PLoS ONE: Carbon-Ion Beam Bestråling Kills X-Ray-Resistente p53-Null kræftceller ved at inducere Mitotisk Catastrophe

Abstrakt

Baggrund og formål

For at forstå de mekanismer, der er involveret i den stærke dræbende effekt af carbon-ion stråle bestråling på kræftceller med

TP53

tumorsuppressorgen mangler .

Materialer og metoder

DNA skader reaktioner efter kulstof-ion stråle eller X-ray bestråling i isogene HCT116 kolorektal cancer cellelinjer med og uden

TP53 Hotel (p53

+ /+ og p53

– /-, henholdsvis) blev analyseret som følger: celleoverlevelse ved klongenicitetsassayet, celledød tilstande af morfologiske observation af DAPI-farvede kerner, DNA dobbelt-strenget pauser (DSB’er) ved immunfarvning af phosphoryleret H2AX (γH2AX), og cellecyklus ved flowcytometri og immunfarvning af Ser10-phosphoryleret histon H3

Resultater

p53

-. /- celler var mere resistente end p53

+ /+ celler til røntgenbestråling, mens følsomheden af ​​p53

+ /+ og p53

– /- celler til carbon-ionstråle bestråling var sammenlignelige. X-ray og carbon-ion beam bestrålinger overvejende induceret apoptose af p53

+ /+ -celler, men ikke p53

– /- celler. I p53

– /-. Celler, carbon-ion-stråle bestråling, men ikke røntgen bestråling, markant induceret mitotisk katastrofe, der var forbundet med for tidlig mitotisk post med husly længe tilbageholdte DSBs ved 24 timer efter bestråling

konklusioner Salg

Effektiv induktion af mitotisk katastrofe i apoptose-resistente p53-deficiente celler indebærer en stærk cancer celledræbende virkning af carbon-ionstråle bestråling, der er uafhængig af p53-status, hvilket antyder dets biologiske fordel løbet røntgen behandling

Henvisning:. Amornwichet N, Oike T, Shibata A, Ogiwara H, Tsuchiya N, Yamauchi M, et al. (2014) Carbon-Ion Beam Bestråling Kills X-Ray-Resistant p53-Null kræftceller ved at inducere Mitotisk Catastrophe. PLoS ONE 9 (12): e115121. doi: 10,1371 /journal.pone.0115121

Redaktør: Peiwen Fei, University of Hawaii Cancer Center, USA

Modtaget: Juli 17, 2014 Accepteret: November 18, 2014; Udgivet: 22 December, 2014

Copyright: © 2014 Amornwichet et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud-in-Aid fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan i programmer for førende Graduate Schools, Dyrke Global Leaders i Heavy Ion Therapeutics og Engineering, og strategiske Young Researcher oversøiske Besøg Program til Hurtigere Brain cirkulation, og videnskabelig forskning om innovative områder (22131006). Dette arbejde blev også støttet af Grants-in-Aid fra Japan Society for fremme af videnskab for Unge Forskere (B) KAKENHI [10.643.471]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Carbon-ion strålebehandling har været provokerende interesse inden for kræftbehandling. Carbon-ionstråler har fordelagtige egenskaber i forhold røntgen; en overlegen dosis fordeling forbundet med den skarpe penumbraen og Bragg top, og stærk celledræbende virkning [1], [2]. Den største lovende kliniske resultat af carbon-ion strålebehandling er at overvinde den terapeutiske modstand af cancerceller til X-ray strålebehandling. For eksempel, en nylig undersøgelse, hvor kulstof-ion strålebehandling blev brugt til at behandle patienter med endetarmskræft rapporterede en 5-årig lokal kontrol og samlet overlevelse satser på 97% og 51% for postoperative tilbagevendende tilfælde [3]. Denne sats er overlegen i forhold til de 5-årige samlet overlevelse satser (0-40%), der typisk opnås ved konventionel røntgen strålebehandling eller kirurgisk resektion [3], [4]. Imidlertid har det biologiske grundlag for den stærke celledræbende virkning af carbon-ionstråle bestråling på røntgen-resistente tumorer ikke blevet belyst fuldstændigt.

Genetiske aberrationer bidrager til X-ray resistens af cancerceller [ ,,,0],5], [6]. Inaktiverende mutationer i tumorsuppressorgen

TP53

er repræsentative for tumor modstand, og disse aberrationer er forbundet med dårlig prognose efter røntgen strålebehandling [7], [8]. P53-proteinet spiller flere roller i DNA-skade respons (DDR) til X-ray bestråling, herunder reguleringen af ​​celledød veje og cellecykluskontrolpunkter [9]. Induktionen af ​​apoptose ved p53 er en nøglefaktor påvirker følsomheden af ​​cancerceller til røntgenstråling. Adskillige prækliniske og kliniske undersøgelser har vist, at

TP53

mutationer er associeret med modstand af kræftceller til X-ray bestråling terapi [7], [10], [11].

tidligere undersøgelser har vist, at carbon-ionstråle bestråling effektivt dræber X-ray-resistente p53-mutant cancerceller [12–15]. Selvom de er involveret i denne proces mekanismer blev undersøgt i disse undersøgelser, var resultaterne inkonsekvent. De uoverensstemmelser sandsynligvis skyldes, at hver undersøgelse fokuserede på kun nogle få aspekter af DDR (såsom apoptose eller cellecyklus respons) [12] – [15] og hver brugt cancercellelinier med forskellige genetiske baggrunde; dermed virkningen af ​​afvigelser i andre end

TP53 gener

kan have maskeret resultaterne [12], [13]. Her at afklare mekanismerne bag den stærke dræbende effekt af carbon-ion stråle bestråling på X-ray bestråling-resistente kræftceller med

TP53

afvigelser, udført vi en omfattende undersøgelse af flere aspekter af DDR ved hjælp af et sæt af isogene humane kræftceller, der afveg kun i deres p53 status.

Materialer og metoder

Cellelinjer

humane kolorektal cancer HCT116 celler, der huser vildtype p53 (p53

+ /+) og dens isogene p53-nul-derivat (p53

– /-) blev tilvejebragt af Dr. B. Vogelstein fra Johns Hopkins University. HCT116 p53

+ /+ celler har intakte DNA skade checkpoints [16]. p53 udtryk, og virkningerne af X-ray og carbon-ion stråle bestråling på p53 udtryk i p53

+ /+ og p53

– /- celler, blev undersøgt ved immunoblotting med antistoffer mod p53 (Santa Cruz) og β-actin (lastning kontrol, Cell Signaling Technology) (S1a fig.). Der var ingen signifikant forskel i populationen fordoblingstid mellem de to cellelinier (S1b Fig.).

human coloncancer (RKO, LS123, og WiDr) celler, humane lungecancer (H1299) celler, og human osteosarcom (Saos-2) -celler blev indkøbt fra ATCC. RKO-celler harbor vildtype p53. LS123 og WiDr celler huser en missense mutation i p53 i R175H og R273H hhv. H1299 og Saos-2-celler er p53-nul. H1299 celler stabilt udtrykker en p53 missense mutation (R175H, R273H, R249S eller R280K) blev etableret som tidligere [17] beskrevet. Alle celler blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum.

hTERT-immortaliserede normale humane diploide forhudsfibroblaster (BJ-hTERT) huser vildtype p53 blev erhvervet fra Clontech. BJ-hTERT celler, der udtrykker shRNA mod EGFP (BJ-hTERT-WT, kontrol). Eller p53 (BJ-hTERT-shp53) blev etableret som beskrevet tidligere [18], og dyrket i Minimum Essential Eagle Medium

Bestråling

røntgenbestråling blev udført under anvendelse af en Faxitron RX-650 strålingskilde (100 kVp, 1,14 Gy /min; Faxitron Bioptics). Carbon-ionstråle bestråling blev udført ved Gunma University Heavy Ion Medical Center ved hjælp af de samme stråle specifikationer, der bruges i kliniske omgivelser (290 MeV /nucleon og en gennemsnitlig lineær energioverførsel (LET) i midten af ​​en 6 cm spread out Bragg toppunkt på ca. 50 keV /gm). Carbon-ionstråler blev leveret i en vertikal retning, således at cellerne på dyrkningsplader kan modtage dosis jævnt.

Klonogen overlevelse assay

Celler blev podet i plader med 6 brønde og eksponeret (eller ikke ) til røntgenundersøgelse eller carbon-ionstråle bestråling. Efter inkubation i yderligere 10 dage, blev cellerne fikseret med methanol og farvet med krystalviolet. Kolonier på 50 celler blev talt. Den overlevende fraktion blev normaliseret til de tilsvarende kontroller. Den dosis, der resulterede i en overlevende fraktion på 10% (D

10) blev beregnet ved anvendelse af lineær-kvadratisk model, som tidligere beskrevet [19]. Salg

celledød evalueringer Salg

Celler blev dyrket på dækglas, eksponerede (eller ikke) til røntgenundersøgelse eller carbon-ionstråle bestråling, og derefter farvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid (DAPI), som tidligere [20] beskrevne. Konfokale billeder blev indsamlet ved anvendelse af et BX51 mikroskop (Olympus) udstyret med en CCD-kamera (VB-7000; Keyence). Apoptose blev bestemt på grundlag af morfologi af kerner, herunder tilstedeværelsen af ​​apoptotiske legemer, cellekernekondensation og fragmentering [21]. Celler indeholdende kerner med to eller flere særskilte flige blev scoret som positive for mitotisk katastrofe [20], [22]. Celler indeholdende kerner viser senescens-associerede heterochromatic foci blev scoret som positive for senescens [23]. Procentdelen af ​​celler undergår apoptose, mitotisk katastrofe eller ældning blev kvantificeret ved at tælle mindst 300 celler for hver eksperimentel betingelse.

Cell cyklus analyse

Celler eksponeret (eller ikke) til røntgen eller carbon-ionstråle bestråling blev høstet ved de angivne tidspunkter, fikseret med ethanol, farvet med propidiumiodid i nærvær af RNase, og derefter analyseret ved anvendelse af flowcytometri, som tidligere beskrevet [19].

Immunfarvning

Celler eksponeret (eller ikke) til røntgenundersøgelse eller carbon-ionstråle bestråling blev farvet med antistoffer mod Ser139-phosphoryleret histon H2AX (γH2AX; Millipore) eller Ser10-phosphoryleret histon H3 (pH 3, Millipore), som tidligere beskrevet [24]. γH2AX foci per kerne blev scoret i sekventielle 2D billeder taget fra flere fokale planer. Mindst 500 celler blev bedømt for hver forsøgsgruppe tilstand.

Statistisk analyse

Eksperimenter blev udført tre gange i mindst medmindre andet er angivet. Statistisk signifikante forskelle blev bestemt ved uparret Students

t

-tests hjælp StatMateIII ver. 3.17 software (ATM).

P

. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Carbon-ionstråler har mere potent kræft celledræbende aktivitet end røntgenstråler uanset p53 status

De følsomhed p53

+ /+ og p53

– /- HCT116 celler til røntgen og carbon-ion stråle bestråling blev vurderet ved klonogene overlevelse analyser (fig. 1). Som forventet baseret på resultaterne af tidligere undersøgelser [14], [15], p53

– /- celler var mere resistente over for X-ray bestråling end p53

+ /+ celler; D

10 værdier for disse to cellelinjer var 6,8 Gy og 3,8 Gy hhv. Derimod er følsomheden af ​​p53

+ /+ og p53

– /- celler til kulstof-ion stråle bestråling var sammenlignelige; D

10 værdier for disse cellelinier var 1,7 Gy og 1,9 Gy hhv. Derfor er den relative biologiske effektivitet af carbon-ionstråle bestråling til røntgenbestråling ved D

10 var 2,2 i p53

+ /+ -celler og 3,6 i p53

– /- celler. Disse data indikerer, at carbon-ionstråle bestråling effektivt dræber X-ray-resistente

p53

-null cancerceller.

Celler blev podet i plader med 6 brønde, inkuberet natten over, og derefter udsat for X-ray eller carbon-ionstråle bestråling. Efter inkubation i yderligere 10 dage blev cellerne fikseret, farvet og talt. Den overlevende fraktion blev normaliseret til værdien af ​​de tilsvarende kontroller. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. C-ion, carbon-ion.

afvigelser i p53 skifte tilstand af bestråling-induceret kræft celledød fra apoptose til mitotisk katastrofe

For at undersøge mekanismerne bag p53 status- uafhængig celledræbende aktivitet af carbon-ionstråle bestråling blev former for celledød induceret af røntgen- eller carbon-ionstråle bestråling vurderet (fig. 2, 3). p53

+ /+ og p53

– /- celler blev bestrålet med doser af X-ray eller carbon-ionstråler, der var magen til D

10 for p53

+ /+ celler (X -ray, 4 Gy, carbon-ion bjælker, 1,5 Gy). Apoptose, mitotisk katastrofe og senescens blev bestemt ved at undersøge de karakteristiske morfologier af kerner farvet med DAPI (fig 2a-c.) [20] – [23]. I p53

+ /+ -celler, apoptose var den dominerende form for celledød induceret af røntgen- og carbon-ionstråle bestråling (fig. 2d, f, 3a). Derimod p53

– /- celler var mindre modtagelige for apoptose forårsaget af begge typer af bestråling (fig 2e, g, 3b.). Interessant nok i p53

– /- (. Figurerne 2 g, 3b) celler, carbon-ionstråle bestråling induceret mitotisk katastrofe mere åbenbart end røntgenbestråling. En højere dosis af røntgenbestråling svarende til D

10 (6,8 Gy) for p53

– /- celler induceret et tilsvarende mitotisk katastrofe som ville frembringes af carbon-ionstråle bestråling ved 1,5 Gy (S2 fig.). Induktionen af ​​senescens var ikke tydelig i alle forsøgsbetingelser (fig. 2). Dette resultat blev bekræftet af senescens-associerede β-galactosidasefarvning assays, hvori den del af farvende-positive celler var mindre end 2% for begge cellelinier udsættes for røntgenundersøgelse eller carbon-ionstråle bestråling (data ikke vist). Disse data indikerede, at apoptose og mitotisk katastrofe er den vigtigste form for celledød i p53

+ /+ -celler og p53

– /- celler, begge efter udsættelse for røntgen og carbon-ionstråle bestråling, og at carbon-ionstråle bestråling inducerer mitotisk katastrofe mere effektivt end røntgenbestråling i apoptose-resistente p53

– /- celler

celler podet på dækglas blev inkuberet natten over, udsat for (eller ikke.; 0 h) til X-ray (4 Gy) eller carbon-ionstråle (1,5 Gy) bestråling, og derefter farvet med DAPI. Apoptose, mitotisk katastrofe, og ældning blev bestemt i overensstemmelse med de karakteristiske nukleare morfologier (se “Materialer og metoder” for definitioner). (A-c) Repræsentative billeder viser cellekernemorfologi af celler undergår apoptose (a), mitotisk katastrofe (b), eller aldring (c). Billederne af p53

– /- celler blev taget 72 timer efter carbon-ionstråle bestråling. (D, e) valg af celledød i p53

+ /+ (d) og p53

– /- (e) celler ved 0, 12, 24, 48, 72, 96 og 120 timer efter X- ray bestråling. (F, g) tilstand af celledød i p53

+ /+ (f) og p53

– /- (g) celler ved 0, 12, 24, 48, 72, 96 og 120 timer efter carbon- ionstråle bestråling. IR, bestråling; C-ion, carbon-ion.

Celler blev podet på dækglas, inkuberet natten over, der udsættes for kulstof-ionstråler (1,5 Gy), og derefter farvet med DAPI 72 timer senere. Apoptose, mitotisk katastrofe, og ældning blev bestemt i overensstemmelse med de karakteristiske nukleare morfologier (se “Materialer og metoder” for definitioner). (A) p53

+ /+ celler: 12,5%, 0% og 0% af cellerne viste apoptose, mitotisk katastrofe, og senescens hhv. (B) p53

– /- celler: 0%, 12,8% og 0% af celler viste apoptose, mitotisk katastrofe, og ældning, hhv. Pilene i (a) og (b) angiver celler undergår apoptose og mitotisk katastrofe hhv. Scale barer, 10 um.

For at undersøge dette yderligere, undersøgte vi tilstanden af ​​celledød i flere humane cellelinjer med forskellige p53 status efter X-ray eller carbon-ion stråle bestråling (fig. 4 ). RKO celler indeholdende vildtype p53 viste en apoptose-dominant fænotype efter enten røntgen eller carbon-ionstråle bestråling, mens p53-null H1299 og Saos-2-celler viste en mitotisk katastrofe-dominant fænotype. Følgelig undertrykkelse af p53-ekspression i BJ-hTERT fibroblaster fremmet induktionen af ​​mitotisk katastrofe ved røntgen eller carbon-ionstråle bestråling (S3 Fig.). Interessant LS123 og WiDr-celler (der udtrykker p53 huser en missense på R175H og R273H, henholdsvis), viste også en mitotisk katastrofe-dominant fænotype (Fig. 4). Disse mutationssteder er beliggende inden for DNA-bindende domæne af p53-proteinet, der spiller en central rolle i den transskriptionelle aktivering af adskillige målgener, herunder dem der er involveret i apoptose induktion [25]. Derfor vi næste undersøgt tilstanden af ​​bestråling celledød under anvendelse af en serie af isogene H1299 celler stabilt udtrykker p53-proteiner indeholdende missense mutationer i DNA-bindingsdomænet, der ofte observeres i humane cancere (dvs. R175H, R273H, R249S og R280K ) [25]. Alle disse cellelinjer viste en mitotisk katastrofe-dominant fænotype ved bestråling (fig. 5). Taget sammen indikerer disse resultater, at dysfunktion af p53 DNA-bindende domæne skifter tilstanden af ​​bestråling-induceret celledød fra apoptose til mitotisk katastrofe. Disse resultater bekræftede også, at kulstof-ion beam bestråling var bedre end X-ray bestråling ved at fremkalde mitotisk katastrofe i kræftceller huser afvigende p53.

Celler blev podet på dækglas, inkuberet natten over, bestrålet med røntgenstråler ( D

10 dosis) eller carbon-ionstråler (D

10 dosis), og derefter farvet med DAPI 72 timer senere. Apoptose, mitotisk katastrofe, og ældning blev bestemt i overensstemmelse med de karakteristiske nukleare morfologier (se “Materialer og metoder” for definitioner). Data er udtrykt som middelværdi ± SD. Ap, apoptose; MC, mitotisk katastrofe; SNS, ældning; IR, bestråling; C-ion, carbon-ion

Celler blev podet på dækglas, inkuberet natten over, bestrålet med røntgenstråler (10,9 Gy, D

10 for røntgenstråler,. Eller 3,8 Gy, D

10 for kulstof-ion bjælker) eller carbon-ionstråler (3,8 Gy, D

10 for kulstof-ion bjælker), og derefter farvet med DAPI 72 timer senere. Apoptose, mitotisk katastrofe, og ældning blev bestemt i overensstemmelse med de karakteristiske nukleare morfologier (se “Materialer og metoder” for definitioner). Data er udtrykt som middelværdi ± SD. MC, mitotisk katastrofe; C-ion, kulstof-ion; IR, bestråling. Bemærk, at en del af p53-nul H1299 panel er det samme som vist i fig. 4 (men konteksten er nu anderledes).

Celler frigivet fra stråling-induceret G2 /M anholdelse 24 timer efter X-ray eller carbon-ion stråle bestråling

Mitotisk katastrofe menes at opstå, når cellerne fortsætte gennem afvigende mitose med urepareret DNA-beskadigelse [26]. Derfor, for at undersøge den mekanisme ligger til grund for induktionen af ​​mitotisk katastrofe i p53-nul-celler ved carbon-ionstråle bestråling, virkningerne af røntgen- og carbon-ionstråle bestråling på cellecyklussen status af p53

+ /+ og p53

– /- HCT116-celler blev bestemt ved flowcytometri (. figur 6a, b). Ligesom celledød analyser blev cellerne bestrålet med doser af X-ray (4 Gy) eller carbon-ionstråler (1,5 Gy). Induktion af G2 /M anholdelse, der toppede 12 timer efter bestråling blev observeret i begge cellelinier efter X-ray eller carbon-ion stråle bestråling, bliver mere tydeligt i p53

– /- celler end p53

+ /+ -celler. Især i begge cellelinier udsættes for røntgenundersøgelse eller carbon-ionstråle bestråling, G2 /M arrest blev helt frigivet 48 timer efter bestråling.

Celler blev podet i 35 mm dyrkningsplader (a, b) eller på dækglas (c), inkuberet natten, og udsatte (eller ikke; 0 h) til X-ray (4 Gy) eller carbon-ion beam (1,5 Gy) bestråling. (A, b) Celler blev bestrålet med røntgenstråler (A) eller carbon-ionstråler (b) blev inkuberet i 0, 12, 24, 48, 72, 96 eller 120 timer, fikseret med ethanol, farvet med propidiumiodid, og cellecyklus status analyseret ved flowcytometri. (C) Celler blev bestrålet med røntgenstråler eller carbon-ionstråler, inkuberet i 1 time, og derefter underkastet immunfarvning for pH 3, en specifik markør for M-fase-celler. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. *

P

0,05 og †

P

0,01 versus tilsvarende kontroller. IR, bestråling; C-ion, carbon-ion

Næste, de procentsatser af p53

+ /+ og p53

-. /- Celler i M-fasen før og efter X-ray (4 Gy) eller carbon-ionstråler (1,5 Gy) bestråling blev vurderet ved immunfarvning anvendelse af et antistof mod pH 3 (fig. 6c) [24]. Ca. 2% af ikke bestrålet p53

+ /+ og p53

– /- celler var i M-fasen. En time efter carbon-ionstråle bestråling blev de procentdele af disse celler i M-fasen reduceret betydeligt, men p53

– /- celler var mindre modtagelige end p53

+ /+ -celler til røntgenbestråling. Især 24 timer efter X-ray eller carbon-ion stråle bestråling, de procentdele af p53

+ /+ og p53

– /- celler i M-fasen inddrives til baseline, hvilket tyder på, at begge cellelinier genstartet mitose 24 timer efter behandlingen.

DNA dobbeltstrenget pauser genereret af carbon-ionstråle bestråling vise langsommere reparation kinetik end dem, der genereres af røntgenbestråling

Endelig reparation kinetik DNA double strengen pauser (DSBs), den mest dødbringende form for DNA-skader, der genereres af ioniserende bestråling, blev undersøgt i p53

+ /+ og p53

– /- HCT116 celler [27]. Bestrålede celler blev underkastet immunfarvning under anvendelse af et antistof mod γH2AX, og antallet af γH2AX foci per celle ved 15 min og 24 h efter bestråling blev talt (fig. 7, S1 Table) [24], [28]. Cellerne blev bestrålet med en 2 Gy dosis af røntgen- eller en 1 Gy dosis af carbon-ionstråler; ved disse doser, antallet af γH2AX foci per celle på kontrolenheden tidspunkt (15 minutter efter bestråling) var ca. 20-30, som var hensigtsmæssige til vurdering [24], [28]. Fireogtyve timer efter X-ray bestråling, antallet af γH2AX foci i p53

+ /+ og p53

– /- celler var 24 ± 4,3% og 23 ± 5,3% af de tilsvarende kontroller (ved 15 min tidspunkt), (fig. 7a, b), hvilket indikerer, at det store antal DSB’er genereret af røntgenbestråling blev repareret inden for 24 timer. Derimod 24 timer efter carbon-ionstråle bestråling, antallet af γH2AX foci i p53

+ /+ og p53

– /- celler blev 93 ± 11% og 85 ± 7,3% af de tilsvarende kontroller henholdsvis (fig. 7a, c), hvilket indikerer, at DSB’er genereret af carbon-ionstråle bestråling ikke blev repareret effektivt, sandsynligvis på grund af den strukturelle kompleksitet af DSB ender [29]. Faktisk p53

+ /+ og p53

– /- celler, der farvede dobbelt-positive for γH2AX og pH 3 blev identificeret 24 timer efter kulstof-ion stråle bestråling, hvilket viser, at celler indeholdende DSBs havde indgået mitose (fig. 7d). P53 status påvirkede ikke kinetikken for tabet af γH2AX foci efter X-ray eller carbon-ion stråle bestråling. Taget sammen antyder disse data at p53-nul-celler, der huser unrepaired DSBs indtaste mitose 24 timer efter carbon-ionstråle bestråling, hvilket fører til mitotisk katastrofe. Salg

Celler blev podet på dækglas, inkuberet natten over, udsat for X- stråler (2 Gy) eller carbon-ionstråler (1 Gy), rugede i yderligere 15 min eller 24 timer, og derefter udsat for immunfarvning for γH2AX og pH 3. Celler blev derefter farvet med DAPI. (A) antal γH2AX foci per celle ved 15 min eller 24 h efter bestråling. Resultaterne for hver cellelinje blev normaliseret til antallet af γH2AX foci på 15 min tidspunkt. Mindst 500 celler blev talt pr eksperimentel betingelse. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. *

P

0,05 versus de tilsvarende prøver på 15 min. (B, c) Repræsentative mikroskopiske billeder, der viser kerner eksponeret for røntgen (b) eller carbon-ionstråle (c) bestråling, og immunfarvet for γH2AX. I hvert panel, er omridset af detekteret ved DAPI-farvning kerne angivet med en stiplet linie. (D) Repræsentative mikroskopiske billeder af kerner eksponeret for carbon-ionstråle bestråling og immunofarvede for γH2AX og pH 3 ved 24 timer efter bestråling. Pilene viser dobbelt-positive kerner. C-ion, carbon-ion.

Diskussion

Her viser vi, at kulstof-ion stråle bestråling inducerer forskellige former for celledød efter mutationen status

TP53

. Efter både røntgen og carbon-ion stråle bestråling, apoptose var den dominerende form for celledød af p53

+ /+ celler, men ikke p53

– /- celler. Især antallet af mitotisk indrejse og kinetik DSB reparation efter bestråling, som kan være vigtige faktorer, der inducerer mitotisk katastrofe, var ens i p53

+ /+ og p53

– /- celler uanset typen af bestråling anvendes. Disse data indikerer, at apoptose spiller en primær rolle i cancer celledød forårsaget af bestråling i nærvær af p53. I fravær af p53, viste cancerceller resistens over for apoptose induktion og blev observeret mitotisk katastrofe efter både røntgen og carbon-ionstråle bestråling. Denne konklusion sandsynligvis forklares ved begrænsning af G2 /M checkpoint efter bestråling. Aktivering af dette kontrolpunkt tillader reparation af beskadiget DNA, inden det sendes videre til datterceller og virker som en barriere for at forhindre for tidlig indtræden i mitose [30]. Imidlertid har tidligere undersøgelser antydet begrænsning af G2 /M checkpoint efter IR; G2 /M checkpoint frigives, når antallet af DSBs bliver lavere end ~10-20 efterfulgt af mitotisk post [24], [31]. Efter G2 /M checkpoint udgivelse, celler indeholdende 10-20 DSBs er i stand til at fuldføre mitotiske begivenhed og indtast G1 fasen [32], [33]. DSB-reparation nedreguleres i M-fasen; derfor muligvis skader repareres i den næste celle cyklus, selvom reparationsprocessen i datterceller er endnu ikke klarlagt [34]. En anden mulig årsag til den effektive induktion af mitotisk katastrofe i p53

– /- celler er den højeste tilbøjelighed af disse celler til stall i G2 /M-fasen efter bestråling end p53

+ /+ celler. Denne G2 /M-fase akkumulering er resultatet af en defekt i p53-p21-signalvejen der dæmper G1 standsning efter bestråling [16]. Denne egenskab af p53-mangelfulde cancerceller kan øge chancen for bestrålede celler, der huser unrepaired DSBs ind mitose, der fører til forbedring af mitotisk katastrofe.

Resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at både en mangel på p53 og missense mutationer i p53 bidrager til omskifteren fra apoptose til mitotisk katastrofe. Samlet set 75% af p53 mutationer identificeret i humane kræftformer er enkelt missense mutationer. De fleste missense-mutationer, herunder dem undersøgt i den foreliggende undersøgelse, er beliggende inden for p53 DNA-bindende domæne, som spiller en central rolle i den transskriptionelle aktivering af mange målgener, herunder dem, der inducerer apoptose [25]. De fleste mutant p53 proteiner har en dominant negativ virkning, der fører til dysfunktion af de resterende normale p53-proteiner. Det er derfor rimeligt, at, sammen med manglen af ​​p53, missense mutationer i p53 DNA-bindende domæne også bidrager til apoptose-resistente fænotype ved at forstyrre evnen af ​​normale p53-proteiner til transkriptionelt at aktivere apoptose-relaterede gener; dette kan gøre bestrålede celler, der huser unrepaired DSBs mere modtagelige for mitotisk katastrofe. Ikke desto mindre er det værd at bemærke en undersøgelse begrænsning på dette punkt: vi ikke var i stand til at etablere H1299 celler, der udtrykker vildtype p53 (enten midlertidigt eller stabilt); Derfor er en sammenligning mellem vildtype p53 og mutant p53 var umuligt. Fremtidige undersøgelser bør sammenligne tilstanden af ​​bestråling-induceret celledød i isogene cellelinjer huser vildtype, mutant, og nul-p53.

Af note, de resultater, der præsenteres her, demonstrerer en effektiv induktion af mitotisk katastrofe ved kulstof ionstråle bestråling i p53-nul og p53-mutant celler. Faktisk i alle p53-nul og p53-mutant cellelinier testes, den dosis, der kræves for at inducere vist niveau af mitotisk katastrofe var åbenbart lavere i carbon-ionstråler end i røntgenstråler. Dette resultat kan forklares ved de vanskeligheder i forbindelse med reparation af DSB’er genereret af carbon-ionstråle bestråling, som bevarer mere komplekse strukturer af beskadiget DNA-ender end dem, der genereres af røntgenbestråling [35]. Ineffektiv DNA-skader reparation forårsaget af kompleksiteten af ​​DSB ender kan ligge til grund for en effektiv celle-drab effekt af kulstof-ion stråle bestråling på kræftceller huser p53 aberration.

De her beskrevne resultater er delvist selvmodsigende at de tidligere studier, der undersøgte den DDR efter kulstof-ion stråle bestråling af p53-mutant cancerceller. Selv om et par undersøgelser observerede effektiv apoptose (S2 Table) [12] – [15], det skal bemærkes, at denne form for celledød kun blev induceret effektivt på LET værdier større end 70 keV /um. Derimod var den gennemsnitlige LET værdi ved midten af ​​den klinisk anvendte spread out Bragg top, som anvendt her, er ca. 50 keV /um. Endvidere i modsætning til resultaterne beskrevet her, induktionen af ​​senescens og forlænget (længere end 3 dage) G2 /M arrest blev også observeret i tidligere undersøgelser under anvendelse af carbon-ionstråle bestråling med høj Lad værdier [12], [36] . Disse data antyder, at DDR varierer afhængigt af LET værdien af ​​carbon-ionstråle bestråling anvendes. Yderligere

in vitro

in vivo

undersøgelser af en række forskellige cellelinjer er forpligtet til at validere de terapeutiske virkninger af kulstof-ion stråle bestråling på LET anvendt i kliniske indstillinger.

sammenfattende denne omfattende analyse af DDR i bestrålede isogene cellelinier viser, at røntgenbestråling-resistente p53-nul cancerceller er modtagelige for carbon-ionstråle bestråling, som effektivt inducerer mitotisk katastrofe (fig. 8). Induktionen af ​​mitotisk katastrofe i apoptose-resistente tumorer kan være en vigtig biologisk fordel ved carbon-ion strålebehandling løbet røntgen strålebehandling. Yderligere undersøgelser med dyremodeller eller kliniske prøver er forpligtet til at belyse dette spørgsmål yderligere.

C-ion, carbon-ion.

Støtte Information

S1 Fig. Salg Egenskaber for p53

+ /+ og p53

– /- celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0115121.s001

(PDF)

S2 Fig. Salg The former for celledød fremkaldt af X-ray bestråling for D

10 i HCT116 p53

– /- celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0115121.s002

( PDF)

S3 fig. Salg The former for celledød fremkaldt af X-ray eller carbon-ion stråle bestråling i BJ hTERT-WT eller -shp53 celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0115121.s003

(PDF)

S1 tabel. .

Antallet af γH2AX foci per celle efter bestråling

doi: 10,1371 /journal.pone.0115121.s004

(PDF)

S2 Table.

LET-afhængighed af effekten af ​​apoptose induktion ved kulstof-ion stråle bestråling i p53-mutant kræftceller

doi:. 10,1371 /journal.pone.0115121.s005

(PDF)

tak

Vi takker Dr. Tetsushi Sadakata, Dr. kohta Torikai, og Dr. Mayumi Komachi (Gunma University) til teknisk bistand. Vi takker Dr. Volgelstein (Johns Hopkins University) for at give cellelinjer.