PLoS ONE: nicotinacetylcholinreceptor subunits α4 og α5 forbundet med rygning Adfærd og lungekræft er reguleret af Upstream Open Reading Frames

Abstrakt

nicotinacetylcholinreceptor underenheder (nAChR) er forbundet med forskellige aspekter af rygning adfærd som samt med rygning relaterede lidelser. Flere af disse underenheder har vist sig at være opreguleret i rygere eller differentielt udtrykt i lunge tumorceller. Mekanismerne bag disse observationer er ikke kendt, men antages at være overvejende posttranskriptionel. Mange post-transkriptionelle mekanismer initieres af funktionelt relevante sekvensmotiver inden utranslaterede genregioner, såsom opstrøms åbne læserammer (uORFs). Vi udførte en systematisk søgning i alle rygning-associeret neuronale nAChR underenheder og identificeret funktionelt relevante uORFs i

CHRNA4

CHRNA5

. Luciferase forsøg viste, at disse uORFs er i stand til sænke proteinekspression. Vores kvantitativ real-time PCR (qPCR) resultater tyder stærkt på, at de observerede virkninger stammer på oversættelsen stedet på transskription niveau. Interessant,

CHRNA4

uORF var kun funktionelt relevant, når den udtrykkes i kortere isoformen af ​​dette gen. Derfor data præsenteret i denne undersøgelse kraftigt peger i retning af en vigtig rolle uORFs inden 5’UTR i

CHRNA4

-isoform 1 og

CHRNA5

som regulatorer af protein oversættelse. Desuden delte uORF af

CHRNA4

-isoform 1 /isoform 2 repræsenterer det første eksempel på en sekvens kontekstafhængig uORF

Henvisning:. Eggert M, Aichinger E, Pfaffl MW, Steinlein OK , PFOB M (2013) nicotinacetylcholinreceptor subunits α4 og α5 forbundet med rygning Adfærd og lungekræft er reguleret af Upstream Open Reading Frames. PLoS ONE 8 (7): e66157. doi: 10,1371 /journal.pone.0066157

Redaktør: Huibert D. Mansvelder, Neuroscience Campus Amsterdam, VU University, Holland

Modtaget: Marts 12, 2013; Accepteret: Maj 2, 2013; Udgivet: 2 juli 2013

Copyright: © 2013 Eggert et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft [STE16511-2] og Friedrich-Baur-Stiftung [No 57/12]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cigaretrygning er kendt som en væsentlig risikofaktor for hjerte-kar-sygdom og rygning-associerede maligne sygdomme som lungekræft [1]. Men cirka hver tredje voksen verdensplan ryger, og antallet er stigende [2]. Det er derfor ikke overraskende, at der gøres en stor indsats for at afdække årsagerne til nikotinafhængighed, samt at udvikle nye strategier til forebyggelse og behandling. Nikotin virker som en acetylcholin-agonist, der er i stand til at binde til neuronale nicotin-acetylcholin receptorer (nAChR). The nAChR danner heterogene og homogene pentamere ionkanaler med en forskelligartet ekspressionsmønster i neuronale og ikke-neuronale væv [3]. Derfor har mange af de gener, der koder for nAChR underenheder er mistænkt for at spille en central rolle med hensyn nikotinafhængighed. Adskillige nAChR subunit gener er allerede blevet forbundet med rygning og ryge-relaterede sygdomme. F.eks

CHRNA7

, det gen, der koder den α7 nAChR underenheden blev vist at undertrykke luftveje basal celleproliferation og at omforme lungen epitel. Desuden hypotesen frem, at dysreguleret α7 ekspression giver anledning til præneoplastiske transformationer [4], [5]. Genetiske varianter i den kodende region, men også i promotorregionen af ​​

CHRNA4

er forbundet med både subjektive reaktioner på rygning og rygestop resultater [6] – [10]. Men de fleste undersøgelser, der er offentliggjort om emnet af cholinerge receptorer og nikotinafhængighed /rygerelaterede sygdomme peger mod nAChR gen klynge på kromosom 15. polymorfier i denne region, der mest konsekvent rapporteret at være forbundet med rygning mængde, nikotinafhængighed , lungekræft og perifer arteriel sygdom ligger enten i

CHRNA5

eller

CHRNA3

gen [11] – [16]. Derudover blev sammenhænge mellem

CHRNB3

polymorfier og reaktion på første gang brug af tobak beskrevet [17].

De mekanismer, hvorved nAChR gener forbundet med nikotinafhængighed er reguleret er ikke kendt i detaljer, så langt . Generelt kan genekspression modificeres enten før eller efter transkriptionelt. Sidstnævnte mekanismer er ofte medieret af cis-agerende sekvensmotiver lokaliseret i den utranslaterede regioner (UTR), som er til stede op- og nedstrøms for de fleste eukaryote gener kodende regioner. Adskillige motiver i 5’UTR ansvarlige for translationel regulering er blevet identificeret i eukaryote gener, såsom interne ribosom entry sites, jern responsive elementer og primære åbne læserammer (uORFs). De sidstnævnte elementer kan spille en afgørende rolle i reguleringen af ​​genekspression. En voksende mængde beviser for, at uORFs er i stand til at påvirke protein oversættelse på forskellige måder. Scanning ribosomer oversætte en uORF måske ikke være i stand til at puste nyt længere nedstrøms på den kodende region ATG, eller måske gå i stå på uORF, blokere andre ribosomer (ribosomale vejspærring). Alternativt kan stopcodonen af ​​uORF forveksles som en nonsens mutation, udløser nonsens medieret forfald. [18], [19]. Desuden kan den uORF proteinet selv modulere translation, som angivet ved mutageneseeksperimenter indfører missense mutation i uORF sekvenser [20]. Alle disse mekanismer er sandsynligvis øge den funktionelle variation af gener i populationer. Den funktionelle betydning uORFs understreges yderligere af den konstatering, at mutationer i dem er i stand til at forårsage menneskelige sygdomme såsom arvelig trombocytose eller Marie Unna arveligt hårtab [21], [22].

I den foreliggende undersøgelse, vi udført en systematisk søgning efter funktionelt relevante uORFs i nAChR underenheder, der mistænkes for at være involveret i nikotin afhængighed og rygerelaterede sygdomme. Vores eksperimenter viste, at nogle uORFs bidrager til reguleringen af ​​nAChR proteinekspression.

Materialer og metoder

I silico

analyse af formodede uORFs i 5’UTR i α3, α4, α5, α7 og SS3 nAChR underenheder

5’UTRs af

CHRNA3, CHRNA4

isoform 1 og 2,

CHRNA5, CHRNA7

og

CHRNB3

(der koder for nAChR subunits α3, α4, α5, α7 og SS3) blev screenet for i ramme start- og stopkodoner opstrøms for den vigtigste startkodonen med StarORF Finder (https://star.mit.edu/orf/runapp .html). SNPs valideret af SNP-gen udsigt over NCBI og som ligger på uORF sekvens eller oprette /slette en uORF blev anset for undersøgelse (fig. 1).

‘UTR’er af nikotinafhængighed-associeret nAChR subunit gener med formodede uORFs. Den bp position for hvert uORF (start /stop) er afbildet startende fra de vigtigste startkodon i 5’retning.

CHRNA4

isoform 1 og isoform 2 forskellige i deres kodende region, med en længere nedstrøms translationsinitiering for isoform 2, der forlænger dens 5’UTR.

CHRNA4

isoform 2 blev ikke offentliggjort før 2012 og ikke er blevet funktionelt analyseret før. Squares, uORFs; pile, SNPs

Plasmidkonstruktion

Firefly luciferase vektor pGL4.10 (AY738222.1) og renilla luciferase vektor pGL4.74 (AY738230.1) blev købt fra Promega (Mannheim, Tyskland). TK-promotorsekvensen blev skåret ud af pGL4.74 med Kpnl og Xhol (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland) efter generering af et Xhol restriktionssted ved position bp 783 under anvendelse geneart steddirigeret mutagenese systemet (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland ). Efter KpnI og XhoI fordøjelse af pGL4.10 blev TK-promotorsekvensen ligeret ind i det multiple kloningssted i pGL4.10 opstrøms for ildflueluciferase-kodende sekvens. 5’UTR inserter af den nAChR subunits α4 isoform 1 og 2, α5 og SS3 blev syntetiseret (MWG Eurofins, Ebersberg, Tyskland) og klonet ind pGL4.10 med Xhol og Ncol (Fermentas, St. Leon-Rot, Tyskland) direkte mellem TK-promotoren og ildflueluciferase-kodende sekvens. Efter kloning af inserter blev bekræftet ved sekventering. At skabe konstruktioner mangler en vis uORF blev ATG af uORF muteret til TTG. Ligeledes blev SNP alleler inden uORFs udveksles ved site-directed mutagenese. For

CHRNA4

isoform 1 (NM_000744.6), der huser en formodet uORF blev to konstruktioner skabt: en med vildtype mRNA (

CHRNA4

-iso1-1) og en med den muterede uORF startcodon (

CHRNA4

-iso1-2). For en efterfølgende test (se resultater) blev to mere konstruktioner skabt: en, hvor stopcodonet af uORF var muteret (TAG til TAC), men ildflue startcodon forblev intakt (

CHRNA4

-iso1- 3), og den ene mangler både stopcodonen af ​​uORF og ildflue starte (ATG til TTG) (

CHRNA4-

iso1-4).

for

CHRNA4

isoform 2 (NM_001256573.1), der besidder fem formodede uORFs blev seks konstruktioner skabt: en med vildtype mRNA (

CHRNA4

-iso2-uORF1-5) og fem konstruktioner, hvor hver enkelt af de fem uORFs blev slukket, nummereret i overensstemmelse hermed, begyndende med den mest 5 ‘placeret uORF (

CHRNA4

-iso2-uORF1;

CHRNA4

-iso2-uORF2;

CHRNA4

-iso2 -uORF3;

CHRNA4

-iso2-uORF4;.

CHRNA4

-iso2-uORF5)

For

CHRNA5

(NM_000745.3), der huser en formodede uORF indeholder en SNP blev fire konstruktioner skabt: en med allel guanin og intakt /slukket uORF (

CHRNA5

-1;

CHRNA5

-2) og en med allelen adenin og intakt /slukket uORF (

CHRNA5

-3;

CHRNA5

-4). Til en efterfølgende test (se resultater) blev to yderligere konstruktioner skabt: en, hvori stopkodonen af ​​uORF var muteret (TAG TAC), men ildflue startcodon forblev intakt (

CHRNA5

-5) , og den ene mangler både stopcodonen af ​​uORF og ildflue starte (ATG til TTG) (

CHRNA

56).

for

CHRNB3

(NM_000749.3 ), der huser en formodet uORF og en SNP med større allel adenin skabe en uORF startcodon blev tre konstruktioner anvendt: en med intakt uORF startkodon genereres af SNP allel adenin (

CHRNB3

-1); en med den mindre SNP allel guanin slette den første uORF startcodon (

CHRNB3

-2) således fører til en trunkeret uORF og en tredje konstruktion med SNP allel guanin, hvori start codonen af ​​den trunkerede uORF er tændt fra (

CHRNB3

-3). En oversigt over de konstruktioner, der anvendes i vores eksperimenter er vist i tabel 1.

Cell kultur

De humane embryonale nyreceller (HEK) 293 blev købt fra Cellelinjer tjeneste (CLS, Eppelheim, Tyskland). Dyrkning af celler blev udført i T75 kolber i monolag med DMEM (Sigma-Aldrich, Hamborg, Tyskland) indeholdende 4,5 g glucose, 10% FBS, 1% L-glutamin og 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland). Cellerne blev holdt i en fugtig atmosfære ved 37 ° C og 5% CO

2.

HEK 293-celler blev co-transficeret med reporterplasmidet pGl4.10 + TK indeholdende 5’UTR af α4 isoform 1 og 2, α5 og SS3 henholdsvis og kontrol plasmid pGL4.74 i et forhold 20:01 hjælp transit ®-LT1 transfektionsreagens (MoBiTec, Gottingen, Tyskland) med 24 timer transfektion forud for luciferase assay og qPCR henholdsvis .

Luciferase assay

HEK293-celler blev podet 24 timer før transfektion med 3 × 10

5-celler i 24 brønds plader (Greiner bio-one, Frickenhausen, Tyskland). Ildflue og Renilla luciferase-aktiviteter blev målt med Tristar LB941 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Tyskland) Dual-Glow® luciferase assaysystem (Promega, Mannheim, Tyskland) ifølge producentens protokol. Forholdet mellem ildflue-luciferase og renilla luciferaseaktivitet blev bestemt og normaliseret til pGL4.10 + TK. De forskellige 5’UTR konstruktioner er udtrykt som gange ændring til pGL4.10 + TK.

Alle eksperimenter blev gentaget uafhængigt tre gange med tredobbelte prøver. En to-halet t-test blev anvendt til at sammenligne værdierne af testprøverne og kontrolprøver. En

s

værdi på

s

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle data er udtrykt som gange ændring og som gennemsnit ± SEM.

qPCR

Kvantitativ realtids-PCR blev udført hvis luciferaseanalyse viste signifikante resultater. Co-transfektion med de forskellige konstruktioner blev udført som beskrevet ovenfor. RNA blev ekstraheret ved anvendelse af et Qiagen RNAeasy kit, herunder DNase-behandling på 10 min, ifølge producentens protokol (Qiagen, Hilden, Tyskland). Første streng cDNA-syntese blev udført under anvendelse af 1 ug totalt RNA fra hver transfektion som udgangsmateriale (iScript ™ cDNA-syntese kit, Bio-Rad, Munchen, Tyskland). Real-time PCR blev udført målretning ildflue luciferase (mål) og Renilla luciferase (kontrol) kodende sekvens under anvendelse af følgende primere ildflue-fwd 5′- TGCAACACCCCAACATCTTC-3 ‘og ildflue-rev 5′- CCTTTAGGCACCTCGTCCAC-3’; renilla-fwd 5’AATGGCTCATATCGCCTCCT-3 ‘og renilla-rev 5′-CACGACACTCTCAGCATGGA-3’. Forstærkning effektivitet og test linearitet (korrelationskoefficient R

2) blev vurderet for hver primer par (fig. S1). Reaktionerne blev udført i 20 pi volumener indeholdende 10 pi SsoFast

TM EvaGreen

® Supermix (Bio-Rad, Munchen, Tyskland), 125 nM af hver primer, 7 pi molekylærbiologisk kvalitet vand og 1 pi af hver skabelon efter cDNA-syntese. Termisk cykling bestod af denaturering (98 ° C i 5 s), annealing og ekstension (60 ° C i renilla; 62 ° C i ildflue i 5 s), udført i 50 cyklus trin i Mini Opticon CFD-3120 cyklusapparat (Bio- Rad, München, Tyskland). Smeltekurveanalyse varierede fra 65 ° C til 95 ° C med 0,5 ° C intervaller. Alle forsøg blev gentaget uafhængigt tre gange med tredobbelte tekniske prøver. En to-halet t-test blev anvendt til at sammenligne værdierne af de målstikprøver og kontrolprøver. En

s

værdi på

s

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

CHRNA3

CHRNA7

i silico

analyse viste, at hverken 5’UTR i

CHRNA3

isoform 1 (NM_000743.4) og isoform 2 (NM_ 001.166.694,1) eller på

CHRNA7

isoform 1 (NM_000746.5) og isoform 2 (NM_001190455.2) indeholder formodede uORFs (fig. 1). Derfor blev disse to subtype gener ikke inkluderet i undersøgelsen.

CHRNA4

isoform en 5’UTR huser en funktionel uORF

To forskellige

CHRNA4

findes mRNA varianter. Isoform 1 (NM_000744.6) udviser en 5’UTR længde på 231 nt mens isoform 2 (NM_001256573.1) er kendetegnet ved en længere 5’UTR (690 nt) på grund af kodning region forskelle, der medfører en længere nedstrøms translationsinitiering. I 5’UTR i

CHRNA4

isoform en én formodede uORF 60 nt længde kunne være placeret

in silico

(fig. 1). Sin start codon omfattet af en tilstrækkelig Kozak konsensussekvens (på grund af guanin i position -3). Konstruktionerne

CHRNA4

-iso1-1 og

CHRNA4

-iso1-2 blev testet ved luciferaseanalyse (tabel 1 og S1). Resultaterne viste, at slukke for uORF signifikant forøget

CHRNA4

-iso1-1 proteinekspression med 4,8 gange (

CHRNA4

-iso1-1 0,6 ± 0,09;

CHRNA4

– iso1-2 2,9 ± 0,43;

s

= 0,013) (figur 2A)

A: Luciferase assay af

CHRNA4

isoform en 5’UTR resulterede i signifikant stigning.. protein udtryk, når slukket for uORF. Fold ændring af ildflue aktivitet normaliseret til pGl4.10 + TK, er illustreret for de tre forskellige konstruktioner; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNA4

-iso1-1; 3,

CHRNA4

-iso1-2. B: uORF ATG af

CHRNA4

-iso1 er i stand til at initiere translation, hvilket resulterer i en langstrakt ildflue protein. Fold ændring af ildflue aktivitet normaliseret til pGl4.10 + TK, er illustreret for de fem forskellige konstruktioner; 1, pGl4.10 + TK; 2, pGl4.10; 3,

CHRNA4

-iso1-2; 4,

CHRNA4

-iso1-3; 5,

CHRNA4

-iso1-4. C: Relativ qPCR for

CHRNA4-ISO1

5’UTR viste ingen signifikante forskelle i mRNA beløb, når man sammenligner intakt med slettet uORF. Fold ændring af ildflue mRNA normaliseret til pGl4.10 + TK, er illustreret for de tre forskellige konstruktioner; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNA4

-iso1-1; 3,

CHRNA4

-iso1-2. D: Ingen af ​​de fem uORFs af

CHRNA4

-iso2 5’UTR viste betydelige resultater. Fold ændring af ildflue aktivitet normaliseret til pGl4.10 + TK, er illustreret for de syv forskellige konstruktioner; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNA4

-iso2-uORF1-5; 3,

CHRNA4

-iso2-uORF1; 4,

CHRNA4

-iso2-uORF2; 5,

CHRNA4

-iso2-uORF3; 6,

CHRNA4

-iso2-uORF4; 7,

CHRNA4

-iso2-uORF5. Fejl- søjler repræsenterer ± SEM af 3 biologiske replikater. Stjerner angiver signifikante forskelle (

s

0,05).

Nogle, men ikke alle uORFs oversættes til protein. I et næste skridt derfor undersøgt vi hvis ATG codon af

CHRNA4-

iso1-1 uORF er i stand til at initiere protein oversættelse, hvilket ville være en forudsætning for oversættelse af uORF selv. En translateret uORF med et muteret stopkodon, klonet i ramme med ildflue ORF bør føre til syntese af et langstrakt ildflue protein. De to konstruktioner

CHRNA4-

iso1-3 og

CHRNA4-

iso1-4 blev sammenlignet med

CHRNA4

-iso1-2. Den uORF blev sat i ramme med ildflue-ORF for alle 3 konstruktioner. Resultaterne viste hverken en signifikant forskel i proteinekspression skifter mellem

CHRNA4

-iso1-2 og

CHRNA4-

iso1-3 eller mellem

CHRNA4

-iso1-2 og

CHRNA4-

iso1-4 (

CHRNA4

-iso1-2 1,47 ± 0,59;

CHRNA4

-iso1-3 0,94 ± 0,25;

s

= 0,542

CHRNA4

-iso1-2 1,47 ± 0,59;

CHRNA4

-iso1-4 0,83 ± 0,26;

s

= 0,471). Sammenligning af

CHRNA4

-iso1-4 med kontrol vektor pGL4.10 afslørede en stigning i protein udtryk, der ikke nåede signifikans (

CHRNA4

-iso1-4 0,83 ± 0,26; pGL4.10 0,03 ± 0,01;..

s

= 0,067) (figur 2B)

for at analysere, om resultaterne af luciferaseanalyse skyldtes en transkriptionel eller en translationel effekt, vi udførte relativ kvantitativ real -time PCR (qPCR). Når man sammenligner mRNA mængde af celler transficeret med konstruktionerne

CHRNA4

-iso1-1 og

CHRNA4

-iso1-2 sås ingen signifikante ændringer mellem intakt og slettet uORF (

CHRNA4

-iso1-1 1,23 ± 0,29;

CHRNA4

-iso1-2 1,05 ± 0,22;..

s

= 0,702) (figur 2C)

5 ‘UTR af

CHRNA4

isoform 2 indeholder fem formodede uORFs spænder fra 18 til 60 nt i længde (fig. 1). Konstruktionen med kun intakte uORFs blev sammenlignet med konstruktioner, hvor hver af de fem uORFs blev slukket (tabel 1 og S1). Resultaterne viste ingen signifikante forskelle vedrørende intakt versus slukket uORF. Dette gælder især for de mest 5’uORF som er til stede i både

CHRNA4

isoformer. Dette uORF syntes at være funktionel i den isoformen med den kortere 5’UTR (se ovenfor), men forårsagede ingen ændringer i proteinekspression, når den er slukket i isoformen med den længere 5’UTR (fig. 2D). (

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

CHRNA4

-iso2-uORF1 0,13 ± 0,02;

s

= 0,644;

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

CHRNA4

-iso2-uORF2 0,14 ± 0,03;

s

= 0,607;

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

CHRNA4

-iso2-uORF3 0,14 ± 0,02;

s

= 0,427;

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

CHRNA4

-iso2-uORF4 0,15 ± 0,03;

s

= 0,514;

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

CHRNA4

-iso2-uORF5 0,12 ± 0,02 ;.

s

= 0,926)

En sammenligning af de to vildtype isoformer

CHRNA4

-iso1-1 og

CHRNA4

-iso2-uORF1-5, resultaterne viste, at proteinet udtryk for sidstnævnte blev reduceret signifikant (

CHRNA4

-iso1-1 0,6 ± 0,09;

CHRNA4

-iso2-uORF1-5 0,12 ± 0,02;

p

= 0,014).

CHRNA5

5’UTR indeholder en post-transkriptionelt funktionel uORF

CHRNA5

5’UTR (NM_000745. 3) viste sig at indeholde en formodet uORF 30 nt længde (fig. 1). Inden for denne uORF SNP rs56182392 med fædrene allel guanin (allel frekvens 99,4%) og de sjældne allel adenin resulterer i en aminosyre udveksling fra alanin til threonin når oversat.

For at analysere

CHRNA5

uORF og dens SNP på proteinniveau testede vi vores konstruktioner af luciferase assays (tabel 1 og S1). Konstruktionerne

CHRNA5

-2 og

CHRNA5

-4 resulterede i et protein stigning på 50%, henholdsvis 65%, sammenlignet med

CHRNA5

-1 henholdsvis

CHRNA5

-3 (

CHRNA5

-1 0,76 ± 0,03;

CHRNA5

-2 1,15 ± 0,06;

s

= 0,009;

CHRNA5

-3 0,63 ± 0,08;

CHRNA5

-4 1,04 ± 0,03;

s

= 0,006). Derfor i begge tilfælde konstruktioner mangler uORF produceret betydeligt mere protein end de tilsvarende konstruktioner med intakte uORFs. Når man sammenligner de to alleler af rs56182392 (konstruktioner

CHRNA5

-1 og

CHRNA5

-3) de registrerede protein ændringer var ikke signifikant (fig. 3A).

‘UTR huser et funktionelt uORF;

CHRNB3

uORFs er ikke involveret i translationel kontrol. A: Luciferase assay af

CHRNA5

5’UTR resulterede i signifikant stigning i protein udtryk, når slukket for uORF. Fold ændring af ildflue aktivitet normaliseret til pGl4.10 + TK, er illustreret for de fem forskellige konstruktioner; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNA5

-1; 3,

CHRNA5

-2; 4,

CHRNA5

-3; 5,

CHRNA5

-4. B: uORF startkodon af

CHRNA5

ikke initiere translation så effektivt som ildflue startcodon. Fold ændring af ildflue aktivitet normaliseret til pGl4.10 + TK, er illustreret for de fem forskellige konstruktioner; 1, pGl4.10 + TK; 2, pGL4.10; 3,

CHRNA5

-2; 4,

CHRNA5

-5; 5,

CHRNA5

-6. C: Relativ qPCR for

CHRNA5

5’UTR viste ingen signifikante forskelle i mRNA beløb, når man sammenligner intakt med slettet uORF. Imidlertid blev signifikante forskelle vurderet for transskription af de to SNP allel varianter. Fold ændring af ildflue mRNA normaliseret til pGl4.10 + TK, er illustreret for de fem forskellige konstruktioner; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNA5

-1; 3,

CHRNA5

-2; 4,

CHRNA5

-3; 5,

CHRNA5

-4. D: Luciferase assay af

CHRNB3

5’UTR viste ingen signifikante resultater. Fold ændring af ildflue aktivitet normaliseret til pGl4.10 + TK, er illustreret for de fire forskellige konstruktioner; 1, pGl4.10 + TK; 2,

CHRNB3

-1; 3,

CHRNB3

-2; 4,

CHRNB3

-3. Fejl- søjler repræsenterer ± SEM af 3 biologiske replikater. Stjerner angiver signifikante forskelle (

s

0,05).

Igen, for at vurdere, om ATG codon af

CHRNA5

uORF er i stand til at initiere protein oversættelse, de to konstruktioner

CHRNA5

-5 og

CHRNA5

-6 blev sammenlignet med

CHRNA5

-2. Den uORF blev sat i ramme med ildflue-ORF for alle 3 konstruktioner. Resultaterne viste, at så længe ildflue startcodon var intakt luciferase protein blev stærkt udtrykt (

CHRNA5

-2 1,31 ± 0,30;

CHRNA5

-5 1,55 ± 0,46;

s

= 0,736). Men proteinekspression faldet med mere end 90%, når der udelukkende ATG af uORF var til stede (

CHRNA5

-2 1,31 ± 0,30;

CHRNA5

-6 0,08 ± 0,01;

s

= 0,029). Sammenligning af

CHRNA5

-6 med kontrol vektor pGL4.10 viste ingen signifikante forskelle (

CHRNA5

-6 0,08 ± 0,01; pGL4.10 0,03 ± 0,01;

s

= 0,069) (fig. 3B).

Vi derefter foretaget i forhold qPCR at udelukke en effekt på RNA-niveau som en årsag til vores resultater. Når man sammenligner mRNA mængde af celler transficeret med de respektive konstruktioner (

CHRNA5

-1;

CHRNA5

-2;

CHRNA5

-3;

CHRNA5

-4) ved relativ qPCR sås ingen signifikante ændringer mellem intakt og slettet uORF (

CHRNA5

-1 0,98 ± 0,01;

CHRNA5

-2 0,97 ± 0,01;

p

= 0,369;

CHRNA5

-3 1,05 ± 0,01;

CHRNA5

-4 1,10 ± 0,05;

s

= 0,459) (figur 3C).. Følgelig har uORF ikke kvantitativt ændre mRNA-niveauet. Construct

CHRNA5

-3 indeholder den sjældne En allel af rs56182392 gav betydeligt mere ildflueluciferase udskrifter end

CHRNA5

-1 (

CHRNA5

-1 0,98 ± 0,01;

CHRNA5

-3 1,05 ± 0,01;

s

= 0,011). Ikke desto mindre blev ingen signifikante forskelle mellem de to alleler set på protein niveau, og det er derfor usandsynligt, at rs56182392 har en vigtig indflydelse på

CHRNA5

funktion.

CHRNB3

uORF gør ikke påvirke proteinekspression

5’UTR af denne underenhed (NM_000749.3) indeholder en enkelt formodet uORF. Det huser en SNP (rs4950 adenin /guanin) med den mindre allel guanin slette den første ATG-codon af det formodede uORF, hvilket skaber en trunkeret, formodet uORF (fig. 1). De tre konstruktioner (

CHRNB3

1;

CHRNB3

-2

CHRNB3

-3), blev sammenlignet med hinanden ved luciferase assay (tabel 1 og S1). blev ikke observeret nogen signifikante forskelle mellem de tre forskellige varianter (

CHRNB3

-1 0,83 ± 0,17;

CHRNB3

-2 0,75 ± 0,02;

s

= 0,495;

CHRNB3

-1 0,83 ± 0,17;

CHRNB3

-3 0,92 ± 0,19;

s

= 0,778;

CHRNB3

-2 0,75 ± 0,02;

CHRNB3

-3 0,92 ± 0,19;

s

= 0,726). Således er vores resultater viser, at hverken længere uORF eller den trunkerede uORF versionen spiller en rolle i reguleringen af ​​protein oversættelse (fig. 3D).

Diskussion

De data, der præsenteres her, tyder stærkt på, at uORFs inden 5’UTR i

CHRNA4

-iso1 og

CHRNA5

er vigtige regulatorer af protein oversættelse. Desuden indikerer de, at de to kendte

CHRNA4

isoformer forskellige med hensyn til deres virkning på genekspression niveau. Indflydelsen af ​​

CHRNA4

-UTR på genekspression blev også tidligere rapporteret af Briggs et al. De udtrykte ilder

CHRNA4

og

CHRNB2

sammen med /eller uden deres tilsvarende UTR’er i oocytter. Interessant nok blev udelukkende den høje følsomhed og ingen lav følsomhed receptortype detekteres, når den UTR var til stede. Imidlertid blev putative regulatoriske UTR elementer ikke analyseret i detaljer i denne undersøgelse [23].

I forhold til den kortere isoform, tilstedeværelsen af ​​den lange 5’UTR af

CHRNA4

signifikant reduceret luciferaseekspression . Ingen af ​​de fem uORFs stede i denne isoform viste nogen virkning på genekspression ved hammerslaget ud enkeltvis. Dette gør det usandsynligt, at de er ansvarlige for reducerede genekspression der er forbundet med den længere

CHRNA4

isoform. Vi kan ikke helt udelukke muligheden for, at en samtidig knock out af alle fem uORFs ville have haft en effekt på genekspression, men tilstedeværelsen af ​​andre undertrykkende regulatoriske sekvens motiver eller RNA folde begivenheder, enten destabilisere mRNA eller bremse oversættelse synes at være mindst lige så sandsynlige forklaringer.

Interessant uORF fundet at være funktionel i den

CHRNA4

isoform med kortere 5’UTR er også til stede i det lange 5’UTR-isoform, men ikke synes at reducere genekspression i sidstnævnte sekvenskontekst. Så vidt vi ved dette udgør det første eksempel på en uORF med isoformspecifik funktionel relevans. Årsagerne denne observation er hidtil ukendte. Vores forlængelses forsøg antyder, at ATG af den korte isoform er i stand til at initiere translation af uORF. Men denne effekt var temmelig små, og resultaterne var ikke signifikant. Derfor oversættelse af uORF protein kan bidrage, men er usandsynligt, at være den vigtigste årsag til denne observation. Det er også muligt, at den tilstrækkelige Kozak konsensussekvensen [24] omfattende den uORF startcodon muliggør tilstrækkelig ribosom anerkendelse. Ribosom stalling har derfor betragtes som en alternativ mekanisme til de observerede på proteinniveau effekter. Det kan kun spekuleret hvorfor samme uORF syntes at være ikke-funktionelt ved analyse i det lange 5’UTR-

CHRNA4

isoform. En mulig årsag kan være tilstedeværelsen af ​​yderligere, hidtil ukendte regulatoriske motiver, som kun eksisterer i det lange 5’UTR-

CHRNA4

5’UTR og er i stand til at hæmme uORF funktion. Det er allerede blevet vist, at de lovgivningsmæssige rolle i det mindste nogle uORFs kan være tæt knyttet til andre 5’UTR-sekvens motiver [25]. Men uORF beskrevet i denne tidligere rapport var kun funktionel, hvis yderligere regulatoriske motiver var til stede.

CHRNA4

uORF diskuteret her ville kræve den modsatte mekanisme, dvs. en undertrykkelse af sekvensmotiver ukendt.

Med hensyn til enkelt uORF af

CHRNA5

, vores forsøg viste ingen klar indikation at uORF startcodonen er i stand til at initiere translation af ildflue klonet nedstrøms for den. Den mest sandsynlige forklaring på denne observation ville være den lave styrke Kozak-sekvens omgiver uORF-ATG. Denne svage sekvens motiv vil sandsynligvis reducere sandsynligheden for, at ribosomer genkender uORF-ATG og initiere translation på dette site. Men det faktum, at vi ikke var i stand til at observere en signifikant forskel i ekspressionsniveauerne mellem kontrol vektor og en konstruktion, hvor uORF startcodon tjente som den eneste fungerende translationsinitieringsstedet (

CHRNA5

-6) gør ikke nødvendigvis implicerer, at oversættelsen af ​​uORF er helt udelukket som mulig mekanisme. Men i betragtning af den imponerende effekt på proteinekspression den uORF viste i nærvær af egen intakt stopkodon det er usandsynligt, at denne stærke virkning resulterede udelukkende fra en svag translation af uORF proteinet. Dette tyder på, at i modsætning til

CHRNA4

uORF beskrevet ovenfor,

CHRNA5

uORF er ikke en del af gruppen af ​​sekvens-afhængige uORFs der opnår deres virkninger ved at kode små proteiner, der spiller en aktiv rolle i translationelle kontrolmekanismer. Således andre mekanismer har der skal tages i betragtning, herunder blokering af ribosomer på uORF eller utætte scanning. Den motorstop mekanisme opstår, når ribosomer op med at bevæge løbet uORF oversættelse [26]. Men en start codon, der ikke er i stand til at opnå tilstrækkelig oversættelse er også usandsynligt, at forårsage betydelig ribosom stå. Utæt scanning synes at være en mere plausibel forklaring på de observerede virkninger. Denne mekanisme forekommer især hvis startkodonet af uORF er omfattet af en dårlig start codon sammenhæng sekvens som forekommer i uORF af

CHRNA5

. Som et resultat, nogle ribosomer genkende startkodonen af ​​uORF og initiere, andre omgå det og initiere ved næste startkodonen.