PLoS ONE: Ekspression af DNMT1 og DNMT3a reguleres af GLI1 i Human Bugspytkirtelkræft Cancer

Abstrakt

Baggrund og Formål

GLI1, som en uundværlig transkriptionel faktor Hedgehog signalvej, spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft i bugspytkirtlen (PC). DNA methyltransferaser (DNMTs) mægle methylering af mængden af ​​tumor-relaterede gener. Vores undersøgelse havde til formål at undersøge forholdet mellem GLI1 og DNMTs.

Metoder

Udtryk af GLI1 og DNMTs blev påvist i tumor og tilstødende normale væv af PC patienter ved immunhistokemi (IHC). PANC-1-celler blev behandlet ved cyclopamin og GLI1-siRNA, mens BxPC-3-celler blev transficeret med overekspression-GLI1 lentiviral vektor. Så GLI1 og DNMTs udtryk blev analyseret ved QRT-PCR og western blot (WB). Derefter tog vi kromatin immunofældning (chip) for at demonstrere GLI1 binder til DNMT1. Endelig blev indlejret MSP taget at værdisætte de methylering niveauer af APC og hMLH1, når GLI1 udtryk ændres.

Resultater

IHC resultat foreslog udtryk for GLI1, DNMT1 og DNMT3a i pc-væv var alle højere end i tilstødende normale væv (p 0,05). Efter GLI1 ekspression undertrykkes af cyclopamin i mRNA og proteinniveauet (nedregulering 88.1 ± 2,2%, 86,4 ± 2,2%), DNMT1 og DNMT3a mRNA og protein niveau faldt med 91,6% ± 2,2% og 83,8 ± 4,8%, 87,4 ± 2,7% og 84,4 ± 1,3% hhv. Når yderligere slået ned udtryk for GLI1 af siRNA

(

mRNA faldt med 88,6 ± 2,1%, protein faldet med 63,5 ± 4,5%), DNMT1 og DNMT3a mRNA faldt med 80,9 ± 2,3% og 78,6 ± 3,8% og protein faldt med 64,8 ± 2,8% og 67,5 ± 5,6%, hhv. Over-ekspression af GLI1 ved GLI1 gentransfektion (mRNA steget med 655,5 ± 85,9%, og protein steg med 272,3 ± 14,4%.), DNMT1 og DNMT3a mRNA og protein steg med 293,0 ± 14,8% og 578,3 ± 58,5%, 143,5 ± 17,4 % og 214,0 ± 18,9% hhv. Chip assays viste GLI1 proteinbundet til DNMT1 men ikke til DNMT3a. Resultater af indlejret MSP demonstrerede GLI1 udtryk påvirket DNA methylering niveau af APC, men ikke hMLH1 i PC.

Konklusion

DNMT1 og DNMT3a reguleres af GLI1 i PC, og DNMT1 er dens direkte mål gen .

Henvisning: Han s, Wang F, Yang L, Guo C, Wan R, Ke A, ​​et al. (2011) Ekspression af DNMT1 og DNMT3a reguleres af GLI1 i Human kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 6 (11): e27684. doi: 10,1371 /journal.pone.0027684

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: Juli 5, 2011; Accepteret: 21 okt 2011; Udgivet: November 14, 2011

Copyright: © 2011 Han et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. National Natural Science Foundation of China (81072005, 81172312) og Shanghai Science and Technology Udvalg (08411963000, 09JC1412200). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en meget dødelig sygdom, som normalt diagnosticeres i en fremskreden tilstand, hvor der er ringe eller ingen effektive behandlinger. Det har den værste prognose for enhver større malignitet (3% 5-års overlevelse) og er den fjerde mest almindelige årsag til kræft død årligt i flere lande. Trods fremskridt i kirurgisk og medicinsk behandling, har ringe effekt er foretaget på dødeligheden af ​​denne sygdom. En af de store kendetegnende for kræft i bugspytkirtlen er dens omfattende lokal tumor invasion og tidlig systemisk spredning. Så det er et presserende behov for at afsløre de underliggende mekanismer, som bugspytkirtelkræftceller blevet invasive og metastatiske.

Hedgehog signaleringskaskade er afvigende aktiveres i en række humane tumorer, herunder kræft i bugspytkirtlen (PC) [1]. Aktiveringen af ​​Hh pathway kræver binding af Hh-ligander, såsom Shh, Ihh og Dhh, til Hh-receptor Patched (ptch), hvorved der frigives Hh signalmolekyle Smoothened (Smo) fra ptch-induceret hæmning. Smo igen initierer frigivelsen af ​​transkriptionsfaktoren GLI fra cytoskelettet af et kompleks af proteiner, letter således dens nuklear translokation, GLI aktivatorer derefter binde til GACCACCCA-lignende motiv for den transkriptionelle regulering af Hedgehog målgener, som er involveret i regulering af cellulær proliferation, celle-skæbne beslutsomhed, cellulær overlevelse, og epitel-til mesenkymale overgang (EMT) og osv En membran glycoprotein human Hedgehog interagerende protein (HHIP) kan binde til alle tre Hh ligander og funktioner til negativt regulere aktiviteten af Hh signalvej [2], [3].

DNA methylering ændring er en vigtig bidragyder til menneskelig onkogenese [4]. I humane cancerceller, er den normale somatiske mønster for methylering af DNA ændres. Disse ændringer indbefatter forøget CpG ø metylering, der medierer tumorsuppressorgen silencing [4], og genomisk DNA hypometylering, hvilket kan føre til genomisk ustabilitet [5], [6]. Cytosin DNA methylering katalyseres og reguleret af en lille familie af DNA methyltransferaser (DNMTs), herunder DNMT1, DNMT3a, DNMT3b og DNMT3L [7]. Selvom cancerspecifikke mutationer af DNMTs ikke er blevet rapporteret, flere undersøgelser tyder på, at DNMT gener er overudtrykt i human cancer og under cellulær transformation [8] – [11]. Adskillige mekanismer synes at tegne sig for DNMTs over-ekspression, herunder afvigende cellecykluskontrol, forøget mRNA og protein stabilitet, og E2F-medierede DNMTs promotoraktivering [11] – [14].

Selvom beviserne ovenfor viser, at DNMTs og aktiv Hh signalvej er begge involveret i udviklingen af ​​kræft i bugspytkirtlen, lidt om sammenhængen mellem DNMTs og medlemmer af Hh vej. Her blev denne undersøgelse, at undersøge ekspressionen af ​​GLI1 og DNMTs, og sammenhængen mellem dem i human bugspytkirtelkræft.

Materialer og metoder

Etik erklæring

væv af bugspytkirtelkræft og tilsvarende ikke-kræft bugspytkirtel blev opnået fra Shanghai tiende Folkets Hospital, hvor vi har fået etik godkendelse fra Medicin og Life Sciences etiske komité.

cellekulturer og medicinsk behandling

Menneskelig kræft i bugspytkirtlen cellelinie PANC-1 og BxPC-3 blev dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), streptomycin 100 ug /ml, og penicillin 100 U /ml ved 37 ° C i 5% CO2 og 95% luft -humidified inkubator. BxPC-3-celler blev dyrket i lentiviral transfektion af overekspression-GLI1 lentiviral vektor. PANC-1-celler blev udpladet med en tæthed på 4 x 10

4 celler /cm

2 i en seks-brønds plade, Cyclopamin (Sigma, St. Louis, MO) blev opløst i 100% ethanol og derefter fortyndet frisk på dagen for testning for celledyrkningsforsøg. PANC-1-celler blev behandlet med den endelige koncentration af Cyclopamin ved 10 uM i 24 timer.

Immunhistokemi (IHC)

Tyve par PC og tilsvarende ikke-kræft bugspytkirtel væv blev opnået fra Shanghai tiende Folkets Hospital. Pancreas-patienters tumor snit blev de-paraffinised, rehydreret, behandlet med 10 mM citratpuffer ved 95 ° C for at hente antigener, blokeret med 5% BSA, og inkuberet med muse-anti-GLI1 (1:100), kanin-anti-DNMT1 ( 1:100) eller kanin-anti-DNMT3a antistof (1:100; alle fra Santa Cruz Biotech) natten over. Vævssnittene blev derefter inkuberet med sekundære antistoffer og DAB-reagens (Gene Tech, Shanghai, Kina). Sektionerne blev derefter modfarvet med hæmatoxylin, så var dehydreret og visualiseret med 3,3-diaminobenzidin (Gene Tech, Shanghai, Kina). Negative kontroller blev udført i hvert tilfælde ved at erstatte det primære antistof med PBS.

RT-PCR og kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret fra PANC-1-celler under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Californien, USA), 1 ug RNA blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse PrimeScript RT reagens Kit (Takara Bio, Shiga, Japan). For at bestemme mængden af ​​mRNA, blev cDNA forstærkes af real-time PCR med SYBR Premix Ex Taq RT-PCR-kit (Takara Bio, Shiga, Japan), og husholdning gen β-actin blev anvendt som den interne kontrol. SYBR Green assays blev udført tre gange på en 7900HT realtid instrument (Applied Biosystems, CA, USA). Primere anvendt til QRT-PCR blev noteret (Tabel 1). De relative ekspressionsniveauer blev beregnet ved anvendelse af 2

-ΔΔCT

metode.

Western Blot (WB)

Samlet cellelysat blev fremstillet på en × natriumdodecylsulfat puffer. Proteiner i det samme beløb blev adskilt ved 6% SDS-PAGE og overført til polyvinyliden (PVDF) membraner. Efter inkubation med antistoffer specifikke for DNMT1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) eller DNMT3a (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA) eller GLI1 (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA) eller β-actin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) blev blots inkuberet med gede-anti-kanin eller anti-muse-sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) og visualiseret med forøget kemiluminescens.

Små interfererende RNA-medieret inhibering af GLI1 ekspression

Stealth lille interferens RNA (siRNA) sekvenser til GLI1 designet og syntetiseret ved GenePharma at målrette GLI1 mRNA. Kodningsstrengen for GLI1 siRNA var 5′-GGCTCAGCTTGTGTGTAAT-3 ‘. En ubeslægtet siRNA-sekvens blev anvendt som kontrol. I dette eksperiment blev cellerne inkuberet i 12 timer og transficeret ved ca. 60% konfluens med 50 nm siRNA-duplexer anvendelse af Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Alle forsøgene blev udført 72 timer efter transfektion.

Lentiviral Transfektion af Overekspression-GLI1 lentivirusvektor

Lentiviral transfektion af overekspression-GLI1 lentiviral vektor pGC-FU-GLI1 blev udført som vi rapporteret tidligere [ ,,,0],15]. Humant GLI1 cDNA blev købt fra Open-Biosystem (USA). Den komplette cDNA sekvens af GLI1 blev dannet ved PCR og indsat i pGC-FU-3FLAG Vector (GeneChem Company, Shanghai, Kina), der blev lineariseret med

Age I

og

NheI

( fig. S1, S2). Det resulterende 3320 bp fragment blev bekræftet ved sekventering (fig. S3). Lentiviral vektor blev fremstillet ved co-transficeret ind i 293T-celler med hjælperfag konstrukt. Titere på 2-5 x 10

7 TU /ml blev rutinemæssigt opnået. BxPC-3-celler blev transficeret med den lentivirale vektor og GLI1 ekspression blev indført ved real-time PCR og western blot-analyse.

chromatin immunoprecipitation (chip)

DNA-GLI1-protein immunkomplekser var preparated som vi tidligere rapporteret [15], efter revers tværbundet blev DNA ekstraheret med phenol /chloroform og udfældet. Tilstedeværelsen af ​​DNMT1 og DNMT3a promotor domæne indeholdende GLI1 motiver i immunopræcipiteret DNA blev identificeret ved PCR under anvendelse af primere (tabel 2). PCR-betingelserne for DNMT1 og DNMT3a promotorregionen var: denaturering 30 sekunder ved 94 ° C, annealing 30 s, forlængelse 1 minut ved 72 ° C. Udglødningstemperaturer optaget i tabel 2. amplifikation af DNMT1 og DNMT3a promotorregionen blev analyseret efter 40 cykler. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange.

DNA forberedelse

DNA blev ekstraheret ved TIANamp Genomisk DNA Kit (Tiangen, Beijing, Kina). Ca. 500 ng udvundet DNA var bisulfit samtalte og søjle-renses ved EZ DNA Methylering-Gold ™ Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) for at gøre 10 pi prøve.

Indlejret MSP

status DNA-methylering på promotorregionerne af APC (adenomatøs polypose coli) og hMLH1 (human MutL homolog 1) blev bestemt ved metoden ifølge MSP yderligere modificeret som en indlejret totrinstilgang med primerne tidligere beskrevne [16], [17 ]. I trin et i nestede MSP, blev primere designet til at amplificere både methylerede og ikke-methylerede genomiske regioner. Produkter blev ligeledes fortyndet 1:100 og underkastes trinnet to af nestede MSP med primere designet til at genkende bisulfit-induceret sekvensforskelle mellem methylerede og ikke-methylerede genomiske regioner. PCR-betingelserne for trin et var som følger: 95 ° C varm starte × 5 minutter, derefter 40 gentagne cykler af denaturering (95 ° C x 30 sek), annealing (56 ° C x 30 s), forlængelse (72 ° C × 30 s) efterfulgt af en endelig 5 min forlængelse ved 72 ° C. Og at det for Trin to var: 95 ° C varm starte × 5 minutter, derefter 30 gentagne cykler af denaturering (95 ° C x 30 sek), annealing (59 ° C x 30 s for APC, 60 ° C x 30 s for hMLH1 ), forlængelse (72 ° C x 30 s) efterfulgt af en endelig 5 min forlængelse ved 72 ° C. MSP-produkter blev separeret elektroforetisk på 2% agarosegeler.

Statistical Analysis

Kvantitative data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Real-time PCR-data blev analyseret i henhold til de forskelle i target genekspression ved parret t-test og var 2

-ΔΔCT

forvandlet inden analyse. IHC data blev analyseret ved anvendelse af chi i anden-test. En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

GLI1, DNMT1 og DNMT3a var opreguleret i humane pancreas cancer væv

For at bekræfte rollerne af GLI1 og DNMTs i udviklingen af ​​menneskelige bugspytkirtelkræft, vi først undersøgt, om deres udtryk blev ændret i kræft væv. Derfor har vi studeret GLI1, DNMT1 og DNMT3a udtryk i 20 parrede biopsi væv af PC patienter ved IHC. Vi fandt, at GLI1, DNMT1 og DNMT3a udtryk var alle højere i de fleste PC sammenlignet med normale væv (14/20 versus 5/20, p = 0,004; 15/20 versus 6/20, p = 0,004; 13/20 versus 5 /20, p = 0,011; henholdsvis, figur 1). 14 af 20 PC tilfælde havde højere udtryk for GLI1 protein, blandt hvilke 12 tilfælde udtrykte højere niveauer af DNMT1 protein (p = 0,004) og 11 tilfælde udtrykt højere niveauer af DNMT3a protein (p = 0,012).

immunhistokemisk undersøgelse for GLI1, DNMT1 blev DNMT3a protein udført i 20 par PC og tilstødende normale væv. Repræsentative billeder vises. Tilstødende normale væv udviste ingen eller svag farvning for GLI1, DNMT1 og DNMT3a imidlertid forekomsten af ​​alle tre proteiner nuklear immunoreaktivitet var meget højere i PC væv. Alle mikrofotografier blev opnået ved × 200 forstørrelse.

Cyclopamin og GLI1 siRNA både hæmmede DNMT1 og DNMT3a udtryk

For at bestemme om Hh aktivitet påvirkede udtryk for DNMTs, vi brugte cyclopamin, et klassisk inhibitor af Hh signalvej, at formindske ekspressionen af ​​GLI1. PANC-1-celler, som tidligere blev rapporteret til at udtrykke et højt niveau af GLI1 [15], blev behandlet med 10 pM cyclopamin i 24 timer. Bagefter blev QRT-PCR og WB taget at analysere ekspressionen af ​​GLI1 og DNMTs. DNMT1 og DNMT3a mRNA faldt med 91.6.0 ± 2,2% og 83,8 ± 4,8%, når det blev GLI1 mRNA faldt med 88,1 ± 2,2%. DNMT1 og DNMT3a protein faldt med 87,4 ± 2,7% og 84,4 ± 1,3%, når GLI1 protein faldt med 86,4 ± 2,2% (figur 2).

PANC-1-celler blev behandlet med 10 pM cyclopamin i 24 timer, derefter relative ekspression af GLI1, DNMT1 og DNMT3a mRNA blev vurderet ved QRT-PCR (A, B, C), mens ekspressionen af ​​GLI1, DNMT1 og DNMT3a protein blev analyseret ved Western blot (D). Det indsatte viser et betydeligt fald i GLI1, DNMT1 og DNMT3a udtryk. Resultaterne blev normaliseret til den for β-actin-ekspression. Alle data blev præsenteret som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg.

Vi yderligere designet og syntetiseret GLI1 siRNA, derefter transficeret i PANC-1-cellelinien. PANC-1-celler transficeret med et ubeslægtet siRNA-sekvens blev anvendt som en negativ kontrol [18], og PANC-1, der blev behandlet med Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) kun blev anvendt som blank kontrol. 72 timer efter transfektion blev QRT-PCR og WB udtages til bestemmelse af ekspression af GLI1 og DNMTs. DNMT1 og DNMT3a mRNA faldt med 80,9 ± 2,3% og 78,6 ± 3,8%, når det blev GLI1 mRNA faldt med 88,6 ± 2,1%. DNMT1 og DNMT3a protein faldt med 64,8 ± 2,8% og 67,5 ± 5,6%, når GLI1 protein faldt med 63,5 ± 4,5% (Figur 3).

Panc-1-celler blev transficeret med GLI1 siRNA, 72 timer efter transfektion, relative ekspression af GLI1, DNMT1 og DNMT3a mRNA blev vurderet ved QRT-PCR (A, B, C), mens ekspressionen af ​​GLI1, DNMT1 og DNMT3a protein blev analyseret ved Western blot (D). Det indsatte viser et betydeligt fald i DNMT1 og DNMT3a udtryk efter GLI1 interferens. Resultaterne blev normaliseret til den for β-actin-ekspression. Alle data blev præsenteret som gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg.

Udtrykket af DNMT1 og DNMT3a blev opreguleret med GLI1 overekspression

For yderligere at bekræfte reguleringen af ​​DNMT1 og DNMT3a af GLI1, vi har designet og konstrueret en lentivirus vektor, overudtrykt GLI1, og transficeret det ind BxPC-3 med den laveste GLI1 udtryk i PC-cellelinjer, som vi tidligere rapporteret [15]. Celler transficeret med tom lentivirusvektor blev anvendt som negative kontroller, mens celler uden transfektion blev anvendt som blanke kontroller. 48 timer efter transfektion blev QRT-PCR og WB udtages til bestemmelse af ekspression af GLI1 og DNMTs i de tre cellelinjer. DNMT1 og DNMT3a mRNA steget med 293,0 ± 14,8% og 578,3 ± 58,5%, når det blev GLI1 mRNA steg med 655,5 ± 85,9%. DNMT1 og DNMT3a protein steg med 143,5 ± 17,4% og 214,0 ± 18,9%, når det blev GLI1 protein steg med 272,3 ± 14,4% (figur 4).

BxPC-3-celler blev transficeret med pGC-FU-GLI1 , relative ekspression af GLI1, DNMT1 og DNMT3a mRNA blev vurderet ved QRT-PCR (A, B, C), mens ekspressionen af ​​GLI1, DNMT1 og DNMT3a protein blev analyseret ved Western blot (D). Det indsatte viste en betydelig stigning i DNMT1 og DNMT3a udtryk efter GLI1 overekspression. Resultaterne blev normaliseret til den for β-actin-ekspression. Alle data blev præsenteret som gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg.

Bekræftelse af GLI1 proteinbundet til promoter region DNMT1 gen

Vi har hidtil vist sig rollen som GLI1 i DNMT1 og DNMT3 udtryk. Men den mekanisme bag en sådan regulering er fortsat, at blive belyst. At undersøge, om DNMTs er direkte reguleret af GLI1 eller ej, vi søgte DNMT1 og DNMT3a promotor for potentielle GLI1 bindingssteder til DNA konsensus sekvensen 5′-GACCACCCA-3 ‘[19] eller 5′-TGGGTGGTC-3′ [20] , og fem højt scorer kandidat steder af GLI1 mål blev fundet i DNMT1 s promotor og seks i DNMT3a s. Hvert websted har kun to nukleotider s forskel i sammenligning med 5’-GACCACCCA-3 ‘eller 5′-TGGGTGGTC-3’ (figur 5). Chip blev taget for at bekræfte den omgivende forhold mellem GLI protein og DNMT1 /3a gen. DNA ekstraheret fra PANC-1-celler blev sonikeret i 100-1000 bp (Fig. S4) og som chippen-PCR template. Resultatet af DNA-elektroforese viste den forventede DNA-bånd i INPUT, GLI1-Ab, og postive kontrolgrupper hjælp menneskelig DNMT1 primer-C, og ikke i IgG og negative kontrolgrupper (figur 6). Kun INPUT og den positive kontrol viste forudsagte bånd under anvendelse af human DNMT1 primer-A, C-E og DNMT3a primer A-E, men ikke i GLI-Ab, IgG og negative grupper (data ikke vist). Som positiv produkt amplificeret ved DNMT1 primer-C indeholder kandidat GLI1 bindingssted 2 og 3 (tabel 2 og figur 5), mens produktet amplificeret ved DNMT1 primer-B indeholder kandidat GLI1 bindingssted 2 var negativ, og resultaterne af sekvensanalyse viste, at sekvenser var de samme som for DNMT1 genpromotoren af ​​site 3 (fig. S5), foreslog, at GLI1 var bundet til DNMT1 genpromotoren af ​​site 3 (GGCCTCCCA).

To parallelle linjer på toppen af figur repræsenterede DNMT1 eller DNMT3a DNA, henholdsvis (A, B), inden for hvilken grå rammer repræsenterede exons, repræsenterede hvide rammer introns, og sorte rammer repræsenteret promoter. I promotoren, små grå rammer markeret med nummer 1 til 5 (A) eller 1 til 6 (B) repræsenterede den potentielle GLI1 bindingssteder, der kun har to nukleotider forskel (understreget) fra GLI1 konsensus bindingssekvens, GACCACCCA. Primere blev udformet til at amplificere DNMT1 (A) eller DNMT3a (B) promotorregionen indeholder det formodede GLI1-bindingssted. Positionen og længde af produkter amplificated af hver primer blev vist.

Lysater fra PANC-1 celler blev udsat for chromatin immunpræcipitation af anti-GLI1 antistof. Sonikerede kromatin blev anvendt som INPUT DNA-kontrol (INPUT). RNA-polymerase II blev anvendt som positiv kontrol (PC). IgG blev anvendt som tilfældig kontrol (IgG) og β-actin Ab blev anvendt som negativ kontrol (NC). Båndet af chip-PCR-produkter amplificeret ved DNMT1 Primer-C (i) og af DNMT1 Primer-B (ii) blev vist.

DNA-methylering niveauer af APC, men ikke hMLH1 promotorregioner ændret med GLI1 udtryk

Mængden af ​​tumor-relaterede gener viste sig at blive bragt til tavshed af DNA methylering i PC, herunder APC (adenomatøs polypose coli) og hMLH1 (human MutL homolog 1). For at få adgang, om at hæmme eller øge ekspressionen af ​​GLI1 kunne også føre til hypoglykæmi eller hyper-methylering af APC og hMLH1 i PC, brugte vi indlejret MSP for at vurdere status methylering af PANC 1 med eller uden GLI1 knockdown og BxPC-3 med eller uden GLI1 overekspression hhv. Resultaterne viste, at APC DNA-methylering niveau steg i BxPC-3-celler transficeret med Overekspression-GLI1 lentivirusvektor i sammenligning med den negative kontrol, og blev inhiberet i PANC-1-celler transficeret med GLI1-siRNA i forhold til den negative kontrol. Imidlertid blev DNA methylering niveau af hMLH1 promotorregionen ikke signifikant ændret efter transfektion (figur 7). Dette sandsynligvis fordi DNA methylering er koordineret af en familie af DNMTs omfatter DNMT1, -3a, -3b og -3L, måske udtrykket ændring af kun DNMT1 og -3a reguleret af GLI1 ikke var tilstrækkeligt til at påvirke DNA methylering niveauer af hver tumor- relaterede gener [21].

Resultater af indlejret MSP af APC og hMLH1 i seks slags PC celler henholdsvis blev vist. B repræsenteret BxPC-3-celler; B-G + repræsenterede BxPC-3 transficeret med pGC-FU-GLI1 at gøre GLI1 overekspression, og B-NC repræsenteret sin negative kontrol; P repræsenteret PANC-1; P-G-si repræsenterede PANC-1 transficeret med GLI1-siRNA og P-NC repræsenteret sin negative kontrol. Positive båndene under M og U repræsenterede methylerede og umethyleret DNA af de tilsvarende gener i højre panel, hhv.

Diskussion

I denne undersøgelse fandt vi, at GLI1, DNMT1 og DNMT3a er overudtrykt i PC væv sammenlignet med de tilsvarende ikke-kræft bugspytkirtel væv, så viste vi, at DNMT1 og DNMT3a udtryk ændret i overensstemmelse med den GLI1 udtryk i Panc-1 og BxPC-3 cellelinier efter specifikt GLI1 indblanding og gen transfektion, samt farmakologisk metode

in vivo

. Endnu vigtigere, vi bevist ud over en rimelig tvivl om, at GLI1 var i stand til at binde til DNMT1 genpromotoren af ​​sted 3 (GGCCTCCCA) ved chippen eksperimenter. Endelig brugte vi indlejret MSP at vise, at GLI1 udtryk påvirket methylering niveau af APC-DNA, men ikke hMLH1 i PC. Så vidt vi ved, er dette den første rapport viste GLI1 som en transkriptionel faktor, reguleret DNMT1 og -3a udtryk samt APC methylering niveau i PC, og DNMT1 er dens direkte mål gen.

GLI1, som en transkriptionel faktor Hh signalvej, opreguleres i de fleste fordøjelsesforstyrrelser tumorer, herunder PC [22], [23]. Indtil videre, er blevet identificeret kun få downstream mål for GLI1 [24]. For nylig blev det rapporteret at være involveret i PC invasion og metastase, og er blevet et nyt mål for behandling [25], [26]. Men lidt var kendt om den faktiske mekanisme underforstået i sin fremme af invasion og metastase i PC. Desuden har vi fokuseret på at akkumulere beviser, som viste, at carcinom i forskellige organer, herunder pankreas, er forbundet med afvigende DNA-methylering, hvori DNMTs er nøglen katalysator signifikant korreleret med ophobning af methylering af tumor-relaterede gener, blandt hvilke nogle var forbundet withcell spredning som APC, blev nogle relateret til erstatning af DNA-skader såsom hMLH1, nogle var invasion- eller metastase-relaterede, såsom TIMP-3, SPARK, og CDH1, eller celledød-relaterede, såsom DAPK-1, således spiller en vigtig rolle i flertrins carcinogenese i bugspytkirtlen fra tidlige forstadier stadier til malign progression [27]. For nylig blev det konstateret, at tumorbyrde reduceres signifikant med faldende DNMT1 niveauer

in vivo

, hvilket antyder, at DNMTs medieret DNA-methylering er involveret i pancreas carcinogenese [28]. Baseret på denne undersøgelse og tidligere rapporter ovenfor, er det muligt, at GLI1-DNMTs kaskade hjælp til invasion eller metastase ved at fremme methylering af nogle invasion- eller metastase-relaterede gener, og kan lette tumorvækst ved at fremme methylering af nogle celledød-relaterede gener.

Vores undersøgelse viste, at DNMT3a ekspression reguleres af GLI1 i human pancreascancer. Men det faktiske mekanisme i reguleringen af ​​DNMT3a af GLI1 er stadig ukendt. Senere år har mange manuskripter blevet rapporteret, at nogle microRNA familier kunne målrette DNMTs i en mangfoldighed af humane cancere [29] – [32]. På den anden side blev det rapporteret, at nogle microRNA såsom microRNA-29 familien blev transkriptionel undertrykt af c-Myc, pindsvin og NF-kappaB [33]. På baggrund af beviser ovenstående, er det muligt, at Hh-GLI kan regulere DNMT3a gennem nogle bestemte microRNA, der mangler at blive udforsket.

I vores undersøgelse, chip assays viste GLI1 binder til DNMT1 men ikke DNMT3a. Vi bemærkede også, at GLI1 forhøjet DNMT3a flere folder end DNMT1. Vi troede, at der var nogle mulige underliggende mekanismer som følger: For det første kan GLI1 ikke regulere DNMT3a direkte, men via et bestemt gen, som kan være en kinase eller activin og via kaskade forstærkning for at føre en højere regulativ effektivitet DNMT3a af GLI1. For det andet kan Hedghog-GLI1 direkte eller indirekte regulerer flere gener involveret i forskellige signalveje, og to eller flere af disse gener også regulere DNMT3a og har synergistiske virkninger, således at trods GLI1 ikke kunne regulere DNMT3a direkte, men ville forhøje DNMT3a flere folder, når det over-udtrykker. For at løse dette spørgsmål, er det nødvendigt at udforske flere målgener af Hedgehog-GLI1, og til sonde ind i krydstale mellem forskellige signalveje. Vi troede regulative forhold mellem Hh-GLI1 og DNMTs ville være ikke så enkelt, som vi allerede bekræftet. Yderligere undersøgelser er også behov for at undersøge, om den biologiske adfærd GLI1 i PC kan opnås ved at regulere DNMTs.

Den nyligt identificerede GLI1 /DNMTs akse sat en bro mellem Hh signalvejen og epigenetik, hvilket vil bidrage til at belyse den slave molekylære mekanisme i udviklingen af ​​PC, og kan give nye terapeutiske mål eller biomarkører for tidligere diagnose.

Støtte oplysninger

figur S1.

identificaton af positiv klon produkter i overekspression-GLI1 lentiviral vektor konstruktion. De GLI1 cDNA produkter blev indsat i lineariseret pGC-FU-3FLAG vektor til konstruktion pGC-FU-GLI1 plasmidet efter amplificeret og oprenset, derefter transformeret ind i kompetente celler. Transformanter blev identificeret med PCR og elektroforese på 1,5% agarose gel, transformanter-1 og -4 blev viste som en 731 bp bånd, som viste sig at være positiv klon

doi:. 10,1371 /journal.pone.0027684.s001

(TIF)

Figur S2.

Identifikation af GLI1 udtryk i pGC-FU-GLI1 klon af WB. pGC-FU-GLI1 er konstrueret som et lentivirus vektor udtrykt GLI1, som blev co-udtrykt med FLAG. (1) WB molekylvægtmarkør, med 3-FLAG etiket, fusioneret med GFP-genet (48 kDa). (5-8) Prøve efter pGC-FU-GLI1 transficerede 293T-celler. (7) GLI1-FLAG fusionsprotein (122 kDa + 2 KDa = 124 kDa), certificeret GLI1 udtryk i pGC-FU-GLI1 plasmid

doi:. 10,1371 /journal.pone.0027684.s002

(TIF)

Figur S3.

Sekvensanalyse af positiv klon produkter i GLI1-overekspression lentiviral vektor konstruktion. Det resulterende 3320 bp fragment blev bekræftet ved sekventering som er det samme med sekvensen for GLI1 genekspression region i GenBank (NM_005269.2)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0027684.s003

(TIF )

Figur S4.

Electropheretogram af sonikeret kromatin opløsning. Sonikeret kromatin opløsning i forskellige forhold (100 W, 80 W og 60 W, henholdsvis) blev elektroforesebehandlet på 1,5% agarosegel indeholdende ethidium bromied

doi:. 10,1371 /journal.pone.0027684.s004

(TIF)

Figur S5.

Sekvensanalyse af chip produkter, som forstærkes af DNMT1 primer-C. Resultatet viste, at sekvensen amplificeret med DNMT1 primer-C er den samme som for DNMT1 genpromotorregion indeholdende GLI1-bindingssted 2 og 3. Salg doi: 10,1371 /journal.pone.0027684.s005 Salg (TIF )