PLoS ONE: Flydende-Flow induceret Wall Shear Stress og Epithelial kræft i æggestokkene peritoneal Spreading

Abstrakt

Epithelial ovariecancer (EOC) er normalt opdaget efter omfattende metastaser har udviklet i bughulen. Den æggestokkene overflade udsættes for peritoneal fluidtryk og forskydningskræfter på grund af de kontinuerlige peristaltiske bevægelser i mave-tarmsystemet, hvilket skaber en mekanisk mikromiljø for cellerne. En

in vitro

eksperimentel model blev udviklet til at eksponere EOC celler til stabil strømning induceret væg forskydningsspændinger væske (WSS). EOC celler blev dyrket fra OVCAR-3 cellelinien på blottede fostervand membraner i særlige brønde. Wall forskydningsspændinger på 0,5, 1,0 og 1,5 dyn /cm

2 blev anvendt på overfladen af ​​cellerne under betingelser, der efterligner det fysiologiske miljø, efterfulgt af fluorescerende pletter af actin og

β

tubulin fibre. Cytoskelettet reaktion på WSS inkluderet celle forlængelse, stress fibre dannelse og generering af mikrotubuli. Mere cytoskeletale komponenter blev produceret af cellerne og anbragt i en tættere og mere organiseret struktur i cytoplasmaet. Dette antyder, at WSS kan have en væsentlig rolle i den mekaniske regulering af EOC peritoneal breder

Henvisning:. Avraham-Chakim L, Elad D, Zaretsky U, Kloog Y, Jaffa A, Grisaru D (2013) væske- flow induceret Wall Shear Stress og Epithelial kræft i æggestokkene Peritoneal Spredning. PLoS ONE 8 (4): e60965. doi: 10,1371 /journal.pone.0060965

Redaktør: Gil Ast, Tel Aviv University, Israel

Modtaget: 18. december 2012; Accepteret: 5 mar 2013; Udgivet: April 10, 2013 |

Copyright: © 2013 Avraham-Chakim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist finansieret af en bevilling fra Israel Cancer Association. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) er den femte hyppigste årsag til kræftdødsfald blandt kvinder, og har den højeste dødelighed-til-sag-forhold på alle gynækologiske maligniteter. Udviklingen af ​​EOC begynder ved overfladen epitel og efterfølges af aggressive proliferation af EOC celler i ovariet. Metastaser af EOC dannes tidligt i sygdomsforløbet ved spredning af EOC celler hovedsagelig i bughulen. Den æggestokkene overflade kontinuerligt udsættes for peritoneal fluidtryk og forskydningskræfter på grund af de tarm peristaltiske bevægelser. Denne mekaniske mikromiljø blev opstillet den hypotese, at være en fremtrædende faktor styrer mønstre af tumor spredning [1], [2].

mekaniske stimuli såsom væg forskydningsspændinger (WSS) viste sig at påvirke mange cellulære processer, som celleproliferation, cytoskelet remodeling, adhæsion og migration i forskellige typer af celler, og bredt undersøgt med endotelceller [3]. Eksperimenter udført med dyrkede cancerceller (fx colon, ovarie, blære, esophageal, melanom) afslørede, at mekaniske stimuli som tryk eller fluidumstrømmen rammer kræftceller ‘adhæsion [2], [4], [5], [6], [ ,,,0],7], [8], migration [4], [9], cadheriner og integriner udtryk [10], [11], invasion kapacitet [11], [12], morfologi [12], [13] og levedygtighed [14 ]. Mange undersøgelser undersøgt effekten af ​​blodgennemstrømningen på adhæsionsegenskaber af cirkulerende metastatiske celler [4], [5], [7], [10], [11], [12], [13], [14]. Men der er hverken

in vivo

heller

in vitro

undersøgelser vedrørende virkningerne af væske flow induceret WSS på EOC celler.

De nøjagtige mekanismer, som EOC celler trænger ind ovariet og spredning i peritoneum er endnu ikke fuldt opdaget. På den anden side er det almindeligt accepteret, at cytoskelettet er det vigtigste cellulære struktur, der kan distribuere mekaniske kræfter i hele cellen for vedligeholdelse af cellestruktur og integritet. Følgelig i denne undersøgelse vi udforskes ændringer i cytoskelettet af humane EOC celler som respons på fluidstrøm induceret WSS under betingelser, der simulerer det fysiologiske miljø i bughulen.

Materialer og metoder Salg

vi udviklede en

in vitro

model af humane EOC-celler ved dyrkning af OVCAR-3 cellelinien på en blottet fosterhinde (AM) ved hjælp af specielle brønde, der kan skilles ad for at tillade instalation af brønden bund med cultued EOC celler i et flow kammer til flydende forsøg, hvor WSS induceres oven på cellerne.

Cell Culture

EOC celler blev dyrket fra cellelinien OVCAR-3 (American Type Culture Collection (ATCC), Virginia, USA). De blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640-medium suppleret med føtalt bovint serum (FBS), 5% natriumbicarbonatopløsning, 1 M Hepes puffer, 25% glucoseopløsning, 100 mM natriumpyruvat opløsning, 10000 U /ml penicillin G og 10 mg /ml streptomycinsulfat med 1250 U /ml nystatin og 4 mg /ml bovint insullin. Cellerne blev først dyrket i plastflasker, og efter at have nået 70-90% sammenflydning (sædvanligvis efter 2-3 dage) blev trypsinbehandlet (Trypsin EDTA 0,25%, opløsning A).

I de strømningsforsøgene dyrket vi EOC celler på det blottede AM, som blev høstet fra sigt placentaer og blottet fra laget af epitelceller, som beskrevet i en tidligere undersøgelse [15]. Det blottede AM er en tyk ekstracellulære membran fremstillet af en avaskulær stroma, der indeholder collagen og fibronectin. Det har store celleadhæsion potentiale, gode mekaniske egenskaber, og dermed er det et passende substrat til dyrkning af EOC-celler for eksponering for fluidstrøm induceret WSS. Brugen af ​​AMS fra menneskelige moderkager blev godkendt af den etiske komité i Tel Aviv Sourasky Medical Center (# 06/376) og donorerne forudsat et skriftligt informeret samtykke. AM blev installeret i specialdesignede brønde, der kan adskilles i underenheder til installation af de dyrkede celler i en test flow kammer, og derefter, re-samles til videre inkubation eller biologiske forsøg [16]. EOC celler dyrket på det blottede AM afslørede den samme kultur udseendet af en sammenflydende lag som den almindelige kultur i plastflasker, som vist i fig. 1. Efter den dyrkede lag af EOC cellerne nåede konfluens på AM (dvs. inden for 5 dage), blev brønden adskilles i underenheder for at muliggøre installation af brønden bunden med de dyrkede celler i strømningskammeret.

(a) i en plastflaske, 3 dage efter såning. (B) På en fosterhinde i særlige brønde, 4 dage efter podning (50 K celler pr). Fasekontrast lysmikroskop. Forstørrelse:. X10

In vitro Anvendelse af Wall Shear Stress på dyrkede celler

En særlig flow kammer blev udviklet til direkte anvendelse af flydende flow induceret WSS på et monolag af dyrkede EOC celler . Kammeret var en 17 cm lang rektangulær ledning med et tværsnit på 28 mm x 1 mm, der er forbundet med en pumpe i et lukket kredsløb (fig. 2a). Strømningskammeret designet til at holde 3 godt bunde med dyrkede celler for at reducere længden af ​​et enkelt forsøg, og for at have flere biologiske prøver til statistisk analyse med et par gentagelser. Pumpen kunne generere stabile flowhastigheder på op til et maksimum på 2,52 l /min (ColeParmer, EW-07.012-20) med et ensartet område forskydningskræfter på cellernes overflade. Vækstmediet af cellerne blev anvendt som fluidet i systemet. Dens dynamiske viskositet blev antaget svarende til den i vand,

μ

= 0,0007 N⋅s /m

2. Pladsen under de godt bottoms inde i strømningskammeret var fyldt med statisk dyrkningsmedium, der var i kontakt med den nedre plan AM i det godt bunden hele eksperimenterne. Forsøgene blev udført i inkubator ved miljøforhold af 5% CO2 og 37 ° C (Fig.2b).

flow kammer kan rumme 3 godt bunde. (B) Tegning af komponenterne i strømningskammeret og Brønden bunde.

Eksperimentel protokol

Størrelsen af ​​WSS i bughulen for meget lav, men ukendte. Nylige beregningsmæssige simuleringer af gastrointestinale modeller forudsagde WSS-værdier i intervallet 0,14 dyn /cm

2 til 11 dyn /cm

2 [16]. Derfor har vi anvendt på dyrkede EOC celler konstant ensartet WSS på 0,5 dyn /cm

2, 1,0 dyn /cm

2 og 1,5 dyn /cm

2 for varigheder på 30 minutter. Vi antog inden for WSS at skyldes laminar strømning, for hvilke Reynolds tal 2000 og følgelig beregnet strømningshastigheden i det lukkede kredsløb ved hjælp af en fremgangsmåde beskrevet før [17]

Et tilsvarende mængde. 50.000 EOC brønd blev dyrket på AM i alle kulturerne i denne undersøgelse anvendte. Alle forsøgene blev udført med godt differentierede EOC celler, der er dyrket i 2-5 dage. Kontrolkulturer for hvert af eksperimenterne blev podet og inkuberet på samme måde som de stressede kulturer, og blev defineret som kulturer under statiske betingelser, mens alle andre betingelser forbliver de samme. Hvert eksperiment blev gentaget 3 gange med 3 godt bunde med dyrkede EOC celler til den statistiske analyse.

Farvning af Cytoskellet Fibers

Immunohistokemiske fluorescerende pletter af β-tubulin og F-actin blev udført for at identificere morfologiske og strukturelle ændringer i cytoskelettet af cellerne. Fiksering af cellerne blev udført ved inkubering af såvel bunde med cellerne i 4% paraformaldehyd-opløsning i 10 minutter ved stuetemperatur (RT) efter fjernelse af mediet. Derefter blev cellemembranen perforering udføres ved at inkubere cellerne i æsel blok, en 5% fortynding af æsel serum (Jackson Immunoresearch, Suffolk, UK) i PBST (PBS med 0,05% Tween 20), i 4-5 timer på en vippe ( 60 RPM) ved stuetemperatur.

p-tubulin fibre blev farvet ved inkubation af cellerne i en 1:500 fortynding af monoklonalt muse-anti-β-tubulin primære antistof, klon 2,1 (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) i donkey blok, i 1 time på en vippe (60 RPM) ved stuetemperatur, og derefter natten over ved 4 ° C. Den følgende morgen blev cellerne vasket 3 gange i 45 minutter med fortyndingsmiddel blok (en 1:03 fortynding af æsel blok: PBST) og inkuberet med det sekundære antistof – æsel Rhodamin anti-muse-sekundært antistof (Jackson Immunoresearch, Suffolk, UK ) – til en 1:400 fortynding i fortynder blok. Cellerne blev inkuberet med det sekundære antistof i 4 timer, på en rocker ved stuetemperatur og derefter vasket igen 3 gange i 45 minutter med fortyndingsmiddel blok. Actin stress fibre blev farvet efter inkubation i 1:1000 fortynding af FITC-mærket Phalloidin (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) i PBS, i 20 minutter på en rocker ved stuetemperatur og derefter vasket to gange med PBS.

efter pletterne blev afsluttet, blev membranerne fjernet og placeret på mikroskop objektglas. Dækglas blev monteret på objektglas ved anvendelse af en enkelt dråbe DAPI + monterings gel (Santa Cruz Biotechnology, Inc via Enco, Petah-Tikva, Israel), som også farves cellekernen. Cellerne blev undersøgt under et Leica SP5 og Zeiss 410 konfokale mikroskoper ved hjælp af en X40 forstørrelsesglas vand målsætning.

Analyse af Cytoskellet Strukturelle Ændringer

Observation af konfokale billeder, efter at eksponere EOC kulturer til WSS afsløret celle forlængelse fra polygonal og afrundet til ellipseformet. Svarende til andre studier [13] karakteriserede vi ellipseform af billedformat som definerer ration mellem de lange og korte diametre af en ellipse. Brug af billeddannende anvendelser af konfokale mikroskoper målte vi disse diametre, der var lodret til hinanden på cellerne billeder (fig. 3). Billedformatet blev beregnet for estimering af niveauet af celleforlængelse med 1,0 repræsenterer en cirkel.

Vurdering af mikrotubuli og stress fibre dannelse blev gjort ved observation. Tre niveauer af stress fibre eller mikrotubuli dannelse blev defineret i henhold til deres udseende i de erhvervede billeder (figur 4.): “Low Level” indikerer, at actin eller β-tubulin blev farvet fremtrædende plads på den kortikale ring af cellen og næsten intet i midten af ​​cellen (fig. 4aa, 4ba). “Intermediate Level” angiver, at det meste fremspring, microspikes og fragmenter af actin- eller β-tubulin var synlige (fig. 4AB, 4BB). “High Level” angiver, at de fleste af cellens centrale område indeholdt stress fibre eller mikrotubuli, med næsten ingen fiber fragmenter og lidt farvning i de perifere områder af cellen (fig. 4ac, 4BC).

(a) lavt niveau, hovedsagelig cortical actin og næsten ingen stress fibre, (b) Intermediate niveau, er nogle fibre dannes, mest i celle fremspring, og (c) højt niveau, de fleste af cellens centrale område er rigeligt med stress fibre. (B) Tre forskellige niveauer af mikrotubuli dannelse: (a) Lavt niveau, for det meste β-tubulin fragmenter og næsten ingen cytoplasmatiske mikrotubuli, (b) Intermediate niveau, nogle mikrotubuli dannet inde i cellen, og (c) Højt niveau, en tæt netværk af mikrotubuli blev genereret inde i cellerne.

Statistisk analyse

en-vejs og to-vejs variansanalyse (ANOVA, SPSS 11.5.1) efterfulgt af en Tukey testen anvendes til at udføre multiple sammenligninger mellem resultaterne opnået efter eksponere EOC celler til forskellige forskydningsspændinger. For resultaterne af stress fibre og mikrotubuli dannelse en chi-square test blev udført, og betydningen af ​​en lineær-by-lineær association blev testet.

Resultater

Den foreliggende undersøgelse demonstrerede de morfologiske ændringer de cytoskeletale fibre af EOC celler dyrket på det blottede AM efter udsættelse for fluidstrømning WSS. Konfokal billeder viste transformation af cellerne forme fra polygonale og afrundede former til ellipsoide former efter 30 min eksponering for WSS (fig. 5A). De lange og korte diametre på 541 celler (dvs. 136, 64, 223 og 118 celler for WSS på 0,0 (kontrol), 0,5, 1,0 og 1,5 dyn /cm

2, henholdsvis) blev målt og deres tilsvarende billedformater var beregnet. Det gennemsnitlige formatforhold er steget med 12,4%, 19,2% og 27,8% sammenlignet med den for kontrollen sammenlignet for celler eksponeret for WSS på 0,5, 1,0 og 1,5 dyn /cm

2. Til statistisk analyse anvendes vi logaritmen af ​​disse numeriske værdier, således at at analysere resultater med en normalfordeling (fig. 5B). Formatforholdet steg betydeligt i forhold til kontrolgruppen som WSS forøget (p 0,001). En væsentlig forskel eksisterer såvel mellem 0,5 dyn /cm

2 og 1,5 dyn /cm

2 grupper, og mellem 1,0 dyne /cm

2 og 1,5 dyn /cm

2 grupper ( p 0,05). Men der er ingen signifikant forskel mellem 0,5 dyn /cm

2 og en dyne /cm

2 grupper selv.

Pilene peger mod repræsenterer celler. (A) Kontrollen kultur, (b) 0,5 dyn /cm

2 kultur, (c) 1,0 dyn /cm

2 kultur, og (d) 1,5 dyn /cm

2 kulturer. (B) Ændring af den logaritmiske værdi af aspektforholdet, der definerer niveauet for celleforlængelse med niveauet af den påførte forskydningsspænding (± standardafvigelse).

Dannelse af en tyk filamentøs netværk af stress fibre blev observeret i celler udsat for forskydningsspænding, sammenlignet med kontrolkulturer, hvor actin var til stede primært i de perifere områder af cellen. Vi observerede dannelsen af ​​stress fibre i 640 celler; 235, 78, 142 og 185 celler for WSS på 0,0 (kontrol), 0,5, 1,0 og 1,5 dyn /cm

2. Repræsentative billeder af actin plet i EOC cellekulturer, der er blevet udsat for forskellige WSS i 30 minutter i forhold til statiske kulturer er vist i fig. 6A. Mere stress fibre blev dannet inden i cellerne cytoplasma som WSS blev forøget (fig. 6B). Generelt procentdelen af ​​celler demonstrerer et lavt niveau af stress fibre dannelse faldet i forhold til kontrolgruppen som WSS øges (dvs. fra 80% i den statiske gruppe sammenlignet med 28,1% i 1,5 dyn /cm

2-gruppe) . Procentdelen af ​​celler med et mellemliggende niveau af stress fibre dannelse steget sammenlignet med kontrolgruppen som WSS forhøjet (dvs. fra 18,3% i den statiske gruppe til 49,2% i 1,5 dyn /cm

2-gruppe). Procentdelen af ​​celler med et højt niveau af stress fibre dannelse stiger generelt i de stressede grupper sammenlignet med kontrolgruppen (dvs. fra 1,7% i den statiske gruppe til 22,7% i 1,5 dyn /cm

2-gruppe). Chi-square test viste, lineær-by-lineær forening for disse resultater var statistisk signifikant (p 0,001), hvilket betyder, at der var en lineær sammenhæng mellem omfanget af WSS og niveauet af stress fibre dannelse og at niveauet af stress fibre dannelse afhang af størrelsen af ​​forskydningsspænding.

(a) Kontrollen kultur (ingen WSS), (b) cellerne eksponeret for WSS på 0,5 dyn /cm

2, (c) celler eksponeret for WSS af 1,0 dyn /cm

2, og (d) celler udsat for WSS på 1,5 dyn /cm

2. (B) Procentdelen af ​​celler i hver af tre niveauer af stress fibre formation, for forskellige niveauer af forskydningsspænding. (C) Den logaritmiske gennemsnit formatforhold celleforlængelse for hvert niveau af stress fibre dannelse (± 2 · standard fejl).

Vi udforskede også forholdet mellem stress fibre dannelse og celle forlængelse. Til denne statistiske analyse, de lange og korte diametre på 221 celler (dvs. 110, 13, 62 og 36 celler for WSS på 0,0 (kontrol), 0,5, 1,0 og 1,5 dyn /cm

2 henholdsvis blev målt og deres tilsvarende sideforhold blev beregnet for hvert niveau af stress fibre dannelse, ignorerer forskydningsspændingen (fig. 6C). en signifikant forskel blev fundet mellem skærmformat af gruppen lave stress fibre dannelse (betegnet “a”), og den mellemliggende og højt niveau grupper af stress fiber dannelse (betegnet “b”), a b (p 0,05). Når man overvejer shear stress samt, samspillet mellem shear stress og stress fibre dannelse (i forhold til deres effekt på billedformat) blev ikke fundet statistisk signifikant (p .. 0,05) Dette resultat tyder på, at effekten af ​​stress fibre dannelse på formatforhold af de aflange celler var uafhængig af niveauet for forskydningsspænding

En tæt og organiseret netværk af cytoskeletale mikrotubuli blev genereret efter udsættelse af cellerne for forskydningsspænding, sammenlignet med tubulin fragmenter og lateral farvning i kontrolkulturer. Vi observerede dannelsen af ​​mikrotubuli i 494 celler; 156, 33, 111 og 194 celler for WSS på 0,0 (kontrol), 0,5, 1,0 og 1,5 dyn /cm

2. Repræsentative billeder af mikrotubuli plet i EOC cellekulturer, der er blevet udsat for forskellige WSS i 30 minutter i sammenligning med statiske kulturer er vist i fig. 7A. Det fremgår, at flere mikrotubuli blev dannet i cytoplasmaet i cellerne som WSS forøget (fig. 7B). Generelt procentdelen af ​​celler demonstrerer et lavt niveau af mikrotubuli dannelse faldet i forhold til kontrolgruppen som WSS forhøjet (dvs. fra 84% i statiske kulturer til 20,6% i 1,5 dyn /cm

2-gruppe). Der var ingen konsistent adfærd for det mellemliggende niveau, som den procentdel af cellerne demonstrerer et mellemliggende niveau af mikrotubuli dannelse oprindeligt steg mellem den statiske og 0,5 dyn /cm

2 grupper (dvs. 16% og 63,6%, henholdsvis), og blev derefter mildt faldt i 1,0 og 1,5 dyn /cm

2 grupper (dvs. 55% og 54,6%, henholdsvis). Procentdelen af ​​celler, der viser et højt niveau af mikrotubuli dannelse steg fra 0% i den statiske og 0,5 dyn /cm

2 grupper til næsten 10% i 1,0 dyn /cm

2-gruppe og over 24% i 1,5 dyn /cm

2-gruppe. Chi-square test fastslået, at lineær-by-lineær forening for disse resultater er statistisk signifikant (p 0,001), hvilket betyder, at der eksisterer et lineært forhold mellem størrelsen af ​​forskydningsspænding og niveauet af mikrotubuli dannelse og at niveauet af mikrotubuli dannelse afhænger af størrelsen af ​​forskydningsspænding.

(a) Kontrollen kultur (ingen WSS), (b) cellerne eksponeret for WSS på 0,5 dyn /cm

2, (c) celler eksponeret for WSS på 1,0 dyn /cm

2, og (d) cellerne eksponeret for WSS på 1,5 dyn /cm

2. (B) procentdelen af ​​celler i hver af tre niveauer af mikrotubuli formation, for forskellige niveauer af forskydningsspænding. (C) Den logaritmiske gennemsnit formatforhold celleforlængelse for hvert niveau af mikrotubuli dannelse (± 2 · standard fejl).

Forbindelsen mellem mikrotubuli dannelse og celleforlængelse blev også evalueret. Til denne analyse er de lange og korte diametre på 191 celler (dvs. 82, 8, 58 og 43 celler for WSS på 0,0 (kontrol), 0,5, 1,0 og 1,5 dyn /cm

2 henholdsvis blev målt og deres tilsvarende formatforhold blev beregnet for hvert niveau af mikrotubuli dannelse, ignorerer forskydningsspændingen (fig. 7C). en væsentlig forskel blev fundet mellem formatforholdene af gruppen lave mikrotubuli dannelse (betegnet “a”), og det mellemliggende og høj niveau grupper af mikrotubuli dannelse (betegnet “b”), a b (p 0,05). Når man overvejer shear stress samt, samspillet mellem forskydningsspænding og mikrotubuli dannelse (i forhold til deres effekt på billedformat) blev fundet statistisk signifikant (p 0,05). Konsekvensen var, at effekten af ​​mikrotubuli dannelse på formatforhold af de aflange celler afhang af niveauet af forskydningsspænding

diskussion

kræft i æggestokkene er den. hyppigste dødsårsag blandt gynækologiske maligniteter og er normalt diagnosticeres på et fremskredent stadium [18]. De overfladen EOC celler udsættes for peritoneal fluidtryk og forskydningskræfter på grund af de peristaltiske bevægelser i mave tarmsystemet, hvilket skaber en mekanisk mikro miljø for cellerne [2], [19]. Mekaniske stimuli såsom WSS er blevet vist at påvirke mange cellulære processer i forskellige typer af celler [3]. Den nuværende arbejde undersøgte effekten af ​​WSS på cytoskeletal ombygning af dyrkede EOC celler. Til dette formål har vi udviklet en ny model for EOC dyrket på det blottede AM, som er en let tilgængelig kollagen- membran og tættere simulerer

in vivo

betingelser, hvor cellerne vokser på ikke-stive substrater. De celler dyrket i den aktuelle undersøgelse voksede som et monolag med den typiske brosten udseende ligner til kulturerne i plastkolber i andre undersøgelser [20].

Resultaterne af den foreliggende undersøgelse viste, at fluidstrøm induceret WSS stimuleret celle forlængelse, stress fibre dannelse og generering af mikrotubuli i EOC-celler. De formatforhold af celler eksponeret for 1,5 dyn /cm

2 signifikant forøget sammenlignet med den 0,5 dyn /cm

2 og 1,0 dyn /cm

2 grupper. Forlængelse og tilpasning af dyrkede celler i strømningsretningen er almindelige virkninger af forskydningsspænding og er blevet bredt undersøgt i endotelceller [21], [22], [23]. I øjeblikket blev dog ikke observeret nogen cellejustering i retningen af ​​strømningen. Dette kan være resultatet af den relativt korte tid af eksponering celler til WSS. Mens celler i den aktuelle undersøgelse blev udsat for WSS i 30 minutter blev celle linie med hensyn til en specifik retning demonstreret i andre celletyper efter 24 timers udsættelse for WSS [21], [22], [23], [ ,,,0],24]. Det skal bemærkes, at forlængelse af cellerne blev rapporteret at forekomme efter meget kortere eksponeringstid forskydningsspænding [13], [23]. Ovennævnte formændring respons af endotelceller til WSS (dvs., strækning og orientering i strømningsretningen) blev antaget celle-specifik, da den ikke blev observeret i glatte muskelceller og nasale epitelceller [25], [26], [27 ]. Den foreliggende resultat kan også være relateret til elasticiteten af ​​fostervand mambrene på hvilken EOC celler blev dyrket. Det er tidligere blevet rapporteret, at cellernes respons, herunder cytoskelet remodeling, afhænger af stivhed og elasticitet deres substrater [28].

En spændende fordeling af actin pletten blev observeret under eksponering for WSS. Statiske kulturer viste tætte perifere bånd af actin mens centrale stress fibre var knappe. Men i celler udsat for WSS en filamentøs netværk af actin blev dannet inde i cellen, der blev lineært relateret til størrelsen af ​​forskydningsspænding. Disse resultater antyder, at shear stress påvirker aktincytoskelet EOC celler. Stress fibre dannelse påvirker også billedformat, men effekten er ikke afhængig af niveauet af forskydningsspænding. Der blev også observeret lignende ændringer i celleform og strukturel organisation i

dyrkede Salg endotelceller, der udkom polygonal med et par stress fibre i statisk tilstand mens celler udsat for WSS udviklet talrige stress fibre og på et senere tidspunkt også aflange [24], [29], [30], [31], [32], [33], [34]. En lignende resultat af WSS induceret actin-tubulin remodeling blev også observeret i metastatiske esophageal cancer-celler [11]. På den anden side, colon carcinomceller udsat for forskydningsspænding på 2,4 dyn /cm

2 i 45 minutter demonstreret nedsat dannelse af actin stress uden forlængelse langs strømningsretningen [35].

Den foreliggende undersøgelse viste dannelsen af ​​cytoplasmatiske mikrotubuli i stressede celler, med frembringelsen af ​​en central, filamentøs netværk af mikrotubuli i forhold til statiske celler, hvori fragmenter af mikrotubuli lokaliseret hovedsagelig perifert. Mikrotubuli dannelse påvirker formatforhold for de stressede celler, og denne effekt afhænger af niveauet af WSS. En lignende resultat af tættere og mere stabiliserede mikrotubuli i cellecytoplasmaet og omkring cellekernen blev også observeret i endotelceller udsat for konstant WSS på 15-20 dyn /cm

2 i 24 timer udviste [22], [36] , [37]. Det er bemærkelsesværdigt, at steady WSS påført på nasal epitelceller induceret mikrotubuli fragmentering, mens oscillerende WSS resulterede i en mere organiseret og filamentøse mikrotubuli netværk i cytoplasmaet, herunder produktion af nye mikrotubuli [17], [25]. I en anden undersøgelse metastatiske øsofageale cancerceller der blev udsat for venøs forskydningshastighed på 200 i 30 minutter udviste hurtig polymerisation og trans-placering af tubulin til forkanten af ​​cellen i modsætning til cortical ring lokalisering under statiske betingelser [12].

Integration resultaterne fra den foreliggende undersøgelse vedrørende de cytoskeletale ændringer indebærer, at eksponering af EOC-celler til WSS kan fremkalde celle bevægelse. Det første skridt i celle motilitet opstår, når cellen udvider fremspring sådanne som filopodia og lamellipodia i retning af det beslutningsforslag ved actin polymerisering på forkant. Mange af cellerne i den foreliggende undersøgelse viste dannelsen af ​​actin fremspring, især i celler, for hvilke der blev observeret et mellemliggende niveau af stress fibre formation (for eksempel i fig. 6A og 6C). Da stress fibre er vigtige for de kontraktile aktiviteter af motile celle, kan produktionen af ​​mere stress fibre cellerne indikerer, at cellen blev trukket frem som en del af motilitet processen. Stress fibre kan også have en vigtig rolle i celle adhæsion til ekstracellulær matrix gennem integriner, der danner de fokale adhæsioner under cellebevægelse. Mikrotubuli og actin-mikrotubuli interaktioner kan også have en vigtig rolle i celle motilitet [38]. Celler behandlet med mikrotubuli depolymerisering midler mister deres polariseret udseende og gøre fremspring samtidigt rundt omkring deres omkreds. Et intakt mikrotubuluscytoskelettet var nødvendig for at opretholde den polariserede fordeling af actin-afhængige fremspring på forkanten af ​​en migrerende fibroblast [39].

Cancer celler dyrket i tredimensionale matricer har vist aflange og afrundede morfologier som følge af mesenchymale og amoeboid migrationer hhv. I den foreliggende undersøgelse var den gennemsnitlige formatforhold af aflange celler demonstrerer et lavt niveau af stress fibre dannelse var signifikant mindre end for celler demonstrerer mellem og høje niveauer af stress fibre formation. Disse resultater kan tyde på, at EOC celler bruger en mesenchymal tilstand af cellemigrering som et resultat af udsættelse for WSS, og derfor forlænges. Aflange celler har fremspringende membran på forkant og danne integrinpositive afhængige sammenvoksninger med underlaget [40]. Desuden inhibering af actin og tubulin polymerisering undertrykker kræft cellemigration, der støtter, at polymerisation af actin og tubulin er afgørende for cellemotilitet [41]. en nylig undersøgelse viste imidlertid, at interferens med actin dynamik er mere effektiv til at inhibere human ovariecancer cellemotilitet end forstyrrelse af mikrotubulus funktion [42]. Dette beviser understøtter vores formodning om, at WSS inducerer celle motilitet i EOC-celler. Denne virkning af WSS kan have et vigtigt bindeled til de processer af sheading og metastatisk spredning af epitelial ovariecancer. Kræft terapi rettet mod mikrotubuli og endeløse actin polymerisering dynamik kunne være en nyttig metode til at hæmme celle kinetik og den deraf peritoneal metastatisk spredning.

Som konklusion nærværende undersøgelse giver for første gang data om cytoskeleton modifikationer i EOC celler udsat for fluidstrøm induceret WSS, som forventes i bughulen. Cytoskelettet reaktion på WSS var klart og markant, især ved højere størrelser af WSS, og omfattede celle forlængelse, stress fibre dannelse og generering af mikrotubuli som er vigtige cellulære komponenter til celle bevægelse. Disse resultater tyder på, at den mekaniske miljø EOC har en vigtig rolle i spredning og spredning, og bør også overvejes for at udvikle terapeutiske redskaber til forebyggelse ovariecancer peritoneal metastaser.