PLoS ONE: Ulinastatin Reducerer Resistance af leverkræft Cells til Epirubicin ved at hæmme Autophagy

Abstrakt

Under kemoterapi, resistens forårsaget af autofagi fortsat en stor udfordring for en vellykket behandling af kræftpatienter. Formålet med denne undersøgelse er at vise, at ulinastatin (UTI), en trypsininhibitor kunne reducere modstanden af ​​liver cancerceller for kemoterapeutisk middel epirubicin (EPI). Vi har opnået denne konklusion ved at analysere effekten af ​​EPI alene eller UTI plus EPI på SMMC-7721 og MHCC-LM3 liver kræftceller. Vi genererede også en EPI-resistent leverkræft cellelinje (MHCC-LM3er celler), og fandt, at UTI kunne bevidstgøre de LM3er celler til EPI. Autophagy normalt fungerer til at beskytte kræftceller under kemoterapi. Vores undersøgelse viste, at UTI inhiberede autofagi induceret af EPI i leverkræft celler, som fremmes apoptose, og derfor nedsatte modstanden i cancerceller for EPI. Yderligere undersøgelser viste, at UTI-medieret inhibering på autofagi blev opnået ved at inhibere transkriptionel faktor nuklear faktor-KB (NF-KB) signalvejen. For at bekræfte vores resultater in vivo, vi injicerede MHCC-LM3 liver cancerceller eller EPI-resistente LM3er celler i mus, og fandt, at EPI kun effektivt kunne hæmme væksten af ​​tumor i MHCC-LM3 celle-injicerede mus, men ikke i LM3er celle -injiceret mus. Men når UTI blev også indgivet, væksten af ​​tumoren blev inhiberet i MHCC-LM3er celle-injicerede mus samt. Vores resultater antyder, at UTI kan anvendes i kombination med anti-cancer medikamenter, såsom EPI, at forbedre resultatet af cancerterapi

Henvisning:. Song B, Bian Q, Shao CH, Li G, Liu AA , Jing W, et al. (2015) Ulinastatin Reducerer Resistance af leverkræft Cells til Epirubicin ved at hæmme Autophagy. PLoS ONE 10 (3): e0120694. doi: 10,1371 /journal.pone.0120694

Academic Redaktør: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung University, TAIWAN

Modtaget: 27. september 2014 Accepteret: 26 januar 2015; Udgivet: Marts 27, 2015

Copyright: © 2015 Song et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne modtaget nogen specifik finansiering til dette arbejde

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Autophagy er en vigtig cellulær proces er ansvarlig for nedbrydningen af ​​beskadigede og dysfunktionelle cellulære organeller og proteinaggregater. Dette er en proces konserveret blandt gær-, plante- og dyreceller og er vigtig for tilvejebringelse af energikilder som reaktion på næringsstoffer stress og på kritiske tidspunkter i udvikling [1]. Generelt autofagi er et tumor-suppression mekanisme i normale celler og i starten af ​​oncogen transformation, men kan også fungere som en kritisk overlevelse vej for etablerede tumorer. Udvikling og etablerede tumorer har høje metaboliske krav på grund af øget proliferation og høje apoptotiske tærskler. I dette tilfælde autofagi tjener som en overlevelse mekanisme i mange tumorceller, så de kan undslippe apoptotisk død i respons på metabolisk krise. Mange anti-cancer medicin er designet til kemisk efterligne næringsstof afsavn og sult, men autofagi ofte opreguleret i respons på behandlingen ved at fjerne den beskadigede organel at undslippe døden, og genererer derfor terapeutisk modstand [2-4]. Det er blevet vist, at ved at øge produktionen af ​​reaktive oxygenspecies i mitokondrier, kemoterapeutiske midler, såsom histondeacetylaseinhibitorer [5] og cisplatin [6] inducerer autophagy, og i mange tilfælde, den autophagic reaktion på disse behandlinger er cyto-beskyttende [ ,,,0],5]. For nylig er det blevet foreslået, at ved at kombinere med midler, der afbryder autofagi, kan effektiviteten af ​​anticancerlægemiddel forbedres [5].

Ulinastatin (UTI) er et glycoprotein, der indeholder glycosaminoglycaner og N-forbundne glycaner . Det hæmmer aktiviteterne i en lang række enzymer, herunder trypsin, chymo-trypsin, kallikrein, plasmin, etc [7]. Klinisk UTI hovedsageligt anvendes til behandling af akut pancreatitis, kronisk tilbagevendende pancreatitis og akut kredsløbssvigt [8, 9]. Nylige undersøgelser har vist, at UTI hæmmer væksten af ​​mange typer af cancer, herunder gastrointestinal cancer og brystcancer, og kan inducere celledød, hvis den bruges sammen med andre terapeutiske midler [10-12]. I vores indledende undersøgelser, blev UTI sig at have inhiberende virkning på autofagi. Da autophagy spiller en vigtig rolle i resistens i mange typer af cancerceller [13, 14], hypotese, vi derfor, at UTI kan reducere resistens i kræftceller ved at hæmme autofagi.

Epirubicin (EPI) er et antracyklin stof er meget udbredt i kræft kemoterapi [15]. Den opnår behandlingen ved at inducere apoptose i cancerceller. Men i det mindste i MCF-7 brystcancerceller, EPI inducerer, også autofagi der beskytter cancercellerne ved at forårsage drug-resistens [15]. I denne undersøgelse undersøgte vi virkningen af ​​UTI på autofagi induceret af EPI i lever cancerceller. Vi genererede en EPI-resistente leverkræft cellelinier (MHCC-LM3er celler) og studerede reguleringen af ​​autofagi i disse celler. Vi undersøgte også effekten af ​​UTI på autofagi og resistens i disse cancerceller, og verificeret resultaterne i vivo. Det har vist sig, at UTI undertrykt autofagi induceret af EPI, hvilket blev opnået ved at inhibere transkriptionel faktor nuklear faktor-KB (NF-KB) signalvejen. Vore data antyder, at UTI kan anvendes som et terapeutisk middel til at bistå kræftbehandling ved at reducere lægemiddelresistens i cancerceller.

Materialer og metoder Salg

Antistof, cellelinier, plasmider og andre materialer

Mouse anti ACTB, kanin anti p-IKKα, p-Nemo antistoffer (Santa Cruz, USA) blev anvendt ved 1: 200 fortynding. Kanin anti LC3, muse-anti IKKα, muse anti Nemo, og kanin anti PARP, ATG5, ATG7, SQSTM1, BECN1 antistoffer (cellesignalering, USA) blev anvendt ved 1: 1000 fortynding. HRP-mærket kanin anti mus EnVision mærkningsordning var fra Shanghai Changdao Biotech Inc.

Liver cancer cellelinjer SMMC-7721 og MHCC-LM3, og normale leverceller var gaver fra Second Military Medical University, Shanghai. PcDNA3.1-GFP-LC3 blev opnået fra Eastern Lever Surgery Hospital, Second Military Medical University, Kina. De cancer cellelinjer, der anvendes i undersøgelsen blev købt fra Cell Bank of Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences, Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, hvor de blev præget af celle vitalitet afsløring, DNA-fingeraftryk, isozym afsløring og mycoplasma detektion. Disse cellelinier blev straks udvidet og fryses, så de kunne genstartes hver 3 til 4 måneder fra en frossen hætteglas med samme parti af celler.

EPI (Eastern Lever Surgery Hospital, Second Military Medical University, Kina) blev anvendt i en koncentration på 2,5 uM. UTI (Techpool Bio-pharma, Guangdong, Kina) blev anvendt i en koncentration på 1000 U /ml. Pyrrolidindithiocarbamat (PDTC) (Beyotime Inc., Shanghai, Kina) blev anvendt i en koncentration på 10 uM. Chloroquin (CQ, 10 uM) og 3-methyladenin (3-MA, 10 mM) (Sigma-Aldrich, USA) blev anvendt til inhibering af autofagi. Musene blev opretholdt og plejes i overensstemmelse med universitetets retningslinjer og Animal Brug protokoller blev godkendt af den etiske Boards i det østlige Lever Surgery Hospital.

Cell Culture, transfektion, Cell Growth Bestemmelse og Generation of Drug-Resistant MHCC-LM3 cellelinie

Alle leverkræft celler blev dyrket i DMEM med 10% FBS ved 37 ° C i en CO 7%

2 inkubator, og transficeret med Lipo2000 (Genechem Inc., Korea) ved sammenløbet af 60-70%. Cellevækst blev bestemt med et MTS (Promega, USA) ved at følge fabrikantens instruktioner. Drug-resistente MHCC-LM3 cellelinje blev genereret som tidligere [15] beskrevet. Kort fortalt blev MHCC-Lm3 Celler podet i dyrkningskolber og fik lov til at nå -80% konfluens i frisk medium før behandling med EPI. Startdosis af EPI var 0,05 uM, og hvert af de følgende dosis var 25-50% højere i koncentration end den tidligere dosis, indtil cellerne var stabile i proliferation uden væsentlig celledød.

Real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret med RNeasy Mini kit og QIAshredder (Qiagen), og den første streng cDNA blev syntetiseret med First-Strand cDNA Synthesis kit (Abigen Biotechnology Co. Ltd.) ved at følge producentens anvisninger. Real-time PCR blev udført med LightCycler 1.5 (Roche) ved at følge fabrikantens protokol, og de følgende primere blev anvendt: til Beclin1: 5′-GGCTGAGGGATGGAAGGGTCTAAG-3 ‘og 5′-GTTTCGCCTGGGCTGTGGTAAGTA-3′; for Atg5: 5’-ATGACAGATGACAAAGATG-3 ‘og 5′-CTCATAACCTTCTGAAAGTG-3′; for At g7: 5’-ATGGGGGACCCTGGACTGG-3 ‘og 5′-GCAGAGTCACCATTGTAG-3′; for P62: 5’-ACTGATGGCTGTAACGGTCTA-3 ‘og 5′-GGAAGCAGATGGCACAGAGG-3′; og for GAPDH:. 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘og 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’

Apoptose Assay

Celler vaskes med kold PBS blev resuspenderet i bindingspuffer (Beyotime Inc. , Shanghai, Kina) og derefter suppleret med 2 pi Annexin-V-FITC (20 pg /ml) før de analyseres ved flowcytometri.

autofagi assays Salg

Celler ved 70-80% konfluens blev transficeret med pcDNA3.1-GFP-LC3 med Lipo2000. Cellerne blev derefter observeret under fluorescensmikroskop og cellerne med mindst 3 grønne prikker blev anset autophagic celler. Procentdelen af ​​autofagi = autophagic celler /totale celler x 100%. Til observation under elektronmikroskop, blev cellerne vasket med PBS pelleteret og cellepelleten blev fikseret i 2,5% glutardialdehyd og 1% osmic syre i 2 timer. Efter vask, pelleten blev dehydreret og indlejret i epoxyharpiks. Den ultratynde snit (45 nm) blev farvet med blyacetat, og de farvede sektioner blev observeret under JEM-2000EX elektronmikroskop [16]. At overvåge autophagic flux blev tandem mRFP-GFP-LC3 adenovirus-konstruktion opnået fra Hanbio Inc (Shanghai, Kina) anvendes i denne undersøgelse. Den udstillede grønt fluorescerende protein (GFP) og rødt fluorescerende protein (RRP) påberåbt sig forskellige følsomhed pH til at overvåge progression fra autophagic flux. Kort fortalt mRFP-GFP-LC3 konstrukt udnyttet pH forskellen mellem den sure autolysosome og den neutrale autophagosome at overvåge progression fra autophagosome til autolysosome ved hjælp af konfokal mikroskopi [17].

xenograft i nøgne mus

Male nøgne mus (4-6 uger gamle og 15-20 g i vægt, købt fra Institute of Material Medicinsk i Shanghai, kinesiske Academy of Medical Sciences) blev fastholdt på 25 ~ 27 ° C med 45 ~ 50% luftfugtighed . Nøgne mus blev opretholdt og plejes i overensstemmelse med universitetets retningslinjer og Animal Brug protokoller blev godkendt af den etiske Boards i det østlige Lever Surgery Hospital. MHCC-LM3 celler og MHCC-LM3er lægemiddelresistente celler blev høstet og resuspenderet i PBS ved 5 × 10

6 celler /0,2 ml PBS. For hver mus blev 200 pi af cellesuspensionen injiceres under huden på højre skulder. EPI (5 mg /kg) og UTI (20000 /mus) blev injiceret i tumoren hver 3 days.30 dage senere blev musene aflivet for yderligere forskning. De tumor størrelser blev beregnet ved hjælp af formlen V = ab

2/2 (a: længste diameter af tumoren, b: korteste diameter)

RESULTATER

UTI Forhindrer Autophagy induceret. af EPI

EPI er blevet rapporteret at inducere autofagi i brystkræftceller og forårsager resistens over for lægemidler [15]. At verity hvis det har den samme virkning i lever kræftceller, vi behandlede SMMC-7721 celler med EPI ved forskellige koncentrationer til at bestemme det område, EPI effektivt kunne fremkalde autophagy [15, 18]. Som vist i fig 1A, autofagi steg i et EPI koncentrationsafhængig måde. Baseret på dette resultat, valgte vi en moderat koncentration på 2,5 uM til efterfølgende undersøgelser. Dernæst kontrolleres vi, at uanset om EPI induceret autophagy i andre liver kræftceller. EPI kunne markant øge autophagy i SMMC-7721, Huh-7 og HCC-LM3 celler og mildt i 97h celler (Fig 1B). Det er blevet vist, at CQ kunne inhibere infusion af autophagosomes og lysosomer, hvilket resulterer i ophobning af autophagosomes og LC3-II-ekspression. I mellemtiden, 3-MA inhiberer klasse I samt klasse III PtdIns3Ks, som er nødvendig for autophagosomes dannelse [16]. Med de to autophagy hæmmere, vi valideret, at EPI kunne styrke hele autophagy processen, herunder autophagosomes og autolysosomes dannelse (figur 1C). Dernæst ønskede vi at vide, om EPI-induceret autophagy kunne hæmmes af UTI. Til dette formål har vi behandlet SMMC-7721 og MHCC-Lm3 celler med EPI eller EPI + UTI, stigningen i LC3-II og fald i SQSTM1 signifikant inhiberet af EPI + UTI behandling, hvilket tyder på, at EPI-induceret autofagi blev inhiberet af tilsætning af UTI (fig 1D). Dette resultat blev yderligere understøttet af den iagttagelse, at ATG7, ATG5 og BECN1 udtryk faldt og SQSTM1 ekspression steg både på mRNA-niveauet (Fig 1E) og proteinniveau (figur 1F) i celler, der behandles med EPI + UTI sammenligning med cellerne er behandlet med EPI alene. I celler transficeret med pcDNA3.1-GFP-LC3, ekspressionen af ​​GFP-LC3 (grønne prikker) blev også reduceret signifikant i cellerne, som behandles med EPI + UTI sammenligne med det i cellerne, som behandles med EPI alene (Fig 1G ). Endvidere sammenligning med cellerne, der behandles med EPI, idet mængden af ​​autophagic vesikler i celler behandlet med EPI + UTI blev også reduceret signifikant som observeret under elektronmikroskop (figur 1H). For yderligere at bekræfte funktionen af ​​UTI på autophagic flux, tjekker vi antallet af autophagosomes og autolysosomes i MHCC-LM3 celler behandlet med enten EPI eller EPI + UTI, UTI kunne reducere autophgic flux (Fig 1I). Samlet set viser disse resultater antyder kraftigt, at UTI inhiberer EPI-induceret autophagy i lever cancerceller.

(A) Ekspressionen af ​​LC3-II blev påvist i lysater af SMMC-7721 celler behandlet med forskellige doser af EPI. (B) Den LC3 niveau blev detekteret i forskellige liver cancer celler behandlet med EPI (2.5μM) eller ikke i 24 timer. (C) Western blot viste niveauet af LC3-II i SMMC-7721 celler behandlet med EPI (2.5μM) med /uden CQ (10 uM) /3-MA (10 mM) på forskellige tidspunkter. (D) viste molekyler blev detekteret med immunoblots i SMMC-7721 og MHCC-Lm3 celler behandlet med EPI /EPI + UTI angivne antal gange. (E) Real-time PCR viser mRNA’erne niveauer af autophagy gener i MHCC-LM3 og SMMC-7721 celler behandlet med EPI eller EPI + UTI. (F) Western blot viser proteinniveauer af Autophagy-relaterede gener i MHCC-LM3 og SMMC-7721 celler behandlet med EPI /EPI + UTI i 24 timer. (G) EPI /EPI + UTI blev tilsat til MHCC-Lm3 celler i 24 timer efter GFP-LC3 transfektion. Øverste panel, GFP-LC3 farvning; nederste panel, graf viser den del af autophagic celler. (H) elektronmikrografi af autophagic vesikler i MHCC-Lm3 celler behandlet med EPI + EPI + UTI. De forstørrede billeder i høj opløsning af de firkantede områder blev vist. (I) MHCC-Lm3 celler inficeret med GFP-mRFP-LC3 adenovirus i 24 timer, derefter behandlet withEPI /EPI + UTI. Repræsentative billeder og grafer blev vist. Forsøget blev gentaget 3 gange. (* P 0,05, ** P 0,01).

UTI Fremmer apoptose induceret af EPI

Som en kemoterapi stof, EPI eliminerer cancerceller ved at inducere apoptose [19]. Da vi har vist, at UTI hæmmer autofagi fremkaldt af EPI, vi har mistanke om, at UTI også kunne fremme kræft apoptose i disse celler. For at finde ud af, om UTI har nogen effekt på apoptose induceret af EPI, vi først kontrolleres, om kombinationen af ​​EPI og UTI kan forårsage toksisk virkning i normal lever celle. Som vist i figur 2A, var der ingen signifikant forskel i Surviving satserne mellem EPI gruppe og EPI + UTI gruppe, hvilket antyder, at EPI + UTI ikke ville forårsage mere celledød på normale leverceller. Dernæst undersøgte vi mængden af ​​de SMMC-7721 og MHCC-LM3 leverkræft celler behandlet med EPI eller EPI + UTI, og fandt, at celle numre blev faldt betydeligt, hvis begge EPI og UTI blev tilsat (figur 2B). Spaltningen af ​​PARP, en indikator for apoptose, blev også forøget i celler behandlet med EPI + UTI sammenligning med den i celler behandlet med EPI alene (Fig 2C). Desuden behandles med EPI + UTI resulterede i nedsat niveau af apoptoseinhibitor Bcl-2 og forøgede spaltning af caspase-3 (Fig 2D). I støtter dette resultat, viste Annexin V-farvning, at procentdelen af ​​celler undergik apoptose var højere i celler behandlet med EPI + UTI (fig 2E). Tilsammen disse resultater tyder på, at UTI fremmer apoptose, når det anvendes i kombination med EPI, og kan potentielt øge effektiviteten af ​​EPI i kræftbehandling.

(A) Procentdelen af ​​overlevende L02 celler behandlet med EPI /EPI + UTI /UTI. (B) Procentdel af overlevende SMMC-7721 og MHCC-Lm3 liver cancer celler under behandlingen af ​​EPI /EPI + UTI /UTI for angivne tider. (C, D) Western blot af angivne molekyler blev vist i SMMC-7721 og MHCC- LM3 leverkræft celler under behandlingen af ​​EPI /EPI + UTI (behandling i D i 24 timer). ACTB blev blottet som en loading kontrol. (E) ANNEXIN V-farvning viser procentdelen af ​​celler undergik apoptose under behandlingen af ​​EPI /EPI + UTI for angivne tider. Venstre panel var gennemsnitlige resultat af 3 eksperimenter; højre panel var repræsentativt resultat. Resultaterne er gennemsnit på 3 uafhængige forsøg, (* P 0,05, ** P 0,01).

UTI Fremmer EPI-induceret apoptose i leverkræft Cell ved at hæmme Autophagy

Autophagy spiller uundværlige beskyttende roller i EPI-induceret celledød i cancerceller [15, 20]. Vel vidende, at UTI fremmer apoptose induceret af EPI, vi ønskede at vide, om dette blev opnået ved at hæmme autofagi der også blev induceret af EPI. Til dette formål frembringes vi et EPI-resistent cellelinje LM3er ved at anvende lavdosis EPI til celledyrkningsmedier over en tidsperiode (se Materialer og fremgangsmåder). Til både MHCC-LM3er celler og de ikke EPI-resistente (MHCC-LM3) kontrolceller, tilføjede vi EPI og fundet, at antallet af overlevende MHCC-LM3er celler var større end den af ​​de MHCC-Lm3 celler, og færre MHCC- LM3er celler undergik apoptose end kontrolcellerne (figur 3A). Dette resultat viste, at EPI-resistente celler (MHCC-LM3er) bedre blev beskyttet mod EPI-induceret apoptose. For at finde ud af, om modstanden mod EPI skyldtes øget autophagic aktivitet i MHCC-LM3er celler undersøgte vi den basale udtryk for flere autofagi markører og fandt, at i MHCC-LM3er celler, mRNA niveauerne af ATG7, ATG5 og BECN1 var højere end at i kontrolceller (fig 3b). Vi undersøgte også de basale niveauer af flere autofagi-relaterede proteiner, og fandt, at niveauerne af LC3-II, ATG7, ATG5 og BECN1 steg i MHCC-LM3er celler så godt, mens niveauet af SQSTM1 faldt (figur 3C). Fluorescens mikroskopi viste også, at en sammenligning med kontrolcellerne, var der flere autophagic celler i MHCC-LM3er gruppe (figur 3D). Desuden under elektronmikroskop, fandt vi flere autophagic vesikler i MHCC-LM3er celler (Fig 3E). Således antyder disse resultater, at EPI-resistente MHCC-LM3er celler har højere basal autophagic aktivitet end i kontrolceller. Desuden fandt vi, at MHCC-LM3er celler kunne modstå EPI-induceret celledød sammenligne med MHCC-LM3 celler, og hæmning af autophagy med 3-MA kunne helt blokere modstand MHCC-LM3er celler til EPI. De tilsvarende resultater blev også opnået, når UTI blev anvendt (fig 3F og 3G). Dette resultat tyder stærkt på, at UTI fremmer EPI-induceret apoptose i lever kræftceller ved at hæmme autofagi.

(A) Procentdel af overlevende MHCC-LM3 og LM3er celler under behandlingen af ​​EPI. Lavere panel viste procentdele af Annexin V-positive MHCC-LM3 eller MHCC-LM3er celler. (B) Real-time PCR viste mRNA-niveauer af ATG5, ATG7 og BECN1 i MHCC-LM3 og MHCC-LM3er celler. (C) Western blot af LC3-I, LC3-II, ATG7, ATG5, BECN1 og SQSTM1 i LM3 og LM3er celler. ACTB var en loading kontrol. (D) GFP-LC3 prikker i MHCC-LM3 og LM3er celler. Overpanel, immunfluorescensmikroskopi viste repræsentativt billede af GFP-LC3 prikker, og nederste panel var brøkdel af autophagic celler i MHCC-LM3 eller MHCC-LM3er celler. (E) Electron mikrograf af autophagic vesikler i MHCC-LM3 og LM3er celler. De forstørrede billeder i høj opløsning af de firkantede områder blev vist. (F) Procent af overlevende (øverste panel) og ANNEXIN V-positive celler (nederste panel) i MHCC-LM3 og LM3er celler under behandlingen af ​​EPI /EPI + 3-MA eller EPI /EPI + UTI. Resultaterne er gennemsnit på 3 uafhængige forsøg (* P 0,05, ** P 0,01).

UTI Regulerer Autophagy Ved at hæmme NF-KB signalvejen

NF-KB-signalvejen positivt regulerer autophagy [14, 21, 22]. UTI kunne hæmme aktiveringen NF-KB-signalering pathway [23, 24]. Vi spekulerede derfor, at UTI kan hæmme autofagi i leveren cancerceller ved at undertrykke NF-KB-signalering pathway. For at teste denne hypotese, behandlede vi SMMC-7721 og MHCC-Lm3 celler med EPI alene eller EPI + UTI, og fandt, at aktiviteten af ​​NF-KB blev undertrykt i UTI suppleret celler (Fig 4A). Dette resultat blev støttet af inhibering på phosphorylering af IKK-α og Nemo (Fig 4B). Endvidere fandt vi, at tilsætningen af ​​PDTC, en inhibitor af NF-KB signalvej, til MHCC-Lm3 celler inhiberede phosphoryleringen af ​​IKK-α og ekspressionen af ​​LC3-II (figur 4C). Disse resultater antyder, at UTI inhiberer autofagi ved at undertrykke NF-KB-signalering pathway. For at finde ud af, om tilsætning af de lægemidler, UTI eller PDTC, fremmet epirubicin-induceret apoptose i leveren kræftceller, tilføjede vi EPI, EPI + UTI, EPI + PDTC, eller EPI + UTI + PDTC til SMMC-7721 og MHCC -LM3 liver kræftceller, og observeret lignende procentdel af overlevende celler i EPI + UTI, EPI + PDTC eller EPI + UTI + PDTC suppleret celler. Især var der ingen ekstra effekt på celledød, hvis begge UTI og PDTC tilsættes, hvilket antyder, at både UTI og PDTC fremme apoptose i en samme mekanisme, som er at inhibere NF-KB-signalering pathway-reguleret autofagi (Fig 4D og 4E) .

(A) den relative NF-KB-aktivitet i SMMC-7721 og MHCC-Lm3 celler under behandlingen af ​​EPI /EPI + UTI i 24 timer. (B) Western blots af p-IKK alfa og p-Nemo i sammenligning med samlede proteinniveauer af IKK-a og Nemo henholdsvis i SMMC-7721 og MHCC-Lm3 liver cancer celler under behandlingen af ​​EPI /EPI + UTI i 24 time. ACTB er en loading kontrol. (C) Western blot af p-IKK alpha, total IKK alpha, LC3-I og LC3-II i MHCC-Lm3 celler under behandlingen af ​​EPI /EPI + UTI /EPI + PDTC i 24 timer (D, E) Procentdel af overlevende (D) og annexin V-positive celler (E) i SMMC-7721 og MHCC-LM3 celler under behandlingen af ​​EPI /EPI + UTI /EPI + PDTC /EPI + UTI + PDTC i 24 timer. Resultaterne er gennemsnittet af 3 uafhængige eksperimenter (* P 0,05, ** P 0,01)

UTI fremmer også Apoptose Ved at hæmme NF-KB-signalvejen-induceret Autophagy i Vivo

for at bevise vores ovenfor resultat in vivo injicerede vi MHCC-LM3 eller EPI-resistente MHCC-LM3er celler under huden hos mus (n = 6), og fandt, at indgivelse af EPI kunne inhibere væksten af ​​tumor i MHCC-LM3 celle-injicerede mus, men i mindre grad i MHCC-LM3er celle-injicerede mus. Men når UTI blev administreret, tumorvæksten i MHCC-LM3er celle-injicerede mus blev inhiberet, og vækstraten var sammenlignelig i MHCC-Lm3 celle-injicerede mus (figur 5A og 5B). For at finde ud af, om UTI inhiberede NF-KB-signalering pathway in vivo, vi administreret EPI alene eller EPI + UTI til musene og analyseret aktiviteten af ​​NF-KB signalvejen i tumorerne. Det konstateredes, at sammenligne med kontrolmus, blev niveauet af LC3-II og phosphoryleringer af IKKα og Nemo alle reduceret i tumorerne i mus administreret med både EPI + UTI, hvilket indikerer inhibering af NF-KB-signalvejen (Fig 5C og 5D). Dette resultat antyder, at UTI fremmer apoptose ved at inhibere NF-KB-signalvejen-reguleret autophagy in vivo.

(A, B) Tumorstørrelser (A) og tumorvækst kurve (B) fra mus xenotransplanteret med MHCC-LM3 eller MHCC-LM3er celler (n = 6) behandlet med EPI /EPI + UTI. Vækstkurven blev opnået fra flere målinger af forskellige mus i samme gruppe. (C) Histoimmunochemical analyse viser ekspressionen af ​​p-IKKα og p-Nemo i xenograft mus under behandling af EPI /EPI + UTI. (D) Western blot af p-IKKα og p-Nemo i prøver fra xenograft mus under behandling af EPI /EPI + UTI. ACTB er en loading kontrol. Resultaterne er gennemsnittet af 3 uafhængige forsøg (* P 0,05, ** P 0,01).

DISKUSSION

Uanset kræft type, resistens fortsat en stor udfordring for en vellykket kemoterapeutiske behandling for kræftpatienter [25]. Det er helt klart vigtigt at identificere og udvikle nye terapeutiske strategier for at forbedre resultatet af kræftbehandlingen. Autophagy er et tveægget sværd i kræft, fungerer den som både anti og pro-cancer mekanismer [26]. I leverkræft, kan autofagi beskytte leveren ved at undertrykke inflammation, vævsskader og genom ustabilitet til at hæmme kræft indledning; på den anden side er det nødvendigt for cancer celleoverlevelse og cancerudvikling [26]. Mange nuværende cancerterapier, herunder kemoterapi og strålebehandling-terapi, pålægge metabolisk stress på cancerceller og inducerer autophagy, hvilket igen, beskytte cellerne mod apoptose og forårsage lægemiddelresistens. Derfor kan anvendelsen af ​​autophagic inhibitorer i kombination med terapeutiske midler navnlig forbedre den terapeutiske effektivitet [25, 27].

UTI er en vigtig inhibitor for trypsin, og de seneste undersøgelser har vist, at det fungerer med andre kemoterapeutiske midler at fremme apoptose, hvilket resulterer i inhibering af tumorvækst i det mindste delvis på grund af sin hæmmende effekt på mange signalveje, der er involveret i vækst [10, 11, 28-30]. I vores indledende undersøgelser, fandt vi, at UTI var inhibitor til autophagy, og derfor antaget, at den også kan forbedre cancerterapi ved at inhibere autofagi og reducere modstanden mod kemoterapeutiske lægemidler i cancerceller. Faktisk viste vores data, at i lever kræftceller, UTI hæmmede højde af autofagi fremkaldt af EPI, en udbredt cancer kemoterapeutiske stof. Da det blev anvendt i kombination med EPI, UTI fremmet apoptose i cellerne. Dette resultat antydede, at i leveren cancerceller, UTI alene havde minimal virkning på celleproliferation, men når det blev anvendt sammen med EPI, det forstærkede EPI-induceret apoptose, sandsynligvis ved at inhibere autofagi (Fig 2B). Dette resultat blev yderligere understøttet af den observation, at i EPI-resistente celler, UTI var i stand til effektivt sensibilisere cellerne til EPI ved at hæmme autofagi (figur 3).

Siden NF-KB er rapporteret til positivt at regulere autofagi, vi testede hvis UTI hæmmede autophagy ved at undertrykke NF-KB-signalvejen. Vores resultater viste, at tilsætning af både EPI og UTI til liver cancerceller signifikant inhiberede NF-KB luciferaseaktivitet, og reducerede phosphorylering af IKK-α og Nemo, har et resultat også blevet verificeret af in vivo studier. Disse resultater tyder på, at NF-KB signalvejen hæmmes, når både EPI og UTI anvendes. For at bevise, at undertrykkelsen af ​​NF-KB-signalering pathway vil føre til inhibering af autophagy, vi inhiberede NF-KB-signalvejen ved tilsætning PDTC, en kendt inhibitor af NF-KB-signalvejen, til cellerne sammen med EPI og observeret inhibering af autophagy som forventet. Dette resultat støtter stærkt vores hypotese, at ligesom PDTC, kunne UTI inhibere autofagi ved at inhibere NF-KB-signalering pathway. For yderligere at bevise, at både UTI og PDTC handlede på samme signalvej, snarere end arbejdet selvstændigt at regulere apoptose, tilføjede vi begge PDTC og UTI sammen med EPI for cancerceller, men ikke observere nogen yderligere forøgelse af apoptose aktivitet. Dette resultat støtter kraftigt vores konklusion, at UTI og PDTC ikke virkede synergistisk, og UTI alene var lige så effektivt som PDTC i at hæmme NF-KB signalvej at fremme apoptose.

Autophagy-induceret resistens i cancerceller har været en udfordring at cancerbehandling [31]. Anti-autophagy strategier er blevet anvendt i mange kliniske forsøg registreret med National Cancer Institute i USA i en række forskellige humane cancere [32]. Imidlertid CQ eller HCQ (hydroxychloroquin) blev anvendt til at inhibere infusion af autophagosomes og lysosomer i de fleste kliniske forsøg, er ikke blevet rapporteret anvendelsen af ​​andre autofagi inhibitorer, som kunne begrænse dannelsen af ​​autophagosomes i de kliniske forsøg. UTI er blevet anvendt til behandling af andre sygdomme, såsom akut pancreatitis, og vores resultater har vist, at UTI kunne inhibere EPI-induceret autofagi og fremme apoptose under cancerterapi, sandsynligvis ved at hæmme NF-KB-signalering pathway. EPI er et meget anvendt cancer kemoterapimiddel, men det kan også forårsage drug-resistens ved at inducere autofagi. Vores konklusion indebærer, at UTI kan anvendes i kombination med anti-cancer lægemidler, såsom EPI at forbedre resultatet af cancerterapi. Desuden kan resultaterne også kaste lys på anvendelsen af ​​UTI i andre kliniske områder.