PLoS ONE: plasminogenaktivatorinhibitor-2 spiller en ledende Prognostisk Rolle blandt Protease Familier i ikke-småcellet lungekræft

abstrakt

Baggrund

I lungekræft, uPA, dens receptor (uPAR), og inhibitorerne PAI-1 og PAI-2 i plasminogenaktivatoren familie vekselvirke med MMP-2 og MMP-9 i MMP familien at fremme udviklingen af ​​kræft. Men det er stadig ubestemt hvilke af disse markører spiller den vigtigste rolle og kan være den mest nyttig indikator for at stratificere patienterne ved risiko.

Metoder

Vi bestemmes den enkelte prognostiske værdi af disse 6 markører ved at analysere en afledning kohorte med 98 ikke-små patienter celle lungekræft ved immunhistokemisk farvning. Sammenhængen mellem de IHC ekspressionsniveauerne af disse markører og sygdomme prognose blev undersøgt, og en immunhistokemisk panel til prognostisk forudsigelse blev efterfølgende genereret gennem prognostisk model analyse. Værdien af ​​den immunhistokemiske panel blev derefter bekræftet af en validering kohorte med 91 lungekræftpatienter

Resultater

I afledning kohorte, PAI-2 er den mest kraftfulde prognostiske faktor (HR = 2,30.;

P

= 0,001), efterfulgt af MMP-9 (HR = 2,09;

P

= 0,019) ifølge multivariat analyse. Når man kombinerer PAI-2 og MMP-9, den mest ugunstige prognostiske gruppe (lav PAI-2 og høje MMP-9 IHC ekspressionsniveauer) viste en 6,40-fold øget risiko for en dårlig prognose i forhold til den gunstigste prognostiske gruppe (høj PAI -2 og lave MMP-9 IHC ekspressionsniveauer). PAI-2 og MMP-9 IHC panel kunne mere præcist at identificere højrisikopatienter i både afledning og validering kohorte.

Konklusioner

Vi afslørede PAI-2 som den mest magtfulde prognostiske markør blandt PA og MMP protease familien selv efter at deres tætte relationer med hinanden. Ved at anvende en kombination af PAI-2 og MMP-9, mere præcise prognostisk information end blot at bruge patologisk stadium alene kan opnås for lungecancerpatienter

Henvisning:. Su CY, Liu YP, Yang CJ, Lin YF , Chiou J, Chi LH, et al. (2015) plasminogenaktivatorinhibitor-2 spiller en ledende Prognostisk Rolle blandt Protease Familier i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 10 (7): e0133411. doi: 10,1371 /journal.pone.0133411

Redaktør: Joseph Najbauer, University of Pécs Medical School, UNGARN

Modtaget: 12. februar 2015; Accepteret: 26 Juni 2015; Udgivet: 31 Juli 2015

Copyright: © 2015 Su et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er stadig den mest dominerende årsag til kræft dødsfald på trods af fremskridt i behandlingsstrategier [1]. Stage ledelse blev generelt brugt som guide til at beslutte, hvilke patienter bør modtage kirurgi, kemoterapi eller strålebehandling, eller målrettet terapi [2]. Der blev imidlertid anderledes prognose ikke ualmindelig hos patienter inden for samme fase. Selv høje risikofaktorer såsom dårligt differentierede tumorer og vaskulære eller pleural engagement blev anbefalet at blive brugt som supplerende indikatorer for mere aggressiv behandling, disse risikofaktorer alene er stadig ikke nok til at præcist stratificere patienterne ved risiko [3,4]. Derfor er mere nye prognostiske prædiktive markører presserende behov for at vejlede terapeutisk beslutningstagning. For nylig har undersøgelser, der sammenligner og kombinerer markører for kræft regulatoriske veje, såsom veje kontrollerende tumor spredning [5] og epitel-mesenkymale overgang [6] med det formål at generere større prognostisk effekt at identificere højrisikopatienter fået stigende opmærksomhed .

i lungekræft, den høje forekomst af lokal aggressivitet og metastatisk adfærd er en af ​​de vigtigste årsager til kræft dødelighed og kan føre til behandlingssvigt [7]. Ekstracellulære matrix (ECM) nedbrydning er en af ​​de mest afgørende trin i lokal invasion og fjernmetastase [8]. Plasminogenaktivatoren (PA) -familien og matrixmetalloproteinase (MMP) familien er to velkendte protease familier, der spiller vigtige roller i ECM nedbrydning under cancer progression [9,10], og deres medlemmer er blevet rapporteret at være nyttige prognostiske markører i lungekræft. Høj ekspressionsniveauer af urokinase-plasminogenaktivator (uPA), dets receptor (uPAR), og plasminogenaktivatorinhibitor type 1 (PAI-1) i PA familie og matrixmetalloproteinase 2 (MMP-2) og matrixmetalloproteinase 9 (MMP- 9) i MMP familien er blevet korreleret med en dårlig prognose og ugunstige klinisk-patologiske parametre [11-18]. I modsætning hertil patienter med højt plasminogenaktivatorinhibitor type 2 (PAI-2) ekspressionsniveauer tendens til at have en gunstig prognose [19-21]. Men i nogle cancertyper, såsom endometrie og colorektale cancere, blev høj PAI-2-ekspression er forbundet med dårlig prognose [22,23], høj PAI-2-ekspression blev også vist at være korreleret med bedre prognose i bryst- og ovariecancer [24, 25].

Foruden at fungere alene, molekyler i PA og MMP familier også interagere med hinanden for yderligere at modulere processen med ECM-nedbrydning i et kompliceret måde (S1 fig). Plasmin, som aktiveres fra plasminogen ved binding af uPA til uPAR, kan nedbryde ECM’en direkte eller indirekte gennem den proteolytiske aktivering af MMP-2 og MMP-9 [26]. Når enten PAI-1 eller PAI-2 er til stede, er evnen hos uPA til at aktivere plasmin inhiberes, og igen er ECM nedbrydning inhiberes også. Imidlertid har uPA-PAI-1-komplekser også blevet rapporteret at øge MMP-2 og MMP-9-ekspression plan gennem downstream signalvej [27], hvorimod uPA-PAI-2-kompleks har vist sig at lette clearance af uPA uden at aktivere nedstrøms signalering [28]. Desuden kan MMP-9 kan forbedre uPA-aktivitet ved at regulere proteasenexin-1-spaltning [29]. Disse markører danner et komplekst netværk, der regulerer balancen i ECM nedbrydning i tumormikromiljøet.

Derfor identifikation af de vigtigste markører inden signaleringsnetværket for prognostisk og terapeutisk beslutning vil øge den kliniske værdi. Snarere end at fokusere på en enkelt markør, vores primære interesse i denne undersøgelse var at vurdere og sammenligne den prognostiske værdi af markører i PA og MMP familier, og at evaluere deres kombinerede virkninger. Efter immunhistokemisk farvning af klinisk ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) prøver at bestemme ekspressionsniveauerne af komponenterne i dette netværk, blev en tre-trins fremgangsmåde, der anvendes til at integrere de prognostiske værdier uPA, uPAR, PAI-1, Pai-bar 2, MMP-2, og MMP-9. Vi først verificeret sammenhængen mellem disse 6 markører og derefter foretaget en multi-markør vurdering, hvor vi identificeret PAI-2 som markør med den største prognostiske værdi og MMP-9 som den anden mest magtfulde prognostisk indikator. Endelig en praktisk IHC panel bestående af PAI-2 og MMP-9 blev genereret for forbedret prognostisk nytte.

Materialer og metoder

Etik redegørelse og Patienter

Undersøgelsen var udføres med godkendelse af Institutional Review Boards og med tilladelse fra etiske komitéer i den pågældende institution (KMUH-IRB-20.110.286), Institutional Review Board of Kaohsiung Medical University Chung-Ho Memorial Hospital. Ingen informeret samtykke blev nødvendig, fordi de blev analyseret anonymt. Ingen patienternes behandlinger blev ændret med henblik på denne undersøgelse.

I alt 98 NSCLC patienter, herunder 61 tilfælde af adenocarcinom, 31 tilfælde af pladecellekræft og 6 tilfælde af store celle karcinom, fra Kaohsiung Medical Universitetshospital Taiwan 1991-2007 blev indskrevet som afledning kohorte (S1 tabel). Alle patienter fik standard behandlingsprotokoller efter hospitalets retningslinjer. Patienter med operabel fase I-III NSCLC undergik lobectomy eller pneumonectomy med mediastinal lymphadenectomy. Patienter med resektabel fase II og III NSCLC blev behandlet med postoperativ adjuverende platinbaseret kemoterapi. Patienter med ikke-resektabel lokalt fremskreden eller metastatisk sygdom fået kemoterapi med eller uden strålebehandling. Repræsentative 1-mm-diameter kerner fra hver tumor med morfologiske træk, der var typiske for diagnosen blev opnået fra formalinfikseret paraffinindlejret væv til at generere et væv microarray (TMA). Samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) blev defineret som intervaller fra den indledende behandling, indtil døden eller indtil recidiv, metastaser, eller død, henholdsvis. Alle sager blev iscenesat i henhold til den amerikanske Blandede kræft iscenesættelse manual, og de histologiske kræfttyper blev klassificeret i henhold til kriterierne i World Health Organization klassifikation. En anden ikke-småcellet lungekræft TMA med 91 sager blev købt fra SuperBioChips (CC5 og CCA4, SuperBioChips Laboratories, Seoul, Korea) som validering kohorte (S1 tabel).

immunhistokemisk (IHC) farvning og fortolkning

IHC farvning for uPA, uPAR, PAI-1, PAI-2, MMP-2, og MMP-9 blev udført på serielle 5-mikrometer tykke vævssnit skåret fra vævet microarray (TMA). Før farvning på TMA af afledning og validering kohorte, vi testede og titreres det primære antistof på en test-TMA, som indeholder 6 normale lungevæv og 6 NSCLC væv. En farvning tilstand, som vi kan skelne farvningen intensitet mellem tilfælde blev betragtet som et passende farvning tilstand. Efter bestemme farvningen betingelse for alle markører, IHC-farvning blev udført under anvendelse af en automatiseret immunostainer (Ventana Discovery XT automatiske farvningsanordning, Ventana, USA) for uPA, uPAR, PAI-1, PAI-2, og MMP-9. Objektglassene blev farvet med et polyklonalt kanin-anti-PAI-1-antistof (sc-8979, 01:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), et polyklonalt kanin-anti-PAI-2-antistof (16.035-1-AP, 1 : 50; Proteintech, Chicago, USA), et polyklonalt kanin-anti-uPA-antistof (sc-14019, 01:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), et polyklonalt kanin-anti-uPAR-antistof (GTX100466, 1: 750; GeneTex, Taipei, Taiwan) og et polyklonalt kanin-anti-MMP-9-antistof (# 2270, 01:50; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Manuel IHC-farvning blev udført for MMP-2. Kort fortalt blev objektglassene udsættes for varme-induceret antigen-genvinding i 10 minutter med DAKO antigen hentning buffer (pH 6) og inkuberet ved 4 ° C natten over med et polyklonalt kanin-anti-MMP-2-antistof (10.373-2-AP, 1: 50; Proteintech, Chicago, USA) og derefter visualiseret under anvendelse af en 3, 3′-diaminobenzidin (DAB) peroxidasesubstrat kit (Vector Laboratories, USA). Negativ kontrol blev udført ved at erstatte det primære antistof ved en kanin polyklonalt IgG isotypekontrol (ab27478, 1: 100; Abcam, Cambridge, UK). (S2 Fig)

IHC-farvning blev uafhængigt analyseret ved 2 patologer (Chia -yi Su og Michael Hsiao), som blev blindet for patientens udfald. Vi tilpasset IHC scoring metoder fra tidligere undersøgelser at indføre en ensartet IHC scoring kriterier for alle 6 markører. Ligesom scoringssystem anvendes af tidligere forskning fokuseret på PA familien [20] og MMP-2 og MMP-9 [17], både den cytoplasmatiske farvningsintensitet og procentdelen (0-100%) af tumorcellerne farves blev registreret i nærværende studie . Den farvningsintensitet blev scoret med en fire-tier skala: 0, negativ; 1+, svag; 2+, moderat; 3+, stærk. Højt IHC ekspressionsniveauet blev defineret som en farvning intensitet på 2+ eller 3+ i mere end 25% af tumorcellerne, og de andre tilfælde blev anset at have lav IHC ekspressionsniveauer (S3 Fig).

Statistiske analyse

Den statistiske analyse blev udført under anvendelse af SPSS 17.0 software (SPSS, USA). Korrelationer for IHC ekspressionsniveauet af alle 6 markører blev vurderet ved anvendelse Spearman rang korrelationsanalyse. De overlevelsesrater blev estimeret ved hjælp af Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og univariate og multivariate Cox regressionsanalyse. Til analysen med flere sammenligninger, Benjamini og Hochberg falsk opdagelse sats (FDR) -corrected

P

værdi blev brugt, og en FDR-korrigeret

P Drømmeholdet værdi ≤ 0,05 blev betragtet som signifikant [30] . For den prognostiske model analyse blev en mere kompleks model genereret ved at tilføje hver markør sekventielt i den tidligere prognostisk model til at bestemme, om den ekstra markør væsentligt forbedret den prognostiske forudsigelse. Forskellen mellem modellerne blev sammenlignet ved arealet under kurven (AUC) for ROC (Modtager operativ karakteristik) kurve, følsomhed og specificitet. For alle analyser, en

P Drømmeholdet værdi. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Verifikation af sammenhængen mellem IHC ekspressionsniveauer af uPA, uPAR, Pai-bar 1, PAI-2, MMP-2, og MMP-9 i NSCLC

første, for at kontrollere, om der er signifikante korrelationer mellem IHC ekspression status uPA, uPAR, PAI-1, PAI-2 , MMP-2, og MMP-9 blev Spearman rang korrelationsanalyse udført i vores afledning kohorte. Resultaterne identificeret signifikante sammenhænge (

P

0,01) mellem PAI-1 og uPA og uPAR IHC ekspressionsniveauerne (ρ = 0,616 og 0,431 henholdsvis), mellem uPA og uPAR IHC ekspressionsniveauerne (ρ = 0,571) , mellem MMP-9 og uPA og uPAR IHC ekspressionsniveauerne (ρ = 0,354 og 0,322, henholdsvis), og mellem MMP-2 og uPA IHC ekspressionsniveauerne (ρ = 0,261). blev observeret en signifikant omvendt korrelation mellem IHC ekspressionsniveauer af PAI-2 og uPA (ρ = -0,246;

P

= 0,015), og PAI-2 IHC ekspressionsniveauet også tendens til at være negativt korreleret med IHC ekspressionsniveauerne af andre markører (tabel 1). IHC illustrationerne i fig 1A repræsenterer serielle sektioner af en lunge adenocarcinom med lav PAI-2 farvningsintensitet og høj farvningsintensitet af alle 5 af de andre markører.

(A) En repræsentativ lunge adenocarcinom med lavt IHC ekspressionsniveau af PAI-2 og høje IHC ekspressionsniveauer af PAI-1, uPA, uPAR, MMP-2, og MMP-9, som påvist ved IHC. Fotografier blev taget ved en forstørrelse på 400 ×. Scale søjler repræsenterer 100 um. (B) Kaplan-Meier-kurver over total overlevelse i forhold til PAI-1, PAI-2, uPA, uPAR, MMP-2, og MMP-9 IHC ekspressionsniveauer i NSCLC. Lavt IHC ekspressionsniveauet af PAI-2 blev signifikant associeret med kortere samlet overlevelse (

P

0,001), som var højt IHC ekspressionsniveauer af PAI-1, uPA, MMP-2, og MMP-9 (

P

= 0,015,

P

= 0,031,

P

= 0,041,

P

= 0,037, henholdsvis). (C) Kaplan-Meier-kurver over sygdomsfri overlevelse i forhold til PAI-1, PAI-2, uPA, uPAR, MMP-2 og MMP-9 IHC ekspressionsniveauer i NSCLC. Lavt IHC udtryk niveau af PAI-2 blev signifikant associeret med kortere sygdomsfri overlevelse (

P

0,001); høje IHC ekspressionsniveauer af PAI-1, uPA, og MMP-9 blev også signifikant associeret med kortere sygdomsfri overlevelse (

P

= 0,019,

P

= 0,017,

P

= 0,021, henholdsvis).

Bestemmelse af de største prognostiske betydning af PAI-2 og MMP-9 blandt PA og MMP familien markører

for at bestemme den enkelte prognostisk effekt af disse 6 markører, vi først vurderet sammenhængen mellem deres IHC ekspressionsniveauerne og patientresultater af Kaplan-Meier overlevelsesanalyse i afledningen kohorte. Lav PAI-2 IHC ekspressionsniveauet var signifikant korreleret med en dårlig prognose (

P

0,001 for både samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS)) (fig 1B og 1C). Højt IHC ekspressionsniveauet af PAI-1, uPA, og MMP-9 også korreleret med en dårlig prognose. Høj MMP-2 IHC ekspressionsniveauet var forbundet med en ugunstig OS men var ikke associeret med DFS. UPAR IHC ekspressionsniveauet blev ikke korreleret med enten OS eller DFS. Desuden gennem klinisk-patologisk analyse blev en signifikant sammenhæng mellem lav PAI-2 IHC ekspressionsniveauet og højere patologisk stadie (

P

= 0,027) fundet (S1 Table og S4 Fig). Tværtimod høje IHC ekspressionsniveauer af andre markører tendens til at have en sammenhæng med højere patologisk stadium. De korrelationer mellem hver markør og andre klinisk-patologiske karakteristika er sammenfattet i S1 tabel.

På grund af den signifikant korrelation mellem hver markør i korrelationsanalysen blev en multivariat analyse udført for at bestemme deres respektive prognostiske roller (tabel 2). For DFS, lav PAI-2 IHC ekspressionsniveauet (hazard ratio [HR] = 2,30; 95% konfidensinterval [CI] = 1,40-3,79;

P

= 0,001), høj MMP-9 IHC ekspressionsniveauet ( HR = 2,09; 95% CI = 1,13-3,88;

P

= 0,019), og en højere patologisk stadie (HR = 3,44; 95% CI = 2,03-5,84;

P

0,001) forblev uafhængigt korreleret med en ugunstig prognose. Med hensyn til OS, kun PAI-2 IHC ekspressionsniveauet (HR = 2,52; 95% CI = 1,50-4,22;

P

0,001) og patologisk stadium (HR = 4,14; 95% CI = 2.39- 7.16;

P

0,001) bevaret en betydelig indflydelse. Efter falsk opdagelse sats korrektion for multiple test, PAI-2 (

P

= 0,01) og MMP-9 (

P

= 0,05) havde stadig prognostisk betydning i DFS. Disse resultater viste, at PAI-2 har den førende prognostisk værdi og MMP-9 er den anden mest betydningsfulde prognostiske markør mellem flere markører i PA og MMP familier.

Oprettelse af et IHC panel bestående PAI-2 og MMP-9 for mere præcis prognostisk forudsigelse i NSCLC-patienter Salg

på baggrund af resultaterne, at PAI-2 havde den største prognostiske værdi, og at MMP-9 var den anden mest kraftfulde prognostisk markør i den multivariate analyse, en prognostiske modelanalyse, overlevelse analyse, og ROC-kurve til afprøvning af arealet under kurven (AUC), følsomhed og specificitet blev udført for at undersøge hensigtsmæssigheden af ​​at kombinere PAI-2 og MMP-9 som et IHC panel. I den prognostiske model analyse (S3 Table), tilføjer PAI-2 og MMP-9 til den patologiske stadium variabel resulterede i den højeste forudsigelseskraft for DFS, men tilføje flere markører ikke yderligere at forbedre forudsigelseskraft. Ved at kombinere PAI-2 og MMP-9 som et IHC panel kunne patienterne opdeles i tre grupper. Patienter med høj PAI-2 og en lav MMP-9 ekspressionsniveauer havde den mest gunstige prognose og patienter med lav PAI-2 og høje MMP-9 ekspressionsniveauer havde den mest ugunstige prognose (

P

0,001 for både OS og DFS) (fig 2A). I ROC-kurve, blev forøgelse af arealet under kurven (AUC) set i sygdomsfri overlevelse efter kombination PAI-2 og MMP-9 som et panel (fig 2A og S4 tabel). Varmen map viste de IHC ekspressionsniveauerne af PAI-2 og MMP-9 i individuelle patienter klynger ved slutpunkt overlevelse status (Fig 2A). Patienter, som var døde ved endepunktet tendens til at have lav PAI-2 og høje MMP-9 IHC ekspressionsniveauer. Desuden blev den kumulative prognostiske virkning af PAI-2 og MMP-9 også undersøgt. Sammenlignet med den gunstigste prognostiske gruppe (høj PAI-2 og en lav MMP-9 IHC ekspressionsniveauer), den mest ugunstige prognostiske gruppe (lav PAI-2 og høje MMP-9 IHC ekspressionsniveauer) viste en 6,40-fold (95% CI = 2,64-15,52;

P

0,001) øget risiko for en dårlig prognose efter justering for patologisk stadie (tabel 3). Fig 2B viser repræsentative eksempler på brugen af ​​PAI-2 og MMP-9 IHC panel i NSCLC prøver. Patient 1, som havde fase I adenocarcinom med høj PAI-2 og lave MMP-9 IHC ekspressionsniveauerne, var i live ved den sidste opfølgning. I modsætning hertil patient 2 havde stadie IV adenocarcinom med lav PAI-2 og høje MMP-9 IHC ekspressionsniveauer og døde 2 måneder efter behandlingen påbegyndes. Patient 3 og patient 4 blev begge diagnosticeret med stadium III adenocarcinom. Patient 3 havde høj PAI-2 og en lav MMP-9 IHC ekspressionsniveauer og var i live og havde ingen tumortilbagevenden ved det endelige opfølgning. I modsætning hertil patient 4, som havde lav PAI-2 og høje MMP-9 IHC ekspressionsniveauerne, erfarne tumor tilbagefald inden for 9 måneder og døde 14 måneder efter behandlingen påbegyndes.

(A) Kaplan-Meier plots og ROC kurve af den samlede overlevelse og sygdomsfri overlevelse for kombinationen af ​​PAI-2 og MMP-9 som et IHC panel. Patienter med høj PAI-2 og lave MMP-9 IHC ekspressionsniveauerne havde den mest gunstige prognose, hvorimod patienter med lav PAI-2 og høje MMP-9 IHC ekspressionsniveauerne havde den mest ugunstige prognose (

P

0,001 for både OS og DFS). Forøgelse af arealet under kurven (AUC) for ROC blev observeret efter kombination PAI-2 og MMP-9 som et panel i sygdomsfri overlevelse. I varmen kortet grupperet ved endepunkt overlevelse status, patienter, der var døde i slutningen-point tendens til at have lav PAI-2 og høj MMP-9 IHC ekspressionsniveauet. (B) Repræsentative billeder af brugen af ​​PAI-2 og MMP-9 IHC panel i kliniske NSCLC prøver. Patient 1 havde fase I adenocarcinom med høj PAI-2 og lave MMP-9 IHC ekspressionsniveauerne og var i live ved den endelige opfølgning. I modsætning hertil patient 2 havde stadie IV adenocarcinom med lav PAI-2 og høje MMP-9 IHC ekspressionsniveauer og døde 2 måneder efter behandlingen påbegyndes. Patienter 3 og 4 blev begge diagnosticeret med stadium III adenocarcinom. Patient 3, der havde høj PAI-2 og lave MMP-9 IHC ekspressionsniveauerne, var i live og havde ingen tumor tilbagefald i den sidste opfølgning; patient 4, som havde lav PAI-2 og høje MMP-9 IHC ekspressionsniveauer, erfarne tumortilbagevenden inden for 9 måneder og døde 14 måneder efter behandlingen påbegyndes. Fotografier blev taget ved en forstørrelse på 400 ×. Scale søjler repræsenterer 100 um. (C) Kaplan-Meier plots og ROC kurve af den samlede overlevelse i validering kohorte viste, at patienter med lav PAI-2 IHC ekspressionsniveauet (

P

= 0,002) eller høj MMP-9 IHC ekspressionsniveauet (

P

= 0,035) havde dårlig samlet overlevelse. Når stratificeret efter PAI-2 og MMP-9 IHC panel, patienter højrisikogruppen havde lav PAI-2 og høje MMP-9 IHC ekspressionsniveauerne og patienter med lav risiko gruppe havde høj PAI-2 og lav MMP-9 IHC ekspressionsniveauet (

P

0,001). Forøgelse af arealet under kurven (AUC) for ROC blev observeret efter kombination PAI-2 og MMP-9 som et panel. Varmen kort viste, at patienter, der var døde i slutningen-point tendens til at have lav PAI-2 og høj MMP-9 IHC ekspressionsniveauet.

Bekræftelse af prognostiske værdi af IHC panel bestående af PAI-2 og MMP-9 i en validering kohorte

for at validere den prognostiske effekt af IHC panel bestående PAI-2 og MMP-9 opdaget i vores afledning kohorte, vi yderligere gennemført overlevelse analyse og ROC kurve analyse i et validering kohorte med 91 NSCLC patienter. I Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, patienter med lav PAI-2 IHC ekspressionsniveauet havde en dårlig prognose, og patienter med høj MMP-9 IHC ekspressionsniveauet havde en dårlig prognose (fig 2C). Når man kombinerer PAI-2 og MMP-9 som et IHC panel, patienter med forhøjet PAI-2 og en lav MMP-9 IHC ekspressionsniveauer havde den bedste prognose, og patienter med lav PAI-2 og høje MMP-9 IHC ekspressionsniveauer havde værste resultat (

P

= 0,001). Forøgelse af arealet under kurven (AUC) for ROC blev også bemærket efter kombination PAI-2 og MMP-9 som et panel (fig 2C og S4 tabel). Som vist i varmen kortet (Fig 2C), patienter, der var døde ved endepunktet tendens til at have lav PAI-2 og høje MMP-9 IHC ekspressionsniveauer. Derfor PAI-2 og MMP-9 IHC panel vi identificeret fra markører for PA og MMP familier kunne bruges til at stratificere lungekræftpatienter af risiko og vælg patienter til mere aggressiv behandling.

Diskussion

til vores viden, er dette den første undersøgelse for at integrere PA og MMP familier ved hjælp IHC-analyse i lungekræft. Vi leverer en ny indsigt, som PAI-2 er den mest kraftfulde prognostiske indikator blandt markører i PA og MMP familier, og, endnu vigtigere, PAI-2 forblev sin ledende prognostisk rolle, selv efter at have taget sin tæt forhold til andre PA og MMP familien markører i betragtning . Forskning på begge PA og MMP familier viste, at de er en passende model for behandlingen af ​​prognostiske værdi af multi-markør vurdering (S5 Table) [26-29]. Med hensyn til det sammenkoblede signalvejen niveau, en nylig undersøgelse giver oplysninger om de respektive bidrag for hver PA familiemedlem i luftvejs epitelceller [31]. Membranbundne uPAR (muPAR) er blevet betragtet nøglen molekyle, fordi det er det eneste medlem af PA familien vist sig at accelerere cellemigration

in vitro

. Til sammenligning viste vores IHC-data ingen sammenhæng mellem uPAR IHC ekspressionsniveauet og patient prognose. Denne uoverensstemmelse kan skyldes flere faktorer. Først begrænsningen af ​​den tidligere undersøgelse var, at overekspression af hver markør ikke præcist kan efterligne den koordinerede signalering netværk

in vivo

[31]. Selvom vores data ikke kan være i stand til at demonstrere årsagssammenhæng mellem disse markører, de direkte afspejler den prognostiske rolle hver markør i kliniske patienter, hvor disse markører er co-udtrykt og interagere med hinanden. Desuden kan ekspressionen af ​​ECM nedbrydning-beslægtede enzymer, såsom PA og MMP familier, også reguleres ved tumorassocierede stromale celler [32]. Ved hjælp af et væv microarray (TMA), demonstrerede vi den prædiktive værdi af disse markører ved at betragte både tumorceller og deres mikromiljø. Detektion Pa Familie markører niveau fra væv ekstraktion med enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA) blev også en hyppigt anvendt metode til at analysere deres roller i lungecancer (S6 Table) [33-37]. Selvom ELISA mere præcist kunne kvantificere ekspressionsniveauerne af disse markører, tumorprøverne muligvis ikke fuldstændigt sammensat af tumorvæv grund ikke at kunne se morfologien af ​​vævet. I modsætning hertil kunne IHC-analyse anvendes i nærværende undersøgelse mere undgå denne begrænsning ved direkte observere udtrykket in situ. Dette kan forklare, at den prognostiske betydning Pa Familie markører ikke blev set i tidligere undersøgelse ved anvendelse af ELISA [33], men blev set i vores undersøgelse ved hjælp IHC-analyse. Derfor er vores resultater giver en supplerende illustration af roller PA og MMP familiemedlemmer i lungekræft.

Vores data viser, at PAI-2 spiller en ledende rolle i PAI-1, PAI-2, uPA, uPAR , MMP-2, og MMP-9. Imidlertid har kun få undersøgelser fokuseret på den patofysiologiske funktion af PAI-2 i cancer. PAI-2 overekspression blev rapporteret at reducere metastase i xenograftmodeller og sænke niveauet af uPA og migration

in vitro

[38,39]. Det er for nylig blevet påvist, at lav bindingsaffinitet af PAI-2 for endocytiske receptorer letter clearing af uPA uden at fremkalde nedstrøms signalering begivenheder, hvilket giver en mulig forklaring på den inhiberende rolle af PAI-2 i cancer progression [28,40]. Den fysiologiske funktion af PAI-2 kan yderligere tilvejebringe fingerpeg vedrørende dets rolle i udviklingen af ​​kræft. Som et protein udtrykt i stresstilstand, såsom inflammation og infektion [41], forhøjet PAI-2 plasmaniveauet blev fundet i patienter med sepsis eller leukæmi, og ekspressionsniveauet blev forøget ved aktiv eller tilbagefald sygdom og kunne ikke påvises i remission [42, 43]. I nærværende undersøgelse, vi analyserede også PAI-2 plasma niveau NSCLC lungekræftpatienter gennem ELISA (S5 Fig). Konstateringen viste forhøjede PAI-2 plasmaniveauet hos patienter med lungecancer i forhold til normal kontrol. Interessant, en nyere forskning vist, at PAI-2, som er i stand til at inhibere uPA-medierede tumorcellemigration og invasion secerneres af tumorceller selv om mikropartikler, ikke ved værtsceller [44]. Tilsammen kan en mekanisme foreslås, at den forhøjede PAI-2 plasmaniveauet i lungekræftpatienter afspejler PAI-2 positive mikropartikler i omløb udskilles af cancerceller. Og yderligere forskning er klart behov for at bestemme, om PAI-2 plasmaniveauet kunne anvendes som et surrogat for sygdomsstatus i lungecancerpatienter.

Selvom forbliver den funktionelle rolle af PAI-2 kan forstås fuldt ud, ved at tage fordel af sin hæmmende funktion, PAI-2 er blevet undersøgt som en vektor målrettet uPA i målrettet alpha radioimmunterapi til forskellige cancertyper [45]. I vores undersøgelse, viste evalueringen af ​​ekspressionsniveauet af PA og MMP familiemedlemmer ved IHC analyser tilvejebragt en potentiel metode til at vælge patienter med højt uPA ekspressionsniveau og lav PAI-2-ekspression niveau, der kan opnå større fordele af PAI-2- målrettet terapi. Desuden har svigt af bredspektrede MMP-inhibitorer i kliniske forsøg til behandling af kræft ført til udviklingen af ​​selektive MMP-inhibitorer [46], og inhibitorer, der er målrettet MMP-9 er blevet indikeret som potentielle behandlinger for cancer [47]. Følgelig den kliniske anvendelighed af PAI-2 og MMP-9 som prognostiske markører identificeret i vores undersøgelse tyder endvidere deres potentiale til terapeutisk anvendelse i NSCLC.

Afslutningsvis overvejer markører fra PA og MMP protease familier, der er kritisk i regulering af tumorudvikling, vores undersøgelse afslører størst prognostisk betydning af PAI-2 blandt uPA, uPAR, PAI-1 og PAI-2 i PA familie og MMP-2 og MMP-9 i MMP familien. Ved at prioritere den prognostiske effekt af hver markør, genereret vi en IHC panel bestående af PAI-2 og MMP-9, som giver større prognostiske værdi end den patologiske stadium eller en enkelt markør alene. Integration af de prognostiske værdier for markørerne fra protease familier fastlagt i nærværende undersøgelse vil tillade deres anvendelse i kliniske omgivelser til at forudsige patientens resultat og bestemme behandling retning i lungekræft.

Støtte Information

S1 Materialer og Metoder. ELISA’er.

Plasmaniveauer af PAI-2 og MMP-9 blev påvist ved kommerciel PAI-2 (LS-F5568, Levetid Biosciences, USA) og MMP-9 (ab100610, Abcam, Cambridge, UK) ELISA-kit. Plasma prøver af 36 NSCLC patienter og 6 normale kontroller blev opnået fra Kaohsiung Medical University Hospital of Taiwan

doi:. 10,1371 /journal.pone.0133411.s001

(DOCX)

S1 Fig. PA familie og MMP familien interagere med hinanden og danner et komplekst netværk, der regulerer ECM-nedbrydning.

(A og B) Både PAI-1 og PAI-2 inhiberer den proteolytiske evne uPA og til gengæld hæmme dannelsen af ​​plasmin , som kan nedbryde ECM’en alene eller via aktivering af MMP-2 og MMP-9. Desuden kan MMP-9 kan forbedre uPA-aktivitet ved nedbrydning proteasenexin-1. (A) uPA-PAI-1-kompleks kan yderligere øge ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9 til nedstrøms signalering. (B), uPA-PAI-2-komplekset letter Men clearance af uPA uden at øge MMP-2 og MMP-9 udtryk gennem nedstrøms signalering

doi:. 10,1371 /journal.pone.0133411.s002

(TIF )

S2 fig.