver anden dag. PP2 behandling reducerede tumorvækst (

P

= 0,0007 versus køretøj) sammenlignet med de ubehandlede kontroller. (Figur 7A B)

(A) Virkninger af PP2 på tumorvækst i HPAC bugspytkirtelkræft xenotransplantater i flankerne af nøgne mus. Et repræsentativt fotografi af en mus fra hver gruppe er vist., Med tumorer placeret i deres flanker. (B) Reduceret vækst xenotransplantaterne af HPAC bugspytkirtlen kræftceller i immundefekte mus på grund af PP2 behandling. Tumoren mængder var 200-300 mm

3 ved starten af ​​den medicin behandling. Data er præsenteret som middelværdi ± SD af tumorvolumener. Forskellen mellem DMSO og PP2 grupperne var stærkt signifikant (

P

0,01; n = 10). (C) Tumorer blev resektion og behandlet, og objektglassene blev farvet med H

P

0,01, n = 10;. Figur 7E)

diskussion

Selvom spaltning af Notch-1 på S1 stedet af Furin er nødvendig for Notch-1-aktivering mekanismen styrende Notch-1-Furin forening var ikke klart. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at Notch-1-aktivering reguleres af en tyrosinkinase. Vi viste ligeledes, at c-Src er fysisk forbundet med Notch-1; c-Src interagerer med Notch-1 via dens KD domæne, og kinaseaktiviteten er påkrævet for effektiv association af c-Src med Notch-1. Ekstracellulære vækstfaktorer synes at direkte regulere Notch-1 spaltning på proteinniveauet via c-Src.

Direkte krydstale mellem vækst receptor-c-Src og Notch vej

Src familie kinaser (SFKs) er ikke-receptorer kinaser overudtrykt i de fleste pancreascancer, og er involveret i cancer progression og metastase [9]. Inhibering af disse kinaser har vist lovende i prækliniske kræftmodeller. Vores resultater viser, at Notch-1 og c-Src proteiner er fysisk forbundet og at denne associering medierer Notch-1 behandling og aktivering. Det er blevet rapporteret, at Notch-1 er associeret med serin /threonin-kinaser GSK3beta og CDK8 [13], [14]. Vores resultater viser, at Notch-1 også reguleres af en tyrosinkinase.

Notch-1 er potentielt en nedstrøms effektor af EGFR /PDGFR i bugspytkirtelkræftceller

EGFR signalering påvirkninger mange aspekter af tumor biologi, herunder proliferation, invasion, spredning og apoptose [15]. Aktivering af EGFR øger tumorvækst, invasion, og spredning; det hæmmer også apoptose. Størstedelen af ​​pancreascancer overudtrykke EGFR, og dette er blevet korreleret med fremskreden sygdom ved præsentation og reduceret gennemsnitlig overlevelsestid [16]. EGFR producerer sin virkning på maligne celler via autokrine og parakrine loops og er blevet vist at binde TGF-α og EGF. EGFR derefter autophosphoryleret og transphosphorylated på tyrosin-rester, hvilket resulterer i forbindelse med adapter og signalmolekyler og fører til aktivering af flere intracellulære signalsystemer kaskader, herunder dem, der involverer Src, AKT og ras /MAPK1 /2 [15].

PDGFR-α og PDGFR-β er strukturelt lignende receptortyrosinkinaser aktiveret af blodpladeafledt vækstfaktor [17]. PDGF inducerer cellevækst, overlevelse [18] og transformation [19]. Aktivering af PDGFR i tumorer kan også forekomme gennem autokrin eller parakrin stimulation som både tumorceller og normale celler i stroma secernerer PDGF. Over-udtryk er fundet af PDGFR i pancreascancer [20]. Ligesom EGFR, PDGFR stimulering fører til aktivering af intracellulær signalering, især af Src, AKT, og ras /MAPK1 /2.

Vi har tidligere observeret, at over-ekspression af Notch-1 intracellulære domæne (NiCd) forøger pancreascancer cellevækst og vælte Notch-1 inhiberer cellevækst [11]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at overekspression af Notch-1 øger kolonidannelse af HPAC bugspytkirtelkræftceller. Vi har vist ovenfor, at aktivering af enten EGFR eller PDGFR stimulerer Notch-1-aktivering, der medieres af c-Src. Således Notch-1-aktivering spiller en vigtig rolle i væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller, og i celleproliferation stimuleret ved aktivering af EGFR eller PDGFR.

I en tidligere rapport fandt vi, at nedregulering af Notch-1 nedsat celle invasion, mens Notch-1 overekspression af cDNA transfektion ført til øget tumor celle invasion [11]. Vi fandt også, at nedregulering af Notch-1 reducerede NF-KB-DNA-bindingsaktivitet og ekspression af matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) og VEGF [21]. Således kan Notch-1 virker som en nedstrøms effektor af EGFR /PDGFR signalering opregulere MMP-9 og VEGF-ekspression, og stimulerende celleinvasion og metastase. Kolonner, betyder;