PLoS ONE: Foreninger mellem NBS1 polymorfier og kolorektal cancer i kinesisk Befolkning

Abstrakt

Som den centrale protein af de dobbelte strengbrud (DSB) induceret DNA reparation vej,

NBS1

deltager i detektering af DSBs og spiller en væsentlig rolle i at opretholde genomisk stabilitet. Single nukleotid polymorfier (SNPs) i

NBS1

gen var almindeligt testet, at i forbindelse med modtageligheden for flere kræftformer, men resultaterne forblev kontroversiel. Således har vi gennemført to uafhængige case-control studier hospitalsbaserede omfatter 1.072 kolorektal cancer patienter og 1.263 kontroller for at vurdere sammenhængen mellem fire

NBS1

SNPs og kolorektal cancer risiko. Resultatet viste, at rs2735383C /G polymorfi i 3′-utranslaterede region (UTR) af

NBS1

var signifikant forbundet med risiko for colorectal cancer ved hjælp af logistisk regression (

P

10

-4). Desuden observerede vi, at rs2735383CC genotype var forbundet med væsentligt øget risiko for kolorektal cancer (odds ratio = 1,55, 95% konfidensinterval = 1,27-1,94) sammenlignet med rs2735383GC + GG genotyper. Yderligere funktionelle eksperimenter viste, at rs2735383C allel i

NBS1

forstyrret bindingsaffinitet har-miR-509-5p til

NBS1

3′-UTR i kolorektale cancerceller, påvirker

NBS1

transkriptionsaktivitet og udtryk niveau. Afslutningsvis nuværende tyder på, at den rs2735383C /G polymorfi kan bidrage til risikoen for tarmkræft

Henvisning:. Li J-T, Zhong B-Y, Xu H-H, Qiao S-Y, Wang G, Huang J, et al. (2015) Foreninger mellem

NBS1

polymorfier og kolorektal cancer i kinesisk Befolkning. PLoS ONE 10 (7): e0132332. doi: 10,1371 /journal.pone.0132332

Redaktør: Yifeng Zhou, Medical College of Soochow University, KINA

Modtaget: May 5, 2015; Accepteret: 14 Juni 2015; Udgivet: 17 Jul 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dr. Hong-Chuan Zhao modtaget midler fra National High Technology Research and Development Program Kina (863 Program) (nr 2014AA020801), International Science Teknologi Program Kina (No.2013DFA31510) og Research Fund af Beijing Municipal Science Teknologi Kommissionen (nr Z111107067311021); Dr. Hui-Zhen Fan blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 81.360.606). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige ondartede sygdomme førende årsag til cancerrelaterede dødsfald i hele [1] verden. I det sidste årti, har været fokuseret en stor indsats på udvikling af nye behandlingsmetoder og diagnostiske teknologier, men er forekomsten og dødeligheden betydeligt hæve i en asiatisk population [2, 3]. Ud over miljømæssige risikofaktorer og livsstilsvaner [4, 5], genetiske ændringer, herunder enkelt nukleotid polymorfier (SNP) i kandidatgener, som er involveret i DNA-reparation vej har været impliceret i kolorektal carcinogenese [6-9].

DNA reparation veje spiller en central rolle i at opretholde genomisk integritet og forebyggelse af celler mod kræft [10]. I modsætning hertil er det blevet klart, at manglerne ved DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs) reparation af kræftfremkaldende stoffer kan føre til genomisk ustabilitet og dermed korrelere med udviklingen af ​​kræft [11]. To DNA reparation veje omfatter homolog rekombination reparation (HR) og ikke-homologe ende-sammenføjning (NHEJ) involverede veje i humane celler føre til skade reparation ved at rekruttere specifikke DNA reparation molekyler til skadestedet [12-14]. Rekrutteringen af ​​nukleare proteinkinase ataksi telangiectasia muteret (ATM) til DNA DSB’er betragtes som den kritiske trin af begge veje i dens aktivering og funktion. Imidlertid er det blevet anerkendt, at ATM rekruttering til steder med DSBs krævede og blev lettet af specifikke partner proteiner meiotisk rekombination 11 homolog (MRE11), human RAD50 homolog (RAD50) og Nijmegen brud syndrom 1 (NBS1) [15]. Som en central aktør i MRN-komplekset, NBS1 direkte interagerer med H2AX at danne nukleare foci på steder af DNA-skader og udløser de efterfølgende trin i DNA-skader tidlig reaktion [15, 16]. Derudover

NBS1

spiller væsentlige roller i samlingen af ​​MRN komplekser og dirigerer MRN komplekser koordinere DSBs til behandling og reparere [17, 18]. Derfor genetiske varianter i

NBS1

gen kan modulere DNA-reparation kapacitet, og påvirke tilbøjelighed til at forårsage kræft. Akkumulerende undersøgelser har udforsket sammenhængen mellem fælles polymorfier i

NBS1

og menneskelige kræftformer risikerer [19-22]. For eksempel har en af ​​de mest almindeligt undersøgte polymorfier rs1805794G /C er blevet undersøgt i forbindelse med modtagelighed for forskellige cancertyper [22-24]. Endvidere SNP’eme rs2735383C /G i 3′-UTR af

NBS1

kan påvirke bindingsevne microRNA, således kan påvirke genets ekspression [22, 23]. Men begrænsede oplysninger er blevet rapporteret, om sammenhængen mellem disse fælles

NBS1

polymorfier og risikoen for CRC i kinesiske befolkning. Derfor vi hypotese, at fælles polymorfier af

NBS1

gen kan associere med risiko for CRC.

På baggrund af disse hypoteser, vi udførte to hospitalsbaserede case-kontrol undersøgelser for at vurdere de mulige indflydelse af fælles polymorfier (rs1805794G /C, 31129G /A, 924T /C og rs2735383C /G) på CRC risiko i kinesiske befolkning.

Materialer og metoder

Undersøgelse emner

Alle personer var genetisk ubeslægtede etnisk homogene Han-kinesere, og de støtteberettigede deltagerne var 21-90 år ved ansættelsen i undersøgelsesperioden. For opdagelsen sæt, diagnosticeret i alt 763 patienter CRC og 892 kontroller frekvens-matchede til sagerne med hensyn til alder (± 5 år), køn og boligområde blev fortløbende rekrutteret fra Folkets Hospital i Yichun City (Yichun, Kina) og Kina-Japan Friendship Hospital (Beijing, Kina). For validering, 313 CRC patienter og 371 kontroller frekvens-matchede til sagerne med hensyn til alder (± 2 år), køn og boligområde blev fortløbende indskrevet fra Kina-Japan Friendship Hospital (Beijing, Kina). Blandt støtteberettigede deltagere, rekruttering satser var omkring 95% for patienter og ca. 81% for kontrol. Alle patienter havde ikke modtaget nogen kemoterapi eller strålebehandling, og der var ingen alder, stage, eller histologiske restriktioner. Tumor iscenesættelse og patologiske type blev evalueret i henhold til amerikanske Blandede 2002 om kræft iscenesættelse system. Erhvervsfrekvensen for kontroller var 89%. De kliniske karakteristika for alle patienter og kontrol af opdagelsen sæt og validering sæt er anført i tabel 1. På rekruttering, blev hver deltager planlagt til et interview med en epidemiologisk spørgeskema efter at have givet en skriftlig informeret samtykke og forudsat om prøve 5ml blod til DNA-analyse . Den epidemiologiske Spørgeskemaet omfattede demografiske data, detaljerede oplysninger om rygning og alkoholforbrug, familie historie af kræft og så videre. Denne undersøgelse blev godkendt af Medical Ethics Committee af Folkets Hospital i Yichun City og Medicinsk etiske komité i Kina-Japan Friendship Hospital i Beijing City.

Genotypning analyse

Baseret på muligheden for funktionel ændring af

NBS1

SNPs i genomet sammenhæng, fire

NBS1

SNPs (924T /C i 5′-UTR, rs1805794G /C i exon 5, 31129G /A i exon 10 og rs2735383C /G i 3′-UTR) tidligere rapporteret i forbindelse med sygdom resultater, herunder kræft blev udvalgt og analyseret [22, 25]. Genomisk DNA blev isoleret fra perifere blodprøver for hver undersøgelse emne ved hjælp af Blood Genome DNA Extraction Kit (Takara, Dalian, Kina). Disse fire

NBS1

SNPs blev genotype af allel-specifik MALDI-TOF massespektrometri (Sequenom, San Diego, CA) som beskrevet før [26, 27] uden kendskab til den fag status. at bekræfte genotypebestemmelse resultater fra massespektrometrisk analyse, valgt Også vi tilfældigt 100 prøver til direkte sekventering, og resultatet var 100% overensstemmende.

Konstruktion af reporterplasmider Salg

Da en signifikant association blev observeret for polymorfi rs2735383C /G og CRC risiko blev to reporter plasmider indeholdende rs2735383G eller rs2735383C allelen konstrueret til at vurdere effekten af ​​denne polymorfi på dens genekspression

in vitro

. Den fulde længde af human

NBS1

3′-UTR flankerende SNP rs2735383 polymorfisme blev syntetiseret ved den Genewiz Company og blev derefter klonet ind i psi-CHECK2 Basic Vector (Fig 1A). De to resulterende konstruktioner psi-CHECK2-

NBS1

-rs2735383C og psi-CHECK2-

NBS1

-rs2735383G var alle re-sekventeret for at bekræfte sekvensen og integritet hver konstruktion s skær.

luciferaseaktiviteten af ​​rs2735383 variant allel på luciferase reporter bærer

NBS1

3′-UTR cotransficeret med eller uden HSA-mIR-509-5p efterligner eller HSA-mIR-509-5p inhibitorer i HCT116-celler (A) og HT-29-celler (B). Renilla luciferaseaktivitet blev målt og normaliseret til ildflueluciferase. Seks gentagelser blev udført for hver gruppe, og eksperimentet blev gentaget mindst tre gange. Data er gennemsnit ± standardfejl af middelværdien; **

P

0,01. (C)

NBS1

mRNA-ekspression niveau i tumor vævsprøver fra kolorektal cancer personer med forskellig rs2735383 variant alleler genotype (11 rs2735383GG, 13 rs2735383GC og 5 rs2735383CC); data er gennemsnit ± standardfejl af middelværdien, normaliseret til

GAPDH

,

P

= 0,027. (D) HSA-miR-509-5p mRNA-ekspression i 29 kolorektal cancer væv grupperet efter rs2735383 C /G genotyper. HSA-MIR-509-5p mRNA-ekspression blev beregnet i forhold til ekspression af

U6

mRNA. Dataene er gennemsnit ± standardfejl af middelværdien,

P

= 0,345.

Forbigående transfektioner og luciferaseassays

Fordi den vigtige rolle, 3′-UTR i gen, vi forudsagde rs2735383C /G polymorfi i 3′-UTR af vores bioinformatik analyse (https://snpinfo.niehs.nih.gov/). Resultatet viste, at konvertering fra C til G i 3′-UTR rs2735383 polymorfi forårsage nye bindingssted microRNA HSA-miR-629, har-miR-499-5p, og har-miR-509-5p. Transient transfektion-assayet, humane colorektale cellelinier, nemlig HCT116 og HT-29 blev podet med 1 × 10

5 celler per brønd i plader med 24 brønde (BD Biosciences, Bedford, MA). Luciferase assays blev udført som tidligere [28] beskrevne. For luciferaseaktivitet analyse, 800 ng psi-CHECK2-

NBS1

3′-UTR vektorer blev cotransficeret med 40pmol microRNA efterligner (HSA-miR-629, HSA-miR-499-5p og HSA-miR-509 -5p) og med eller uden 40pmol inhibitorer af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Efter transfektion i 24 timer blev celler opsamlet og renilla luciferase aktiviteten blev målt med Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI) (Promega). Tre uafhængige forsøg blev udført for hver plasmid konstruktion.

Kvantitative Real-Time PCR (QRT-PCR)

29 CRC væv med forskellige rs2735383 genotyper blev udsat for at undersøge sammenhængen mellem

NBS1

mRNA-niveauer og rs2735383C /G polymorfi. Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol Reagent (Invitrogen Inc., USA) og vendes transkriberet til cDNA under anvendelse af oligo-dT primer. Vi udførte ABI Prism 7500 sekvens detection system til at evaluere

NBS1

GAPDH

mRNA-niveauer baseret på SYBR-Green metode. Sidstnævnte blev anvendt som en intern kvantitativ kontrol og

NBS1

udtryk niveau blev normaliseret til

GAPDH

. Den TaqMan MicroRNA Analyser (Applied Biosystems) blev anvendt til at påvise HSA-miR-509-5p udtryk ifølge producenternes protokol og det universelt udtrykte

U6

lille nukleare RNA blev anvendt til en intern kontrol.

Statistisk Analyse

forskellene i frekvensfordelingen af ​​udvalgte demografiske variabler samt rs2735383C /G allel og genotyper mellem cases og kontroller blev vurderet af chi-square test. Den Hardy-Weinberg ligevægt (HWE) af kræft-fri kontrol genotype distributioner blev testet af en goodness-of-fit chi-square test. Styrken af ​​sammenhængen mellem rs2735383C /G polymorfi og CRC kræftrisiko blev estimeret ved odds ratio (OR) med 95% konfidensintervaller (CIS) hjælp ubetinget logistisk regression og justeret for alder og køn. Gruppens sammenligning blev analyseret af t-test (to-sidet). Stratificeret analyse blev også udført af undergrupper af alder, køn eller andre karakteristika (rygning status, alkoholindtagelse status, BMI, scene og slægtshistoriske) at evaluere de stratum variable-relaterede yderste periferi blandt de

NBS1

genotyper. En-vejs ANOVA blev anvendt til at vurdere forskellene i luciferase reporter aktivitet og virkningen af ​​rs2735383C /G på

NBS1

udtryk blandt CRC patienterne. Den statistiske styrke blev beregnet ved hjælp af PS Software (https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize). Alle tests var to-sidet ved hjælp af SAS-software (version 9.1, SAS Institute, Cary, NC). Statistisk signifikant niveau blev defineret som

P

. 0,05

Resultater

genotyper og CRC risiko

I undersøgelsen, vi genotype fire fælles polymorfier ( rs1805794G /C, 31129G /A, 924T /C og rs2735383C /G) af

NBS1

gen i 1076 CRC patienter og 1263 raske kontrolpersoner. Genotypefrekvenserne af disse polymorfier i kontroller var i overensstemmelse med HWE (

P

0,05 for alle). Genotypen fordelinger af

NBS1

polymorfier af tilfældene og kontroller i opdagelsen og validering sæt er vist i tabel 2. Der blev set en signifikant sammenhæng med CRC risiko for rs2735383C /G, men ikke for andre polymorfier i to populationer (

P

10

-4 til rs2735383C /G i opdagelsen sæt og

P

= 0,039 for rs2735383C /G i valideringen sæt). Som vist i tabel 2, personer med rs2735383CC genotyper var statistisk signifikante højere risiko end de luftfartsselskaber med rs2735383GG + GC genotyper (justeret OR = 1,52; 95% CI = 1,20-1,99,

P

10

-4 for opdagelsen indstillet og justeret OR = 1,60; 95% CI = 1,11-2,37,

P

= 0,025 for validering sæt). Desuden blev der observeret signifikant sammenhæng mellem rs2735383 polymorfier og CRC risiko, når kombineret de to populationer (

P

10

-4).

Vi yderligere udførte de lagdeling analyser at vurdere virkningerne af rs2735383C /G genotyper på CRC risiko efter alder, køn, rygning status, alkoholforbrug og familie historie af kræft i opdagelsen sæt. Som vist i tabel 3, en signifikant øget risiko for CRC forbundet med polymorfismen var mere udtalt blandt undergrupper af drikkende. Sammenlignet med den rs2735383GG og GC genotyper, CC genotype viste en 2,2 gange risiko for CRC i drikkende (OR = 1,70, 95% CI = 1,51-2,88,

P

= 0,004). Men der var ingen statistisk forskel mellem fordelingerne af andre udvalgte variabler og CRC risiko.

Effekt af

NBS1

rs2735383C /G polymorfi på transkriptionel aktivitet

vi konstruerede luciferase reporter vektorer ved hjælp af psi-CHECK2 vektor med enten rs2735383C eller rs2735383G allel og transficere transient HCT116 og HT-29-celler med HSA-mIR-629, HSA-mIR-499-5p, og HSA-mIR-509- 5p henholdsvis. Vi undersøgte, om microRNA har en allel-specifik effekt på

NBS1

udtryk i CRC celler. Resultatet viste, at CRC-celler transient co-transficeret HSA-MIR-509 efterligner og vektorer indeholdende rs2735383C allel faldt betydeligt luciferaseaktivitet, sammenlignet med celler vektorer indeholdende rs2735383G allel (

P

0,05 i HCT116-celler og HT-29-celler, fig 1b). Imidlertid blev ingen signifikant forskel mellem denne polymorfi og transskription aktivitet med HSA-miR-629 og HSA-miR-499-5p i CRC celler. Disse data viste, at rs2735383C /G kan påvirke transkriptionen af ​​

NBS1

ved at påvirke bindingssted microRNA til

NBS1

3′-UTR.

Foreningen af ​​rs2735383C /G polymorfi med

NBS1

mRNA-ekspression

Vi undersøgte endvidere

NBS1

udtryk i 29 CRC væv med forskellig rs2735383C /G genotyper ved QRT-PCR. Som vist i figur 1C, fandt vi, at patienter med rs2735383CC homozygote genotype havde signifikant lavere

NBS1

mRNA-niveauer (gennemsnit ± standardafvigelse: 0,161 ± 0,037) end patienter med GC (0,363 ± 0,047) eller GG ( 0.400 ± 0,050; ANOVA test:

P

= 0,026) genotyper. Endvidere blev QRT-PCR anvendes yderligere at undersøge, om HSA-MIR-509-5p udtrykkes konstitutivt i CRC vævsprøver. Som vist i fig 1D, blev HSA-MIR-509-5p konstitutivt udtrykt i CRC væv; mens der ikke var nogen signifikant sammenhæng mellem baggrunden udtryk for HSA-miR-509-5p og

NBS1

rs2735383C /G genotyper i tumorvæv indsamlet fra CRC patienter (

P

= 0,345).

diskussion

CRC carcinogenese er multifaktoriel. Ikke kun miljømæssige risikofaktorer, men også genetiske faktorer kan spille en væsentlig rolle i ætiologien af ​​CRC. I dette hospital-baseret case-kontrol undersøgelse, undersøgte vi rollen som fire almindelige

NBS1

SNPs i modtageligheden for CRC i kinesiske befolkningsgrupper. Vi fandt, at HSA-MIR-509-5p kan binde tæt til 3′-UTR af

NBS1

indeholdende rs2735383C allel, negativt regulering af

NBS1

. Endvidere i de følgende lagdelte analyser, viste det sig, at en høj risiko effekt af denne polymorfi var især tydelig blandt undergrupper af drikkende.

NBS1

er en vigtig regulator, der deltager i DSB reparation ved at dirigere MRN proteinkompleks til de steder, hvor DNA-skader og stimulere sit DNA binding og nukleaseaktivitet. De vigtigste funktionelle domæner i

NBS1

i DNA-skader reaktioner omfatter den konserverede forkhead-associerede (FHA) domæne og brystkræft carboxyterminale (BRCT) domæne, som er vigtige i anerkendelse og reparation af afvigende DNA [ ,,,0],29-31]. Talrige rapporter har understreget potentielt afgørende rolle

NBS1

, en vigtig del af MRN-komplekset, i at bevare genomisk stabilitet og forhindre tumorigene processer ved at rekruttere reparation og checkpoint proteiner under DNA pauser [32, 33]. Således mutationer af

NBS1

kan påvirke funktionen af ​​

NBS1

og protein-protein interaktion, og yderligere sandsynligvis øge modtageligheden for kræft. Som en af ​​de mest almindeligt undersøgte polymorfier er rs1805794G /C ligger i BRCT domæne og påvirke dannelsen af ​​en BRCA1-associeret genom overvågning kompleks (BASC) skønt binding til BRCA1, som er ansvarlig for at detektere og reparation af afvigende DNA-strukturer [ ,,,0],29]. Adskillige linjer af studier har undersøgt sammenhængen mellem polymorfi og flere kræftformer [22, 34-37]. Imidlertid er sammenhængen mellem

NBS1

rs1805794G /C variant genotyper og kræftrisiko ikke accordant i forskellige kræftformer og etnisk gruppe. For eksempel, P. Widlak fandt, at rs1805794 variant genotyper ikke var forbundet med modtagelighed CRC i en polske befolkning [37]. Tilsvarende vores nuværende resultater er i overensstemmelse med den ovennævnte undersøgelse, at polymorfi rs1805794G /C ikke er forbundet med risiko for CRC i kinesiske befolkning.

Så vidt vi ved,

NBS1

31129G /A og 924T /C indgår i vores undersøgelse er sjældent blevet undersøgt i humane tumorer [22, 25]. Og vi ikke observere forholdet mellem disse to SNPs og CRC risiko. Som for rs2735383C /G polymorfi, er det placeret i 3′-UTR af

NBS1

gen. Flere undersøgelser har undersøgt rs2735383C /G polymorfi med kræft modtagelighed. En meta-analyse baseret på tretten støtteberettigede undersøgelser, herunder 7561 tilfælde og 8432 kontrolpersoner undersøgt, at der ikke signifikant sammenhæng blev fundet mellem polymorfier i

NBS1

gen og blærekræft [38, 39], brystkræft [40], lymfoide maligne sygdomme [41]. For nylig er det blevet postuleret, at ovennævnte polymorfi rs2735383C /G kan bidrage til udviklingen af ​​risikoen lungekræft. Mere interessant, en anden kinesisk undersøgelse blandt 575 lungekræfttilfælde og 575 kontroller rapporteret, at rs2735383C /G polymorfi ikke var forbundet med modtagelighed for lungekræft [42]. I vores undersøgelse blev rs2735383C /G polymorfi signifikant associeret med CRC risiko. Yderligere lagdeling analyser viste, at den øgede risiko forbundet med variant allel var mere udtalt i drikkevand status. Yderligere funktionel analyse viste, at nucleotidsubstitutioner fra G til C forårsage nye bindingssted microRNA HSA-miR-509-5p og derved påvirke den transkriptionelle aktivitet af

NBS1

i

vitro

, der er i overensstemmelse med de tidligere resultater [24]. Tilsammen tyder disse resultater på, at dynormal udtryk for

NBS1

følge af de genetiske varianter i

NBS1

dermed påvirke NBS1 protein og andre reparerede proteiner interagerer i DNA reparation processer, således kan modulere CRC modtagelighed.

Dette er den første undersøgelse, at vi grundigt undersøgt sammenhængen mellem

NBS1

SNPs og risikoen for CRC. Vi havde en temmelig stor stikprøve for case-kontrol undersøgelse. Den omstændighed, at genotypefrekvenserne blandt kontroller passer Hardy-Weinberg uligevægt lov foreslog tilfældighed af emnet udvælgelse. Og vi har fået en 91% studie effekt (tosidet test, α = 0,05) til at detektere en OR på 1,52 for rs2735383CC genotyper (som fandt sted med en frekvens på 16,14% i kontrollerne) i forhold til de rs2735383GC + GG genotyper i opdagelsen sæt, som kan have forbedret bemærkelsesværdigt af vores fund.

som konklusion, vores undersøgelse tyder på, at polymorfi rs2735383C /G i

NBS1

gen kan være en genetisk modtagelighed faktor for risikoen af CRC i kinesiske befolkning. Desuden ville vores resultater kræver større case-kontrol undersøgelser og veldesignede mekanistiske undersøgelser for at verificere.