PLoS ONE: Mitokondrisk Telomerase Beskytter Cancer Celler fra Nuclear DNA-skader og Apoptosis

Abstrakte

De fleste cancerceller udtrykker høje niveauer af telomerase og formere sig i det uendelige. Ud over sin telomer vedligeholdelse funktion, telomerase har også en pro-overlevelsesfunktionen resulterer i en forøget modstand mod DNA skader og nedsat apoptose induktion. Men de molekylære mekanismer for denne beskyttende funktion forblive undvigende, og det er uklart, om det er forbundet til telomer vedligeholdelse eller er snarere en ikke-telomeriske funktion af telomerase protein, TERT. Det blev vist for nylig, at proteinet underenheden af ​​telomerase kan shuttle fra kernen til mitokondrierne ved oxidativt stress, hvor det beskytter mitokondriefunktion og formindsker intracellulær oxidativ stress. Her viser vi, at endogen telomerase (TERT-protein) shuttles fra kernen ind i mitokondrierne ved oxidativt stress i cancerceller og analyseret de nukleare udelukkelse mønstre af endogen telomerase efter behandling med hydrogenperoxid i forskellige cellelinier. Cellepopulationer udelukket TERT fra kernen ved oxidativt stress i en heterogen måde. Vi fandt en signifikant sammenhæng mellem nuklear lokalisering af telomerase og høj DNA-skader, mens celler, som udelukkede telomerase fra kernen viste ingen eller meget lav DNA-skade. Vi modelleret nukleare og mitokondrie telomerase hjælp organel specifikke localization vektorer og bekræftede, at mitokondriel lokalisering af telomerase beskytter kernen fra påførte DNA-skader og apoptose medens i modsætning hertil kernelokalisering af telomerase korreleret med højere mængder af DNA-skader og apoptose. Det er kendt, at DNA-beskadigelse nukleare kan være forårsaget af mitokondrier genererede reaktive oxygenarter (ROS). Vi demonstrerer her at mitokondriel lokalisering af telomerase afskærer DNA-beskadigelse nuklear ved faldende niveauer af mitokondrie ROS. Vi foreslår, at dette fald i oxidativ stress kan være en mulig årsag til høj stress modstand af kræftceller og kan være særligt vigtigt for cancer stamceller

Henvisning:. Singhapol C, Pal D, Czapiewski R, Porika M, Nelson G, Saretzki GC (2013) mitokondrier Telomerase Beskytter Cancer Celler fra Nuclear DNA-skader og apoptose. PLoS ONE 8 (1): e52989. doi: 10,1371 /journal.pone.0052989

Redaktør: Janine Santos, University of Medicine og Dentistry of New Jersey, USA

Modtaget: 14. august 2012; Accepteret: November 27, 2012; Udgivet: 9 januar 2013

Copyright: © 2013 Singhapol et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Chatchawan Singhapol blev finansieret af et stipendium fra thailandske regering. Glyn Nelson blev støttet af BBSRC tilskud nr. BB /C008200 /1 (CISBAN). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Gabriele Saretzki er en PLoS ONE redaktør og Editorial bestyrelsesmedlem. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Telomerase er et enzym bedst kendt for sin rolle i telomer vedligeholdelse. Celler med lav eller ingen telomerase udtryk mister telomer gentagelser under celledeling, i sidste ende resulterer i cellulær ældning. De fleste cancerceller, kimceller og embryonale stamceller udtrykker høje niveauer af telomerase og dermed bidrage til pluripotens og udødelighed. For at opretholde telomerer enzymet brug for sin katalytiske subunit (TERT) samt RNA-komponenten (tert eller TR), som indeholder den skabelon for telomer syntese.

I de senere år er der dog, beviser har akkumuleret, at telomerase , og navnlig dens katalytiske subunit TERT, er involveret i forskellige ikke-telomer-relaterede funktioner såsom regulering af genekspression, vækstfaktorer og celledeling [1] – [6]. Desuden har forskellige grupper vist, at TERT pendulkørsler fra kernen og translokerer for mitokondrier ved exogen stress [7] – [12]. Vi og andre har vist en beskyttende rolle af telomerase i mitochondrier [10] – [12], mens manglende evne telomerase shuttling fører til cellulær stress, forhindrer immortalisering og øger følsomheden mod genotoksisk stress, som det er vist for nylig af Santos ‘gruppe [13] – [ ,,,0],15].

De fleste cancerceller udtrykker høje niveauer af telomerase, en vigtig forudsætning for ubestemt spredning og udødelighed. Desuden telomerase bidrager til tumorigenese via ikke-telomer afhængige mekanismer, som ikke er godt forstået endnu [16].

Telomerase er således blevet foreslået at være en vigtig anti-cancer target, med de første kliniske undersøgelser af det telomeraseinhibitor imetelstat held i gang [17], [18]. Telomerase er reguleret på flere niveauer og subcellulære lokalisering er en af ​​dem. Cancer celleoverlevelse efter terapeutiske behandlinger kan være heterogen med nogle celler reagerer på behandling, mens andre synes at være resistente, bidrager til tumorcelleoverlevelse. En bedre indsigt i de biologiske konsekvenser af forskellige subcellulære lokaliseringer af TERT kan føre til udviklingen af ​​mere effektive anti-cancer behandlinger.

Her er vi præget udelukkelsen af ​​telomerase fra kernen efter stress ansøgning og fundet en heterogen stress respons i cancer cellepopulationer. Vigtigere er det, der var en slående sammenhæng mellem telomerase /TERT tilbageholdt i kernen og høj DNA-skader. I modsætning hertil celler som udelukkede telomerase hurtigt fra den akkumulerede ingen eller meget lave mængder af DNA-skader kerne. Ved at modellere de forskellige subcellulære lokaliseringer af telomerase hjælp organel målrettet “shooter” vektorer viser vi her, at mitokondrie telomerase forhindrer nuklear DNA-skader samt induktion af apoptose efter behandling med H

2O

2 og bestråling. Vi foreslår, at reduceret produktion af mitochondriale reaktive oxygenarter (ROS) kunne være den underliggende mekanisme til at forklare, hvordan mitokondrie TERT forhindrer DNA-skade nukleare.

Således udelukkelse af telomerase fra kernen efter stress, såsom anti-cancer terapeutisk behandling kunne være en beskyttende mekanisme, der reducerer nuklear DNA-beskadigelse og apoptose ved at reducere oxidativ stress i mitokondrier. Dette kan bidrage til forøget modstand af disse cancerceller mod forskellige anti-cancer-behandlinger.

Resultater og Diskussion

Subcellulær shuttling af TERT-protein fra kernen til mitochondrier tidligere var blevet vist i forskellige celletyper , herunder kræftceller [7], [10] – [12]. Vi bekræftede denne shuttling af endogen telomerase efter H

2O

2 behandling i HeLa og MCF7-celler (fig. 1A) fra kernen til mitochondrier og kvantificeres udelukkelsen sammenlignet med MRC-5 /hTERT-celler (tabel 1). For at vurdere shuttling kinetik TERT mere detaljeret analyseret vi 3 cellelinjer, herunder 2 cancercellelinier samt hTERT over-udtrykkende MRC-5-fibroblaster, og fulgte dem over 5 dage.

Eksempel afsmeltet fremskrivninger 3D volumen af ​​udfoldede konfokal billeder fra HeLa og MCF7-celler ubehandlet (kontrol, venstre panel) eller behandlet med 400 pM H

2O

2 til 3 timer (højre panel). Green betegner mitotracker grøn fluorescens, rød anti-TERT-immuno-fluorescens og blå kerne-DNA (DAPI). Markant colokalisering mellem mitotracker grøn og TERT vises ved at rød-grøn blanding, der vises som gul. B-D: TERT lokalisering kinetik i 3 cellelinje befolkninger efter behandling med 400 pM H

2O

2 over 5 dage. B: HeLa C: MCF7 D: MRC-5 /hTERT. Sorte bjælker: nuklear TERT, røde bjælker: cytoplasmatisk TERT. Barer er midler ± SE fra mindst 30 celler pr tidspunkt og cellelinje fra 3 uafhængige forsøg.

I alle tre cellelinjer nukleare udelukkelse TERT startede omkring 45 min efter debut af H

2O

2 behandling. I hTERT overudtrykker fibroblaster udelukkelsen nåede sit maksimum på 60% efter 3 timer, mens det tog begge cancercellelinjer op til en dag for at nå en udelukkelse niveau på 50-60% (fig. 1B-D). Dette svarer godt til den TERT mitokondrie co-lokalisering-data fra vores konfokale billeder fra 3 cellelinjer (tabel 1). Interessant niveauet 50-60% nukleare udelukkelse fastholdt alle 3 cellelinier op til 5 dage, den længste tidspunkter vi analyserede (fig. 1B-D og S1). Således nuklear udelukkelse TERT er en temmelig vedholdende proces, der kan vare op til flere dage efter en enkelt bolusdosis på 400 uM H

2O

2. Så vidt vi ved, er dette den første gang, at TERT udelukkelse kinetik er blevet undersøgt i detaljer og sammenlignet i tre forskellige cellelinier end en 5 dages tidsramme. Den lange vedvarende TERT protein uden for kernen i kræftceller kan være en vigtig bidragyder til øget modstand og nedsat apoptose i kræftceller efter lægemiddelbehandling eller bestråling sammenlignet med celler ikke-kræft, som i de fleste tilfælde udtrykker ingen eller rettere lave niveauer af telomerase. Vi har tidligere vist, at telomerase negative fibroblaster er meget mere modtagelige for apoptose efter behandling med H

2O

2 og etoposid end deres telomerase overudtrykker modstykker [10]. Vi havde også vist tidligere [10], at TERT udelukkelse fra kernen er reversibel over en tidsramme på omkring 10 dage. Men vi ved ikke, om den vedvarende TERT protein i mitokondrier altid kommer fra kernen, eller om nyligt syntetiserede TERT protein direkte importeret til mitokondrier. Dette spørgsmål kræver yderligere undersøgelser.

Næste vi korreleret telomerase udelukkelse for hver enkelt celle med sin DNA-skader niveau på 3 timer efter H

2O

2 behandling. Vi kvantificeret TERT udelukkelse for hver enkelt celle som enten nukleare, hvis mere end 75% af den samlede TERT var i kernen, eller cytoplasmatisk /mitokondrie, hvis mere end 75% af TERT var udenfor kernen med de resterende celler bliver klassificeret som en mellemliggende fænotype.

Vi fandt en klar heterogenitet for nuklear udelukkelse TERT mellem celler i en population (fig. 2A og S2A). Interessant nok fandt vi, at celler, der var udelukket telomerase 3 timer efter behandlingen viste ingen eller meget lav DNA-skader mens de med nuklear telomerase havde en signifikant højere mængde DNA skader nuklear i alle 3 cellelinier (fig. 2). Også, celler med en mellemliggende udelukkelse mønster viste en mellemliggende skader niveau, stadig betydeligt højere end celler med helt udelukket telomerase men ikke signifikant forskellig fra dem med overvejende nukleare telomerase. Disse data tyder på, at et højt niveau for nuklear udstødelse ( 75%) og mitokondrie lokalisering af TERT er nødvendig for at udøve sin beskyttende funktion [10] – [15]. Absolutte DNA beskadigelse niveauer var forskellige mellem de 3 cellelinier med de to cancercellelinier udviser meget større skade niveauer end TERT over-udtrykkende fibroblaster. Vi målte også den absolutte TERT signalintensiteter for de 3 forskellige lokaliseringer og fandt, at mitokondriel TERT signal var altid lavere end i kernen eller i det mellemliggende tilstand (fig. S2B). Det havde vist tidligere, at TERT protein niveau ned reguleres inden mitokondrier efter H

2O

2 behandling, som kunne forklare denne observation [19].

mens mitokondrie telomerase forhindrer det. A-C: Repræsentative billeder af TERT lokalisering (grøn), og γH2A.X farvning (rød). Blå: DAPI nukleare kontrastfarve A: HeLa B: MCF7 C: MRC-5 /hTERT celler. Cellerne blev behandlet i 3 timer med 400 uM H

2O

2. TERT lokalisering blev bestemt som beskrevet for figur 1B og inddelt i 3 kategorier: nuklear TERT (N) TERT (C) og formidler TERT (I) lokalisering. Eksempler på de 3 forskellige lokaliseringer er angivet med pile. D: Sammenhæng mellem subcellulær TERT lokalisering og nukleare DNA-skade niveauer (antal γH2A.X foci). Cytoplasmatisk TERT lokalisering korrelerer med lav nuklear DNA-skader i alle 3 cellelinjer mens nuklear TERT lokalisering resultater i høj nuklear skade efter 3 timer af behandlingen med 400 uM H

2O

2. Mellemmand TERT lokalisering resulterer i mellemliggende DNA skader niveauer. Sorte bjælker: HeLa, røde bjælker: MCF7, grønne stænger: MRC-5 /hTERT. Søjler er gennemsnit ± SE fra mindst 40-100 celler pr cellelinje i gentagne forsøg. * P. 0,05

En korrelation mellem højere DNA-skader i cancerceller og nuclearly begrænset telomerase ude af stand til shuttle grund af en mutation i dets nukleare eksport signal blev beskrevet for nylig af Kovalenko og kolleger [13]. Det muterede TERT inducerede en forøgelse af spontan telomer såvel som ikke-telomert nuklear DNA-skader i 2 cancercellelinjer sammenlignet med de samme celler uden mutanten TERT [13]. Desuden cancerceller med en mutant TERT der var begrænset til kernen og ude af stand til shuttle mistet deres proliferation evne, var ikke i stand til at danne kolonier i blød agar og viste en forøget mængde af mitokondrie-DNA beskadigelse [13]. Sammen disse resultater tyder på, at sub-cellulære shuttling af TERT kan have stor betydning for følsomheden af ​​celler mod DNA skader. Denne øgede modstand på grund af høj telomerase udtryk og nuklear udelukkelse af TERT kan begunstige overlevelse cancer stamceller, som kan resultere i tilbagefald efter behandlingen [17]. Der er også tidligere publicerede data for en beskyttende rolle af nuklear TERT mod staurosporin induceret apoptose [9]. Men staurosporin er et protein kinase inhibitor, der aktiverer apoptose i en hurtig måde uden at inducere DNA-skade og uafhængig af mitokondrier. Vi foreslår derfor en anden virkningsmekanisme i begge forsøg.

Vi næste modelleret de forskellige TERT lokaliseringer separat ved overekspression nukleare og mitokondrie organel specifikke vektorer, der udtrykker den katalytiske telomerase-underenhed TERT fusioneret til et myc-tag i 3 cancer cellelinjer: HeLa, MCF7 og U87 glioblastom (figur 3).. Forbigående transficerede celler blev behandlet enten med H

2O

2 eller bestråling og analyseret for γH2A.X DNA-skader foci og TERT lokalisering ved hjælp af den fusionerede myc-tag. Lokaliseringen for mitokondrie (mito TERT) og nuklear TERT er vist i fig. 3A og B (øverste paneler). Der var ingen forskel i DNA-skader niveauer mellem celler transficeret med enten vektor eller un-transficerede celler før behandling. Vi fandt imidlertid, at der i alle 3 cellelinier og begge behandlinger, celler med en mitokondrie TERT lokalisering havde signifikant mindre DNA skade i forhold til de celler, der enten udtrykte nukleare TERT eller var un-transficerede (fig. 3 A-D). For at udelukke, at endogene telomerase interageret med over-udtrykte shooter TERT protein vi gentog eksperimentet i en SV40 udødeliggjort MRC-5 cellelinie, der fastholder sine telomerer via en alternativ forlængelse mekanisme [20]. Indlæg bestråling, fandt vi den samme beskyttende effekt af mitokondrie telomerase (fig. 3 E). Vi brugte også et antistof mod 53BP1, andet protein involveret i DNA skade responset at bekræfte vores resultater, at DNA-skader foci er høj i celler transficeret med nukleare TERT mens i modsætning dem transfekteret med mitokondrie TERT udviser mindre DNA-skader end un-transficerede celler ( fig. S3).

H

2O

2 behandling i forhold til lokalisering nukleare TERT i 4 forskellige cellelinjer. A: organel specifikke TERT vektorer transficeret ind i HeLa-celler. Overpanel: repræsentative billeder af celler transficeret med mitokondrie og nukleare TERT shooter vektorer med og uden behandling med 200 uM H

2O

2 til 3 timer. TERT-farvning (ved hjælp myc-tag) fusioneret til TERT-protein (grøn) og γH2A.X farvning (rød) til DNA-skader foci. Pile viser transficerede celler. Lavere panel: Kvantificering af celler med høje niveauer af DNA-skader foci for transfekterede og un-transficerede celler med og uden H

2O

2 behandling. Søjler er gennemsnit ± SE fra 3 uafhængige eksperimenter, * P 0,05. B: organel specifikke TERT vektorer transficeres til MCF7-celler. Paneler som beskrevet for A. C-F: Kvantificering af celler med høje niveauer af DNA-skader foci for transficerede og un-transficerede celler med og uden røntgenstråling. C: MCF7 efter 20 Gy X- bestråling. D: U87 efter 20 Gy X-bestråling. E: MRC-5 /SV40 efter 10 Gy røntgenbestråling. Barer er gennemsnit ± SE fra 3 uafhængige eksperimenter. * P. 0,05

Da store mængder af DNA-skader nukleare menes at nedsætte overlevelse af celler, vi analyserede, om de anvendte stress behandlinger også vil skade celle overlevelse og inducere apoptose. Vi behandlede 3 cellelinier transficeret med både TERT shooter vektorer med H

2O

2 og X-bestråling og bestemt apoptose induktion anvendelse af et antistof mod aktiveret caspase 3. Interessant, ikke en enkelt celle transficeret med mitokondrie TERT viste nogen tegn af apoptose medens omkring 20% ​​af ikke-transficerede celler og mellem 40-60% af celler, der udtrykker det nukleare shooter apoptotiske (fig. 4). Dette resultat bekræfter, at faktisk den inducerede DNA-skader findes i celler med nukleare TERT lokalisering virkninger direkte på celle overlevelse, mens mitokondrie TERT effektivt beskytter mod apoptose. For at belyse den mekanisme, hvormed mitokondrie TERT kunne beskytte kræftceller fra DNA skader nukleare målte vi mængden af ​​mitokondrie ROS efter H

2O

2 behandling og bestråling hjælp mitosox farvning som et mål for mitokondrie superoxid generation foruden at myc-TERT farvning for nukleare og mitokondrie “shooter” vektorer i de samme 3 cancer cellelinjer (fig. 5 A-E). Mitosox farvestof optages af mitokondrier i et membranpotentiale specifik måde. For at udelukke, at forskellige membran potentiale forårsaget virkningerne, vi målte mitrokondriemembranen i HeLa og MCF7-celler transficeret med både TERT skytter og sammenlignede dem med un-transficerede celler efter H

2O

2 behandling samt X bestråling. I overensstemmelse med vores tidligere fund af en øget mitrokondriemembranen i MRC-5 /hTERT sammenlignet med parentale fibroblaster bekræfter resultaterne en signifikant højere membranpotentiale i celler overudtrykker mitokondrie TERT, som er i HeLa-celler allerede fremgår endnu før enhver stress behandling (fig. S4). Derfor mitosox niveauer, der findes i vores eksperimenter virkelig repræsenterer forskellige ROS niveauer, som er afhængige af TERT lokalisering. Vi fandt, at overekspression af mitokondrie TERT i alle celletyper resulterede i signifikant lavere ROS-niveauer efter H

2O

2 behandling og bestråling i forhold til FN-transficerede celler eller dem, der over-udtrykte nukleare TERT (fig. S4 )

Repræsentative billeder af aktiveret caspase 3 (vist i rødt) i A:. Hela, B: MRC /SV40, C: U87-celler transficeret med mito TERT og nuklear TERT (myc-tag, vises med grønt) efter 400 uM H

2O

2 behandling i 3 timer eller bestråling med 20 Gy. D: Kvantificering af procentdelen af ​​apoptotiske celler i de 3 cellelinier efter H

2O

2 behandling, E: Kvantificering af procentdelen af ​​apoptotiske celler i de 3 cellelinier efter røntgenbestråling. Barer nuværende gennemsnit og standardafvigelse fra omkring 45 transfekterede celler pr tilstand og cellelinje. * P 0,05

Overpanel:. Repræsentative billeder af ROS farvning (rød, mitosox) og TERT lokalisering (myc-tag, grøn) efter organel specifik TERT transfektion og 100 uM H

2O

2 behandling i 3 timer i HeLa-celler. Øverste række: mito- TERT, nederste række: nuklear TERT. Pile angiver transficerede celler. Lavere panel: Kvantificering af ROS-niveauer målt i procent af mitosox positive område fra hele cytoplasma hjælp ImageJ i transficerede og un-transficerede celler. B: MCF7-celler, paneler som beskrevet for A. C: kvantificering af ROS i U87 celler efter 3 timer på 100 uM H

2O

2 behandling. D-F: Kvantificering af ROS niveauer efter røntgenbestråling. D: MCF7 efter 20 Gy X-bestråling. E: U87 efter 20 Gy røntgenbestråling F: MRC-5 /SV40 efter 10 Gy røntgenbestråling. Søjler repræsenterer gennemsnit ± SE fra 3 uafhængige eksperimenter. * P. 0,05

Igen vi brugte MRC-5 /SV40 celler uden endogene telomerase at bekræfte resultaterne fra de tre kræftceller og fundet den samme beskyttende virkning af mitokondrier lokaliseret TERT på ROS niveauer ( fig. 5F). ROS-niveauer i celler, der udtrykker det nukleare TERT “shooter” var sædvanligvis ikke forskellige fra un-transficerede celler med undtagelse af MCF7 og MRC-5 /SV40-celler efter bestråling, hvor det nukleare shooter transficerede celler viste lavere ROS niveauer end un-transficerede celler.

Disse data antyder, at ved shuttling ind mitokondrier telomerase /TERT ikke kun beskytter organel, men ved at reducere mitokondrie superoxidproduktion også indirekte beskytter kernen fra DNA-skader. Lignende observationer af telomerase pendulfart fra nukleoplasma til nucleoli var tidligere blevet indberettet efter ioniserende stråling i primære og cancerceller [21]. Forfatterne havde spekuleret, at telomerase negativt kan påvirke reparation enzymer i kernen under betingelser med forøget DNA-skade og stress. Vores resultater synes at støtte dette forslag, at telomerase kunne være “uønsket” i kernen under forhold med DNA-skader. Telomerase er blevet vist at “helbrede” kromosomer ved at forsøge en form for DNA-reparation ved tilsætning telomer-sekvenser til brudte telomer ender [22]. Dette kan imidlertid ikke føre til korrekt DNA-reparation, som vides at blive udført af sande DNA reparationssystemer.

Vores resultater viser, at mitokondriel telomerase lokalisering specifikt formindsker mitokondrie ROS-generering og cellulær oxidativ stress efter induktion af eksogent stress genereret af H

2O

2 eller bestråling i cancerceller og kan derved forhindre skader på det nukleare DNA. Det kunne også forklare, hvorfor shuttling af telomerase fra kernen for mitokondrier synes at fremme cellulær overlevelse, mens der i celler, hvor telomerase er ikke i stand til at forlade kernen DNA-skader akkumulering observeres.

Diehn og kolleger rapporterede for nylig, at kræft stamceller, der producerede mindre ROS grundet højere antioxidant udtryk akkumuleret mindre DNA-skader efter ioniserende stråling [23]. Det ville være interessant at undersøge, om disse celler har også mere udelukket telomerase end ikke-cancer stamceller efter bestråling. Det er blevet vist, at cancer stamceller udtrykker høje telomeraseaktivitet niveau; men intet er kendt om TERT pendulfart i disse celler [24].

Vi har vist tidligere, at eksogent ROS generation ved bestråling i fibroblaster skader mitokondrier og accelererer nuklear DNA-skader skabe en positiv spiral [25]. Vi foreslår, at en sådan funktionel interaktion mellem mitokondrier og kernen også eksisterer i cancerceller og andre telomerase-positive celler, hvor telomerase træder mitokondrier for at mindske ROS som induceres af kemoterapeutiske lægemidler og bestråling. Det ser således ud, at anti-cancer behandlinger kan fremkalde en hidtil ukendt, hidtil ukendt mekanisme af telomerase shuttling der forhindrer DNA-beskadigelse nuklear ved at reducere mitokondrie ROS-generering via induktion af telomerase shuttling. På grund af sin heterogene mønster det kunne også forklare modstand nogle, men ikke alle, kræftceller mod terapeutiske behandlinger.

Materialer og metoder

Celler

HeLa, MCF7, U87 og MRC5 /SV40-celler stammede fra ATCC. MRC5 blev indkøbt fra ECACC (London). hTERT overekspression blev udført under anvendelse retroviral transfektion af hTERT som tidligere beskrevet [10]. U 87 og MRC5 /SV40-celler blev dyrket i MEM og DMEM henholdsvis suppleret med 1% ikke-essentielle aminosyrer, 10% FCS (Sigma), 2 mM glutamin og 1% penicillin /streptomycin. Alle andre celletyper blev dyrket i DMEM (PAA) indeholdende 10% FCS (SIGMA), 1% penicillin /streptomycin (PAA) og 2 mM glutamat (Gibco). Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C ved omgivende oxygen og 5% CO

2.

Behandlinger Salg

Celler blev podet 1 eller 2 dage før behandling på 19 mm dækglas i 12 brønds plader til immuno-fluorescens-farvning (5 x 10

4 per brønd).

H

2O

2 (SIGMA) behandling blev udført i serumfrit medium i de angivne tidsrum og koncentrationer. Den anvendte H

2O

2 koncentrationer var blevet optimeret for hver forskellig type eksperiment. X-bestråling ved 10 og 20 Gy blev udført under anvendelse af en Faxitron (Elektron Technology, UK). For alle strålingsforsøg (undtagen apoptose analyse) celler blev fikseret og analyseret 20 minutter efter behandling. Cellerne blev fikseret under anvendelse af 4% paraformaldehyd i PBS i 10 min.

Immuno-fluorescens Farvning og Imaging

Celler blev fikseret på dækglas under anvendelse af 4% paraformaldehyd i 10 min. Enkelt eller dobbelt immunofarvning blev udført med de følgende primære antistoffer: muse γH2A.X (Upstate), kanin-anti-TERT (Rockland), kanin-anti-Ki67 (Abcam) og anti myc-tag (Abcam). Specificitet og mangel på baggrundsfarvning af det anvendte TERT antistof er blevet bekræftet (Fig. S5). Sekundære antistoffer var: gede-anti-mus og kanin AlexaFluor 594 og 488 (molekylære prober /Invitrogen). Nuklear farvning blev observeret ved anvendelse af DAPI. Billeder for hver kanal blev opnået under anvendelse af et AxioImager Z1 mikroskop (Zeiss) udstyret med korrekt filter terninger til spektralt skelne AlexaFluor

488 og AlexaFluor

594, sikrer ingen bleedthrough i /fra enten fluorofor (etableret tidligere, data ikke vist) . Billederne blev efterfølgende analyseret ved hjælp ImageJ. Tærskler blev defineret for hvert billede individuelt.

Konfokal Fluorescens mikroskopi og Co-lokalisering Analyse

Cellerne blev fyldt med 400 nM mitotracker grøn (Molecular sonder) i 30 minutter ved 37 ° C før fiksering og derefter farvet med anti-TERT-antistof og Alexa Fluor® 594. Billeder blev taget med et Zeiss LSM 510 udstyret med en 63 × 1,4 NA mål med pinhole sæt til 1 Airy enhed (Zeiss, Tyskland). Z stakke opnåedes hver 100 nm for hver celle (prøveudtagning 2 × Nyquist kriterier). Billeder blev udfoldede og derefter analyseret for objekt co-lokalisering i 3D ved hjælp af Huygens-software (SVI, Holland). For co-lokalisering analyse og image forberedelse blev de udfoldede billeder gengives i 3 dimensionelle mængder. Enkelte celler blev isoleret i billedet og enkelt, samlet objekter (mitokondrie og tert) blev identificeret ved hjælp af ‘Objekt colokalisering’ i Huygens med en cut-off for at udelukke eventuelle objekter mindre end en mitokondrier i mitotracker grønne kanal. Huygens derefter beregnet en Pearsons korrelation koefficient for hver celle i 3 dimensionel colokalisering mellem mitokondrier og Tert farvning. Dette gjorde det muligt præcist at forudsige sande en lokalisering (inden for grænserne af diffraktion begrænsning) af de to farvestoffer uanset deres forskellige bølgelængder.

Organelbiosyntese Specifik transfektion

TERT indeholder nukleare og mitokondrie organel specifikke vektorer ( pCMV-myc-mitoTERT og pCMV-myc-nucTERT var en slags gave fra J. Haendeler og Joachim Altschmied, Duesseldorf, Tyskland og beskrevet tidligere [9], [11]). Transient transfektion blev udført under anvendelse af lipofectamin ™ 2000 (Invitrogen, USA) af mito-TERT og nuc-hTERT “shooter” vektorer. De gennemsnitlige transfektionseffektiviteter 48 timer efter transfektion var mellem 25 og 30%. Forbigående transficerede celler blev behandlet 2 dage efter transfektion med enten H

2O

2 eller bestråling.

Bestemmelse af ROS Level

Celler blev farvet med 5 uM mitosox (Invitrogen, USA ) i 15 min efter H

2O

2 behandling eller bestråling forud for fiksering og antistoffarvning. ROS-niveauer blev bestemt som den procentdel af cytoplasmatisk mitosox signal fra total cytoplasmatisk område ved hjælp af billede J (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

Analyse af DNA Damage

Analyse af DNA-skader blev udført ved anvendelse immuno-fluorescens enten som en enkelt farvning med γ-H2A.X eller dobbelt farvning med TERT. Celler blev fikseret, permeabiliseret med PBG (PBS, BSA, fishskin gelatine og 0,5% Triton) og γ-H2A.X antistof blev anvendt til cellerne, og derefter farvet med Alexa Fluor® 594. Anti myc-tag og Alexa Fluor® 488 var anvendt til at visualisere transficerede TERT-protein. Objektglas blev undersøgt under anvendelse af et Zeiss Axiovision fluorescensmikroskop (Zeiss, Tyskland). Til analysen af ​​DNA skade antallet af DNA-skader foci blev talt for hver type TERT lokalisering separat fra 20-40 celler pr gruppe og cellelinje.

Måling af TERT Udelukkelse Rate

For hver enkelt celle, TERT lokalisering blev manuelt kvantificeret ved at sammenligne telomerase signaler i og uden for kernen hjælp til billede J. Subcellulære områder blev bestemt til nukleare og cytosol regioner ved hjælp frihånd valg. Expression signaler i det valgte område blev vurderet ved hjælp af areal beregning funktion efter tærsklingsrutine at fjerne støj. Resultatet af hver enkelt celle angivet en procentdel af TERT signal udtrykt i subcellulære rum:

% TERT nukleare udtryk = TERT signal i kerne område /total TERT signal × 100,

% TERT cytoplasmatisk udtryk = TERT signal i cytosolisk område /total TERT signal × 100. Den gennemsnitlige procentdel af nuklear og cytoplasmatisk lokalisering af TERT fra mindst 30 individuelle celler blev taget for at bestemme den gennemsnitlige procentdel af hele befolkningen.

Korrelation for Cellulær TERT Lokalisering og DNA Damage Level

Vi klassificeret lokaliseringen af ​​tERT i 3 klasser: nuklear tERT (N): 75% -100% af tERT signal befinder sig inden i kernen, cytoplasmatiske tERT (C): 75% -100% af tERT signal opholdssted uden for kernen og alle andre procentdele for klassen af ​​mellemprodukt lokalisering (i). For hver af de 3 klasser bestemmes vi antallet af γH2A.X foci fra omkring 40-100 celler pr cellelinje.

Analyse af apoptose

Hela, U87 og MRC /SV40-celler blev transficeret med nukleare og mitokondrie TERT shooter. Efter 2 dage blev de behandlet med enten 400 uM H

2O

2 eller 20 Gy bestråling og venstre for en mere dag (U87 og MRC /SV40) eller 2 dage for HeLa grund af en kendt forsinkelse i apoptose induktion i disse celler. Efter fiksering blev cellerne farvet med myc-tag for TERT og aktiveret caspase 3 (Abcam) for at mærke apoptotiske celler. Resultater er blevet bestemt ud fra 30-150 transficerede celler pr cellelinje og tilstand.

Statistik Salg

En måde ANOVA blev udført under anvendelse Sigma Plot (Systat Software Inc, USA).

Støtte oplysninger

figur S1.

Immuno-blot af nuklear og mitokondrie fraktion i Hela og MCF7-celler behandlet med 400 pM H

2O

2 i 5 dage.