PLoS ONE: Anticancer aktivitet af Apaziquone i Oral Cancer Cells og xenograftmodel: Konsekvenser for Oral Cancer Therapy

Abstrakte

Mundtlige pladecellekræft (OSCC) patienter diagnosticeret i sene stadier har begrænset kemoterapeutiske muligheder hvilket understreger det store behov for udvikling af nye anticancer stoffer til mere effektiv forvaltning sygdom. Vi havde til formål at undersøge anticancer potentiale Apaziquone, [EOquin, USAN, E09, 3-hydroxy-5- aziridinyl-1-methyl-2 (1H-indol-4,7-dion) prop-β-en-α- ol], en pro-drug, der tilhører en klasse af anti-cancer kaldet bioreduktive alkylerende midler, for OSCC. Apaziquone behandling hæmmede celledeling og induceret apoptose i OSCC celler

in vitro

. Apaziquone behandlet OSCC celler viste øget aktivering af caspase 9 og caspase 3, og poly (ADP ribose) polymerase (PARP) spaltning antyder induktion af apoptose med apaziquone i orale cancerceller. Vigtigere, apaziquone behandling reducerede signifikant oral tumor xenograft volumen i immunsvækkede NOD /SCID /CRL-mus uden at forårsage tilsyneladende toksicitet til normale væv. Afslutningsvis vores

in vitro

in vivo

studier identificeret og viste den præ-kliniske effekt af Apaziquone, som en potentiel ny anti-cancer terapeutisk kandidat til kræft i mundhulen management.

Henvisning: Srivastava G, Somasundaram RT, Walfish PG, Ralhan R (2015) Anticancer aktivitet af Apaziquone i Oral Cancer Cells og xenograftmodel: Konsekvenser for Oral Cancer Therapy. PLoS ONE 10 (7): e0133735. doi: 10,1371 /journal.pone.0133735

Redaktør: Pei-Yi Chu, School of Medicine, Fu Jen katolske universitet, TAIWAN

Modtaget: Februar 6, 2015; Accepteret: 30 Juni 2015; Udgivet: Juli 24, 2015

Copyright: © 2015 Srivastava et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. den finansielle støtte af dette arbejde blev leveret af Spectrum Pharmaceuticals Inc. (Irvine, CA). De finansieringskilderne godkendt undersøgelsen design, men havde ingen rolle i dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Forfatterne takker de canadiske Institutes of Health Research for stol i Advanced Cancer Diagnostics (RR), og Alex og Simona Shnaider Chair i kræft i skjoldbruskkirtlen (PGW)

Konkurrerende interesser:. PGW og RR er aktionærer i Proteocyte Diagnostics Inc. Derudover økonomisk støtte til dette arbejde blev leveret af Spectrum Pharmaceuticals Inc. (Irvine, CA). Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Oral pladecellekræft (OSCC) omfatter en stor del af hoved- og halscancer regnskab for en anslået 263.000 nye tilfælde og omkring 127.000 dødsfald på verdensplan hvert år [1]. Tidlige fase (I og II) OSCC patienter behandles med kirurgi og /eller strålebehandling, og har fem-års overlevelse på 70% – 90% [2-4]. Dog lider to tredjedele af OSCC patienter fra loco-regional fremskreden sygdom (fase III og IV) på tidspunktet for diagnosen. Der findes utilstrækkelig data fra randomiserede kliniske studier for at definere en optimal strategi for patienter med trin III og IV OSCC. Patienter med fremskreden eller recidiverende sygdom har begrænset behandlingsmuligheder og en dårlig prognose (5-års overlevelsesrater 50%) [5]. Primær kirurgi og endelig strålebehandling er muligheder for OSCC patienter; både kirurgi og strålebehandling kan have en dybtgående indvirkning på livskvaliteten for overlevende [6, 7].

I de seneste år, anvendelsen af ​​samtidig kemo-strålebehandling har vist sig som et attraktivt alternativ til traditionel kirurgisk forvaltning af avanceret OSCC [8-10]. Det er at bemærke, at kemoterapi har udviklet sig fra palliativ pleje til en central del af helbredende behandling for lokalt fremskreden OSCC. Cisplatin, carboplatin, methotrexat og taxaner er aktive som enkelte midler eller i kombination i recidiverende eller metastatisk OSCC [3, 11-14]. Men dosisbegrænsende toksiciteter i kræftpatienter begrænser deres kliniske anvendelighed. På nuværende tidspunkt er der ingen standard second-line kemoterapi til behandling af tilbagevendende eller metastatiske OSCCs. Monotargeted behandlingsformer såsom inhibitorer af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), signal transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3), nuklear faktor kappa B (NFKB), og pattedyr mål for rapamycin (mTOR) har vist begrænset effekt [15-18 ]. Der eksisterer således et stort behov for udvikling af nye lægemidler til oral cancer. Men opdagelsen af ​​nye forbindelser med potent anticancer aktivitet er en lang og dyr proces. En alternativ fremgangsmåde er udnyttelsen af ​​allerede etablerede lægemidler, som er blevet godkendt til klinisk anvendelse til andre kræftformer.

Apaziquone [EOquin, USAN, E09, 3-hydroxy-5- aziridinyl-1-methyl-2 (1H indol-4,7-dion) -prop- β-en-α-ol] er en pro-drug, der tilhører en klasse af anticancermidler kaldet bioreduktive alkylaing midler, som har gennemgået en omfattende klinisk evaluering for blærekræft [19] . Apaziquone aktiveres af adskillige enzymer, det mest undersøgte enzym er NAD (P) H: quinon oxidoreduktase 1 (NQO1) eller DT-diaphorase, hvilket reducerer apaziquone i en DNA-alkyleringsmiddel [19]. Her i vi undersøgte potentielle anti-tumor aktivitet af Apaziquone i

in vitro

og

in vivo

modeller af oral cancer.

Materialer og metoder

cellelinjer og cellekulturer

Oral planocellulært karcinom cellelinje AMOS III, er blevet oprettet fra betel og tobak tilknyttet menneskelig OSCC af vores laboratorium [20]. AMOS III blev brugt som en

in vitro

in vivo

eksperimentel model for kræft i mundhulen i denne undersøgelse. Andre etablerede OSCC cellelinie, SCC4, er blevet anvendt til at evaluere den bredere anvendelighed apaziquone for potentiel oral cancer terapi af OSCC. Ikke-metastatisk oral cancercellelinie, SCC4, blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Orale cancerceller (AMOS III /SCC4) blev dyrket i Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1 mmol /l L-glutamin og penicillin-streptomycin (1X) i en befugtet inkubator (5 % carbondioxid, 95% luft) ved 37 ° C som beskrevet tidligere [20-22]. Både cellelinierne er blevet testet ved anvendelse korte tandemgentagelse polymorfisme analyse og bliver rutinemæssigt opformeret i vores laboratorium.

In vitro Celleproliferation /cytotoksicitet assay (MTT assay)

evne apaziquone til inducerer cytotoksiske virkninger blev bestemt ved omdannelsen af ​​3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) til formazan ved mitochondrielle dehydrogenaser. Orale kræftceller (AMOS III og SCC4) blev udpladet in triplo i 96-brønds plader i komplet medium. Cellerne blev dyrket til at klæbe natten over og derefter udsat for forskellige koncentrationer af apaziquone [5 nM til 100 uM] i 24 til 96 h for at bestemme dosis- og tidsafhængig inhibering af celleproliferation. Celleproliferation blev målt ved tilsætning MTT til cellerne. Kort beskrevet MTT blev opløst i sterilt PBS og tilsat til brøndene i en slutkoncentration på 1,5 mM. Cellerne vil blive inkuberet med MTT i 4 timer, mediet blev fjernet, og de tilbageværende formazankrystaller blev opløst i DMSO. Absorbansen af ​​solubiliseret formazan blev målt ved 540 nm under anvendelse af en multi-brønd scanningsspektrofotometer. Den procentvise hæmning af celleproliferation blev beregnet ved hvert tidspunkt og dosis som følger: (A

kontrol – A

behandlet /A

kontrol) × 100.

In vitro LD

50 målinger for apaziquone

for at bestemme styrken af ​​apaziquone til at forårsage celledød af orale kræftceller, dens LD

50 blev bestemt ved anvendelse af orale kræftceller AMOS III og SCC4 celler. At bestemme koncentrationen af ​​apaziquone kræves for at dræbe 50% af cellerne (LD

50), blev 5000 celler af hver cellelinie udpladet i tre eksemplarer på nul fluorescens vævskulturbehandlede plader med 96 brønde (BD Biosciences, Mississuaga, ON, Canada ). Efter inkubation natten over blev mediet udskiftet med medier indeholdende apaziquone i et koncentrationsområde 5nM to100μM. Efter 48 timer blev Alamar Blå assay udført for at bestemme cellernes levedygtighed.

Apoptose Assay

For at verificere resultaterne af cellelevedygtighedsassays, Annexin V og propidiumiodid (PI) dobbelt farvning var anvendes til at kvantificere apoptose. AMOS III-celler blev enten behandlet med bærer alene eller apaziquone ved 500 nM i 48 timer. Celler blev mærket med Annexin V-FITC konjugat og PI under anvendelse af Annexin V assay kit ifølge producentens instruktioner (Sigma, St. Louis, MO) og analyseret ved anvendelse af BD Cell Quest Pro software. Disse resultater blev yderligere kontrolleres ved hjælp af Western blot-analyse for specifikke caspaser og Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) assay.

Cell cyklus analyse ved hjælp af flowcytometri

dyrkede medier fra ubehandlet, køretøj kontrol og apaziquone behandlet AMOS III-celler blev opsamlet og centrifugeret for at opsamle ikke-adhærente celler. Adhærerende celler blev vasket med PBS (pH 7,4) og trypsinbehandlet. Både ikke-adhærente og adhærente cellepopulationer blev samlet til yderligere analyse. Celler blev fikseret i 70% ethanol (-20 ° C, natten over) og blev resuspenderet i buffer indeholdende PBS (pH 7,4), EDTA (0,5 mol /l, pH 8,0), Triton X-100 (0,05%), RNase A ( 50 ug /ml) og PI (100 ug /ml) før flowcytometrianalyse.

TUNEL assay

TUNEL-assayet blev udført ved at følge producentens instruktioner. Apaziquone-behandlede og vehikelkontrol AMOS III celler blev opsamlet som beskrevet ovenfor. Mærkning og analyse blev udført efter producentens anvisninger, og resultaterne blev yderligere analyseret ved hjælp af konfokal laser scanning mikroskopi.

In vivo

antitumoraktivitet af Apaziquone i xenograft model af human oral pladecellekræft

Denne

in vivo

undersøgelse blev godkendt af det Dyreetiske Komité Mount Sinai Hospital før påbegyndelsen og pasning af dyr blev udført i overensstemmelse med Toronto Centre of Phenogenomics (TCP) retningslinjer til at overveje dyrenes velfærd og minimere nød. En præklinisk undersøgelse blev udført for at sammenligne virkningen af ​​forskellige koncentrationer af apaziquone og kontrol køretøj i en dyremodel for human oral SCC. Den mest effektive forudbestemte koncentration /dosis apaziquone blev videreført for

in vivo

test i xenograft musemodeller for oral cancer. To måneder gamle mandlige immun-kompromitteret NOD /SCID /CRL # 394 mus subkutant (sc) implanteret med 1 x 10

6 kræftceller i serum frit medium i flanken regionen at etablere tumorer, i overensstemmelse med retningslinjer, institutionel dyr pleje . Når tumorerne nåede en størrelse på ca. 100-200 mm

3, blev musene randomiseret i grupper (n = 6 /gruppe) ifølge tumorvolumener og legemsvægte for følgende behandlinger: den ubehandlede kontrol vehikel (0,1% DMSO -N = 6) og apaziquone-behandlede arm af undersøgelsen (n = 6). I apaziquone arm af undersøgelsen, mus, der bærer tumorerne fik intraperitoneale instillationer af apaziquone ved 0,1 mg /kg legemsvægt eller kontrol køretøj ved 0,1% DMSO 8 uger efter tumorimplantation. Den lægemiddelbehandling blev fortsat i 6 uger. Tumorincidens, tumor volumen, vægt og samlet og median overlevelse af dyr blev registreret. Mus blev overvåget to gange om ugen for eventuelle tegn og symptomer. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen, blev blod opsamlet fra vena saphena af mus til en komplet blodtælling analyse og organfunktion test før anæstesi. Mus blev derefter aflivet ved cervikal dislokation eller tidligere, hvis tumorer oversteg 20% ​​kropsmasse og /eller hvis musene udviste kliniske tegn på bleghed, krum, dyspnø og unormal bevægelse. Efter euthanization blev organer høstet og straks fikseret i formalin. Tumorvolumenet blev målt. Tumorer blev derefter høstet og en anterior-posterior midterlinjen face-cut skive af tumoren blev fikseret i formalin. Tumoren periferi og center blev hakkede og flash frosset i flydende nitrogen i separate hætteglas. Ki67 immunhistokemisk (IHC) blev udført under anvendelse af FFPE vævssnit (4 um tykkelse) af tumorer fra apaziquone behandlede og kontrol vehikelgruppen mus xenotransplantater følge fremgangsmåden som beskrevet af os tidligere [23]. Objektglas blev inkuberet med anti-Ki67-antistof i en fortynding på 1: 100 (Abcam, Cedarlane Labs, Burlington, ON, Canada) i 1 time og kanin sekundært antistof i 20 minutter, efterfulgt af Vectastain Elite ABC-reagens (Vector Labs, Burlingame, CA) under anvendelse af diaminobenzidin som chromogen. I den negative kontrol vævssnit, blev det primære antistof erstattet af isotype-specifikke ikke-immune mus /kanin IgG. Sektionerne blev evalueret ved lysmikroskopisk undersøgelse. Hemotoxylin Eosin (H 0,001, parret to-halet t-test mellem de behandlede og ubehandlede grupper, Fig 5B og 5C).

(A) Ingen signifikant ændring i legemsvægt blev observeret i apaziquone behandlede mus eller køretøjet kontrolmus under behandlingsforløbet. (B) Virkning af apaziquone behandling på tumorstørrelsen i mus. Repræsentative udskårne tumorer afbilder forskellen i størrelsen af ​​tumorer mellem apaziquone behandlede og den ubehandlede kontrolgruppe mus. (C) Effekt af Apaziquone behandling på forsinkelse tumorvækst. Tumorxenografter udviklet i flankerne af NOD /SCID /CRL-mus blev administreret med apaziquone (0,1 mg /kg legemsvægt) intraperitoneale injektioner ugentligt i 6 uger. Apaziquone behandling forsinkede tumorvæksten signifikant (p-værdi 0,001, parret to-halet t-test) i lægemiddelbehandlede gruppe mus sammenlignet med mus i de ubehandlede kontrol- eller vehikelkontrol grupper. (D) Virkning af Apaziquone behandling på nyrer og lever fra mus. Histologi af lever og nyre væv opnået ved afslutningen af ​​den

in vivo

undersøgelse. Vævssnit blev farvet med hematoxylin og eosin (H indgående efterforskning af NQO1 i OSCC og dens relevans for apaziquone effekt i OSCC patienter vil blive gennemført i en kommende undersøgelse. Imidlertid har NQO1 proteinekspression nylig blevet rapporteret til at forudsige dårlig prognose af ikke-småcellet lungekræft [38].

Konklusioner

Apaziquone viste lovende anticancer aktivitet i orale cancer cellelinjer dræbe kræft celler ved apoptose. Endvidere apaziquone demonstrerede lovende anti-tumor aktivitet i orale cancer tumorxenoplantater uden signifikant toksicitet til normale væv hvilket understreger den præ-kliniske effekt af apaziquone, som en potentiel ny anti-cancer terapeutisk kandidat til kræft i mundhulen management.

Støtte Information

S1 fig. . Western blot-densitometrianalyse

histogrammer af western blot-densitometrianalyse af caspase 3, caspase 9, kløvet caspase 9, PARP og spaltes PARP normaliseret til p-actin sammenlignet med ubehandlede kontroller (NTC)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0133735.s001 Hotel (TIF)

S1 Table. Clinical Chemistry Profile, Lever Nyrefunktionsundersøgelser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0133735.s002

(DOCX)

S2 Table. Komplet blodtælling

doi:. 10,1371 /journal.pone.0133735.s003

(DOCX)