PLoS ONE: Intercellulær Omfordeling af cAMP ligger bag Selektiv Undertrykkelse af kræft cellevækst ved Connexin26

Abstrakt

connexiner (Cx), som udgør gap junction intercellulære kanaler i hvirveldyr, har vist sig at undertrykke transformeret cellevækst og tumorigenese , men mekanismen (er) stadig stort set spekulative. Her definerer vi den molekylære basis for, Cx26, men mindre hyppigt Cx43 eller Cx32, selektivt giver vækstsuppression på cancerceller. Funktionel intercellulær kobling er vist at være nødvendig, hvilket frembringer partielle blokke af cellecyklussen på grund af langvarig aktivering af flere mitogene kinaser. PKA er både nødvendig og tilstrækkelig for Cx26 induceret væksthæmning i lavt serum og fraværet af forankring. Aktivering af PKA var ikke forbundet med forhøjede cAMP-niveauer, men syntes at skyldes en omfordeling af cAMP i hele cellepopulationen, hvilket eliminerer cellecyklussen svingninger i cAMP nødvendige for effektiv cellecyklusprogression. Cx43 og Cx32 undlader at mediere denne omfordeling som modsætning Cx26 er disse kanaler lukket under G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus, hvor cAMP-niveauer højdepunkt. Sammenligninger af tumorcellelinjer indikerer, at dette er et generelt mønster, med væksthæmning ved connexiner forekommende når cAMP oscillerer med cellecyklus, og gap junction forbliver åben hele cellecyklussen. Således hul junktionel kobling, i mangel af eksterne signaler, giver et generelt middel til at begrænse mitotiske sats af cellepopulationer

Henvisning:. Chandrasekhar A, Kalmykov EA, Polusani SR, Mathis SA, Zucker SN, Nicholson BJ (2013) Intercellular Omfordeling af cAMP ligger bag Selektiv Undertrykkelse af kræft cellevækst ved Connexin26. PLoS ONE 8 (12): e82335. doi: 10,1371 /journal.pone.0082335

Redaktør: David M. Ojcius, University of California Merced, USA

Modtaget: 30 august, 2013; Accepteret: 30 Oktober 2013; Udgivet: December 3, 2013 |

Copyright: © 2013 Chandrasekhar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af følgende: NIH – R01 CA048049, P30 CA54174, P01 AG19316, og P30 AG013319. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Gap junctions er arrays af intercellulære kanaler, der er de eneste mediatorer af direkte intercellulære udveksling af små metabolitter og signalmolekyler i flercellede systemer [1,2]. I hvirveldyr, er disse kanaler sammensat af integrale membranproteiner kaldet connexiner (Cx), med fire transmembrandomæner og cytoplasmiske N- og C-termini. Seks connexiner kommer sammen for at danne en hemichannel eller connexon, og to sådanne hemichannels fra modsatrettede celler dock til at skabe den intercellulære gap junction-kanal [3]. Integralet, men specialiseret rolle gap junctions i forskellige væv lettes ved tilstedeværelsen af ​​mindst 21 forskellige connexin isoformer i mennesker, med tydelige proteiner, der er klassificeret i henhold til deres molekylvægt [4], og et gen nomenklatur er beskrevet i [5 ]. De Cx43, Cx32 og Cx26 proteiner studeret her, er kodet af

GJA1

,

GJB1

og

GJB2

gener hhv.

Næsten da deres opdagelse, gap junctions har været impliceret som tumorsuppressorer i flere væv [6]. Dette er blevet bekræftet i genetiske skærme af talrige tumor typer, herunder bryst carcinom [7], prostatakræft [8], og melanom [9]. Et væld af tumortyper og transformerede cellelinier demonstrere nedsat connexin proteinekspression og /eller gap junction-funktionalitet (revideret i 10). Endvidere er der flere dokumenterede tilfælde, hvor den exogene ekspression af connexiner i en transformeret cellelinje kan dramatisk undertrykke sine transformerede egenskaber og dets evne til at danne tumorer i nøgne mus [Cx43 på C6-glioma-celler [11]; Cx43 i 10T1 /2 embryonale mesenkymale celler [12]; Cx43 og Cx32 i LNCaP prostatacancerceller [13]; Cx26 i HeLa cervical cancerceller [14]; Cx26 og Cx43 i MDA-MB-231 brystcancerceller [15,16], og; Cx32 i SKHep1 hepatomceller [17]. Sidstnævnte er også i overensstemmelse med en stigning i hepatisk tumorigenese observeret i Cx32 – /- mus [8,18]

Vækst undertrykkelse af transformerede celler ved Cx udtryk er blevet forbundet med regulering af pro- og anti-apoptotiske. proteiner (f.eks Bcl-2) [19,20] eller ændringer i cellecyklusproteiner såsom Nov (CCN3) [21], Skp2 [22] og p21 [23,24]. Men at etablere en direkte forbindelse mellem nogen af ​​disse begivenheder og udvekslingen af ​​signalmolekyler mellem celler gennem gap junctions har vist undvigende. Fremskridt i denne henseende er blevet begrænset af begrænsede oplysninger om både permeabilitetsegenskaberne connexiner, og spatio-temporale fordeling af lavmolekylære metabolitkoncentrationer i flercellede populationer. I nogle tilfælde er der blevet foreslået connexiner at undertrykke væksten selv i fravær af påviselig gap junction-kanal aktivitet [15,21,24,25,]. Dette kan ske gennem interaktioner med andre proteiner er kendt for at binde sig til connexiner (gennemgået af [26]), gennem deres funktion som hemichannels, som kan bidrage til øget celledød [27], eller selv gennem mis-lokalisering af dele af proteinet ( 25). Men endelig forbindelser mellem nogen af ​​disse processer og anti-onkogene faktorer mangler at blive etableret.

Mens rolle celle kobling, i forhold til andre connexin funktioner, er stadig et emne for debat i tumor undertrykkelse, linket mellem gap junction kobling og mitogenese er blevet etableret i flere ikke-patogene forhold. Adskillige vækstfaktorer, såsom EGF [28] og PDGF [12] har vist sig at inducere forbigående afkobling af celler som en del af den umiddelbart tidlige reaktion, der går forud initiering af mitose. Onkogener som

v-src

har vist sig at have lignende, men mere langvarige effekter på koblingen [29].

In vivo

, som en del af den regenerative respons efter partiel hepatektomi, en akut tab af gap junctions mellem hepatocytter ses at umiddelbart forud for det første bølge af mitose [30]. som det har været tilfældet i tumorer, den molekylære basis for den mitogene inhibering er forbundet med celle kobling er dog stadig skal løses. I denne undersøgelse har vi forsøgt at definere den molekylære mekanisme for væksthæmning ved connexiner i HeLa-celler, en meget godt karakteriseret transformeret livmoderhalskræft cellelinie, og teste generalisering af sådanne mekanismer med andre celletyper. Vores resultater viser, at Cx26 specifikt tillader passage af cAMP mellem celler, udjævne de højdepunkter og lavpunkter af cAMP, der forekommer under cellecyklussen og via PKA-aktivering, skabte forsinkelser af cellecyklus. Effekten er connexin specifikke som andre connexiner, ligesom Cx43 og 32, tæt under cellecyklussen på præcis det tidspunkt, hvor cAMP-niveauer akkumulerer. Undersøgelse af adskillige tumorcellelinier indikerer en generel til, at denne virkning så længe cAMP oscillationer bliver set og kanalerne forbliver åbne i hele cellecyklussen.

Resultater

Cx26, men ikke Cx32 eller 43, hæmme forvandlet vækst HeLa celler

HeLa-celler er en bredt studeret livmoderhalskræft cellelinie, som mangler endogene gap junctions, men tillader robust udtryk, passende handel, og behandling af eksogent udtrykte connexiner. Vi udnyttede dette system til at karakterisere connexin vækst egenskaber ved at forberede puljede kloner af HeLa celler, der udtrykker Cx43 (HeLa43), Cx32 (HeLa32), og Cx26 (HeLa26). Hver af HeLa-transfektanter udtrykker connexiner på tilsvarende, og i henhold til den forudsagte MW på Western blots (fig S1). De danner typiske gap junction plaques ved celle-celle-interface (figur 1A) og viser lignende satser af overførsel af præinstalleret calcein farvestof til omgivende umærkede celler, med ~ 95% af indlæste celler er koblet til mindst en nabo, og 73-83% af første ordens naboer modtager farvestof (tabel 1).

(A) Immunfluorescensfarvning, anvendelse af det passende anti-Cx-antistof, viser karakteristisk udtryk for connexiner i plaques mellem celler. HeLaPar testet negativt med alle tre anti-Cx antistoffer (anti-antistof-Cx26 resultater er vist her) (målestokke 10 um).

(B) Vækst af HeLaPar (firkanter) med pools af HeLa-kloner transficeret med Cx26 (cirkler), Cx32 (omvendt trekant) eller Cx43 (opretstående trekant), underkastes 3 dage af serum sult (dage 0-3) efterfulgt af 3 dage i 1% serum (dag 3-6), afslører selektiv vækst suppression af Cx26. Repræsentative data fra en af ​​tre forsøg er vist, med punkter, der repræsenterer middelværdien ± SEM af tredobbelte platings.

(C) Topologi diagram af Cx26, med ekstracellulære overflade ved toppen, afbilder placeringen af ​​to punktmutanter anvendes i denne undersøgelse, der forstyrrer forskellige aspekter af kanal funktion (R75Y og T135A).

(D) Immunoflourescence farvning med et anti-Cx26 antistof viser, at både mutante connexiner danner plaques på celleoverfladen, med R75Y svagt have mindre, mindre hyppige plaques, og T135A have større og hyppigere plaques end W.T. Cx26 (panel A) (skala barer, 10 um).

(E) Hemichannel funktion blev analyseret ved LY farvestofoptagelse i et farvestof slippe assay (Scout et al., 2002). Den venstre panel viser fasekontrast billede (stjerner angiver celler optage farvestoffet), og det højre panel viser den fluorescerende billede (skala barer, 20 um). Bemærk, at nogle dye-positive celler synes at have modtaget farvestof gennem intercellulære overførsel fra den oprindelige celle, der tog farvestof i HeLa26 kulturer.

(F) Sammenligning af væksten i lavt serum (jf panel B) mutant Cx26 udtrykkende celler (Cx26T135A – diamanter, Cx26R75Y – trekanter) med dem, der udtrykker vægt HeLa26 (cirkler) og HeLaPar celler (kvadrater) viser, at de funktionelle intercellulære kanaler W.T. Cx26 er nødvendige for vækst undertrykkelse. Repræsentative data fra en af ​​tre eksperimenter er vist, med punkter, der repræsenterer middelværdien ± SEM for tredobbelte platings.

Gap Junction

Hemichannel

HeLa Cell type

% Koblet

en

% First Order

b kobling

% Celler Påfyldning med Ekstracellulær Dye

c

Parental000Cx 4395 ± 1,3273 ± 10.43NTCx 3296 ± 2,0180 ± 9.53NTCx 2693 ± 0,6783 ± 8,283 ± 1.7Cx26 R75Y006 ± 1.2Cx 26T135A000Table 1. Funktionel analyse af gap junctions og Hemichannels.

a procentdelen af ​​forudindlæste celler passerer farvestof til mindst én modtager celle.

b procentdelen af ​​første ordens celler (dvs. dem med det samme støder op til donoren celle) modtager farvestof efter 6 timers udpladning.

c procentdelen af ​​celler, der viser farvestof optagelse af Lucifer Yellow (LY) (se figur 1E). Resultaterne omfatter ikke celler modtager LY sekundært gennem kobling (dvs. Cx26) .NT: Ikke testet CSV Hent CSV

Effekten af ​​connexin udtryk på de transformerede vækst karakteristika af HeLa-celler blev vurderet under lav (1%) serum forhold og på poly (2-hydroxyethylmethacrylat) (polyHEMA) belagte plader, der ikke understøtter celle-substrat-adhæsion [31]. På trods af de tilsvarende niveauer af kobling i alle connexin transfektanter, fandt vi, at kun HeLa26 viste væksthæmning, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser (Mesnil et al., 1995). HeLa26 viser 3 gange længere fordoblingstider i lavt serum betingelser (figur 1B), og ≥2 gange langsommere forankringsuafhængig vækst (figur S2) sammenlignet med parentale HeLa-celler (HeLa PAR) eller andre connexin transfektanter, som demonstreret i tre uafhængige HeLa26 kloner. Alle her anførte oplysninger blev opnået fra pools af kloner blandet i lige forhold for hvert eksperiment.

intercellulær kommunikation af Cx26 er nødvendig for vækst undertrykkelse

Den specifikke funktion Cx26 ansvarlig for vækst undertrykkelse blev vurderet ved hjælp af Cx26 punktmutationer der ablerede kanal funktion. The Cx26T135A mutation ved den cytoplasmatiske udgangen af ​​den tredje transmembrane domæne (figur 1C) forhindrer åbning af enten gap junction kanaler eller hemichannels [32]. Den Cx26R75Y mutation i den første ekstracellulære løkke (Figur 1C) forhindrer gap junction-kanal dannelse, men efterlader hemichannel fungerer stort set uændret [33]. Gap junction og hemichannel egenskaber alle Cx26 konstruerer, samt Cx43 og 32, blev bekræftet ved hjælp af Lucifer Yellow overførsel mellem celler, eller optagelse fra medierne efter mekanisk stimulering (figur 1E) henholdsvis (sammenfattet i). Begge Cx26 mutanter danner plaques i HeLa-celler (Figur 1D), der dokumenterer, at disse mutationer stadig støtter samling af gap junction strukturer [32]. Plaques syntes at være mere talrige i tilfælde af HeLa26T135A, og mindre i tilfælde af HeLa26R75Y (C.F. figur 1A og D), i overensstemmelse med tidligere angivelser som Cx26R75Y kan reducere stabiliteten og størrelsen af ​​gap junction plaques [34].

modsætning vildtype (W.T.) Cx26, ingen af ​​de Cx26 mutanter forårsaget vækst suppression af HeLa-celler, enten i lavt serum (figur 1F) eller under forankringsuafhængige betingelser (figur S2). Således er intercellulære kommunikation nødvendig for væksthæmning af Cx26. Mens hemichannel funktion HeLa26R75Y gjorde reducere mætningsdensitet, hvilket antyder en delvis rolle for hemichannels i graden af ​​celle pakning, var virkningen ved en moderat 20%, i sammenligning med W.T. Cx26, hvilket reducerede mætningsdensitet med 60%. Selvom intercellulære kobling var klart nødvendigt for connexin medieret tilbageførsel af de transformerede vækstkarakteristika, kobling gennem andre connexiner (Cx43 og Cx32) var ineffektiv, hvilket indikerer en unik rolle for Cx26 kanaler.

Vækst effekter af Cx26 gap junctions formidles af reversible cellecyklus blokke

Som et første skridt i at identificere den mekanisme, hvormed Cx26 gap junction kobling undertrykker forvandlet vækst HeLa-celler, vi spurgte, om dette var en konsekvens af øget celledød, eller nedsat celledeling. HeLa26 celler viste ingen stigning i TUNEL-farvning, eller caspase-3-aktivitet (ikke vist), hvilket indikerer, at Cx26 ikke øgede apoptose i HeLa-celler (tabel S1). Der var en vis stigning i Annexin V og Hoechst mærkning af HeLa26 celler, men disse celler udviste ikke morfologisk karakteristiske for celledød ved apoptose, nekrose eller autofagi. I stedet viste de funktioner i overensstemmelse med celler, der kan være blevet blokeret i cytokinese (se nedenfor), som typisk udviser større permeabilitet membran. FACS-analyse af HeLa Par og Cx26 transfektanterne efter udledning i 1% serum fra thymidin /nocodazol blok (G2 anholdelse), afslørede en langvarig udgang fra mitose i HeLa26 celler, med tilsyneladende forsinkelser i alle faser af cellecyklus. (Figur 2A). HeLa43, HeLa32, og de to mutant Cx26 HeLa-transfektanter show cellecyklus distributioner ligner HeLa Par (data ikke vist). Lignende undersøgelser, der sammenligner væksten efter frigivelse fra G1 blok fremkaldt af dobbelt thymidin blok gav lignende resultater, med udgang fra G1 /S bliver især forsinket i HeLa26 celler sammenlignet med HeLa43, HeLa32, og mutant Cx26 HeLa-transfektanter (data ikke vist).

(A) cellecyklusfordeling af HeLaPar (øverste felt) og HeLa26 (nederste panel) blev analyseret ved FACS [separering af celler i G1 (lysegrå søjler), S (mørkegrå søjler) og G2-M (sort barer) faser] på de angivne tidspunkter efter 1% serum tilføjelse efter serum sult. HeLa26 celler udviser en langsommere progression gennem cellecyklen (fx tid til at vende tilbage til G2: 24 timer mod 16 timer for HeLaPar), samt en bemærkelsesværdig tab af synkronisering. Data er middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg.

(B) Farvning af kernen med DAPI (venstre kolonne) afslører en meget højere frekvens af flere lapper kerner i Cx26 udtrykkende celler (10-14% – paneler III, V og VII) end HeLaPar celler (2 – 5% – panel i). Co-farvning af de samme celler til gamma-tubulin (højre kolonne) viser enten en (hvilende celler) eller to (delende celler) centrosomer i HeLaPar celler (panel ii). I modsætning hertil HeLa26 celler (paneler IV, VI og viii) ofte dele en enkelt centrosom mellem flere kerner (pile), eller har en klynge af flere centrioler (pilespids) (skala barer, 10 um).

(C ) Procenten af ​​multi-fliget celler bestemt ved forskellige dage efter tilsætning af 1% serum, er konsekvent højere i HeLa26 (udfyldte søjler) end HeLaPar (åbne søjler), med den maksimale forskel på 1 dag. Data er gennemsnit ± SEM. * Betegner betydning for p-værdi 0,05. ** Angiver signifikans på p-værdier 0,005.

Hoechst eller DAPI farvning i 1% serum afslørede en betydelig ophobning af polymorfe kerner eller multi-celler med kerne i HeLa26 (≥10% 24 timer efter serum tillæg) i forhold til den, der ses i HeLa Par ( 4%) (figur 2B). Disse celler er betydeligt større og mere fladtrykt end dem med enkelt- kerner, og at være i overensstemmelse med manglende fuldføre M fase og /eller cytokinese. Disse nukleare er forbundet abnormiteter enten enkelte (pile i figur 2B, IV og VI), eller flere (pilespids i figur 2B viii) centrosomer inden for en enkelt celle, deles af flere kerner, eller nukleare lapper. Dette er i modsætning til de sædvanlige to centrosomer forbundet med at dividere HeLa Par celler (åben pil i figur 2B ii), og foreslår, at HeLa26 cellerne har problemer med reguleringen af ​​centrosom dobbeltarbejde. Intakte nukleare membraner, manglen af ​​kondenseret kromatin, og fraværet af TUNEL mærkning i HeLa26 (tabel S1), indikerer, at cellerne ikke indtaster apoptose, men til sidst forlade mitose. I overensstemmelse med denne, mens multi-lappede eller multi-kerneholdige celler er altid mere rigelige i HeLa26 kulturer, de ikke ophobes over tid (figur 2C).

Cx26 gap junction kobling påvirker niveauer og aktivitet af flere mitogen signalmolekyler

i overensstemmelse med de observerede virkninger af Cx26 på cellens cyklus af HeLa-celler, blev aktiveringstilstanden af ​​flere mitogene regulatorer fundet at være kronisk forhøjet i HeLa26 sammenlignet med HeLa Par celler og andre Cx transfektanter (Cx26R75Y vist som et eksempel) under vækst i 1% serum (figur 3 og figur S3). Specifikt niveauerne af CDK-inhibitorer, p21 og p27, som direkte regulerer G1 (p21 og p27) og G2 (p27) progression, var 1,5- til 2 gange højere i HeLa26 celler under serum sult (0 tidspunkt), og forblev højere i 48 eller 24 timer efter 1% serum tilsætning hhv.

(AG) Protein niveauer i HeLaPar (åbne søjler), HeLa26 (lukkede søjler) og HeLa26R75Y (ternede søjler) blev kvantificeret fra digitaliserede billeder af Western blotting (figur 2, Supplerende data) umiddelbart efter serum sult (dag 0), og dagligt efter 1% serum tilsætning. Niveauer for hvert protein blev normaliseret til den for HeLaPar celler på dag 0. Actin tjente som intern loading kontrol. Niveauer af CDK-inhibitorer, p21 (A) og p27 (B), og forholdet af phosphoryleret (aktiveret) og den totale niveauer af MAPK familiemedlemmer og deres regulatorer, MEK (C), ERK (D), JNK (E) p38MAPK (F) og den katalytiske underenhed af PKA (G) blev hver højere i HeLa26. Denne højde, tydelig under serum sult, varet fra 1 – 3 dage, afhængigt af proteinet.

(H) cAMP-niveauer blev vurderet ved ELISA i HeLaPar (åben bar), HeLa26 (lukket bar) og HeLa26T135A (ternet bar). I modsætning PKA-aktivitet, behøver cAMP-niveauer ikke viser konsistente forhøjelser HeLa26 sammenlignet med de andre celletyper. HeLa26R75Y celler viser cAMP niveauer ligner HeLa26T135A. Dataene er middel ± SEM fra mindst tre uafhængige forsøg. Stjerner angiver tilfælde, hvor aktiviteten i HeLa26 er væsentligt højere (* = p 0,05; ** = p 0,005) end BÅDE HeLaPar og HeLa26R75Y eller T135A celler

Flere medlemmer af mitogen aktiveret. proteinkinase (MAPK) -familie, vides at regulere p21 og P27 niveauer (Erk 1/2, p38 og JNK) (figur 3 CE), viste vedvarende stigninger (2- til 3-fold) i HeLa26. To kinaser længere opstrøms, MEK og proteinkinase A (PKA) katalytisk underenhed alpha (figur 3 F og G), viste endnu større langvarige stigninger i aktivitet i HeLa26 (3- til 5-fold for over 72 timer efter serum tilsætning). Disse stigninger blev ikke set i alle mitogene veje som blev observeret nogen ændringer i Akt eller p70 S6 kinase.

Mens langvarig aktivering af MAPK’er er forbundet med nedsat celledeling [35,36], deres akutte aktivering er typisk pro-mitogen. I overensstemmelse med denne, i de første 2 timer efter 1% serum stimulering, viste HeLa Par celler en forbigående aktivering af Erk og JNK og et fald i p38, efterfulgt af genoptagelse af den basale tilstand. I modsætning hertil HeLa26 ikke vise disse forbigående forandringer i aktivitet (figur S4), men kun en langsommere debut aktivering starter ~ 2 timer efter serum tilføjelse.

Aktivering af PKA er både nødvendige og tilstrækkelige for vækst undertrykkelse af Cx26

den funktionelle bidrag elevation af disse kinaser til Cx26 væksthæmning blev vurderet ved siRNA knockdown studier af Erk, JNK og PKA katalytiske underenhed alpha. siRNA’er tilsættes under indledende serumudsultning, 24 timer før tilsætning af 1% serum, forårsagede en 5 gange reduktion i JNK og en 2-fold reduktion af Erk og PKA (figur 4A). Højere siRNA niveauer blev ikke anvendes til at undgå toksiske virkninger på cellerne, som hver af disse signalveje er også påkrævet for basal celledeling.

(A) Lysater af HeLa26 (venstre panel), behandlet med tilfældig sekvens siRNA (kontrol) eller siRNAs specifik for kinaser angivne, blev fremstillet 24 timer efter serum tilsætning og probet med antistoffer mod totalt protein som angivet til venstre for hver blot. Niveauer af alle kinaser blev reduceret, med JNK fald være mest dramatiske. Lysater af HeLaPar celler (højre panel) transficeret med et CA-PKA (konstitutivt aktiv) konstruktion viste meget højere udtryk for PKA end utransficerede kontroller. Actin tjente som en loading kontrol.

(B) Vækst af den forskellige siRNA behandlet HeLa26 celler (åbne søjler) eller HeLaPar celler med og uden konstitutivt aktiv PKA-ekspression (lukkede søjler) sammenlignes som et forhold mellem celle nummer 24 timer efter, og på tidspunktet for, serum tilsætning. Den rolle, konstitutiv aktivering af hver af de mitogene kinaser i vækstinhibering af HeLa26 er tydeligt i tilbageførsel af Cx26 induceret vækstsuppression af deres respektive siRNA’er. Dette er mest dramatisk i tilfælde af PKA, hvor væksten vender tilbage til samme niveau som for HeLaPar celler. Vækstsuppression af HeLaPar celler, i samme grad som det ses i HeLa26 ved CA-PKA-ekspression indikerer, at PKA alene kan mediere denne virkning. Væsentlige forskelle i vækst er angivet med asterisk (p 0,05).

I løbet af de første 24 timer i 1% serum, HeLa Par celler fordoblet i antal, mens HeLa26 celler viste ingen signifikant vækst (figur 4B ), i overensstemmelse med den forsinkede cellecyklusprogression observeret i FACS-analyse i figur 2A. Behandling med siRNA af tilfældig sekvens havde ingen effekt på dette vækstmønster. Erk og JNK siRNA’er enkeltvis eller sammen, forårsagede et delvist tab af vækstinhibering i HeLa26 celler, men siRNA til PKA forårsagede en fuldstændig tilbagevenden til vækstmønster HeLa Par celler. Endvidere over-ekspression af PKA katalytiske underenhed alfa i HeLa-celler (figur 4A, højre panel) undertrykt deres vækst til den samme hastighed som den for HeLa26 celler (figur 4B). Medens aktivering af andre downstream kinaser bidrager til reguleringen af ​​HeLa cellevækst, synes PKA aktivering at være den dominerende indvirkende faktor, at være både nødvendige og tilstrækkelige for effekten af ​​Cx26 på HeLa vækst i lavt serum.

Aktivering af PKA af Cx26 hul junktionel kobling skyldes omfordeling af cAMP, ikke ved elevation i niveauet

Den primære rolle PKA påvist ovenfor stærkt implicerer cAMP som en sandsynlig vækst regulatorisk signal. Men sammenligninger af globale cAMP niveauer i HeLa26, HeLa Par og HeLa26R75Y kulturer (figur 3H) afslørede ingen konsistente forskelle mellem cellelinjer over tre dages vækst i 1% serum. cAMP er dog vist, at være permeable gennem Cx26 gap junction kanaler mellem HeLa-celler [37,38]. Da funktionelle intercellulære kanaler er nødvendige for PKA-aktivering og væksthæmning, dette førte os til at undersøge om en diffusion af cAMP af celler med høje koncentrationer til celler med lavere koncentrationer kan resultere i en større del af celler med aktiverede PKA, uden krav om yderligere cAMP produktion.

for at direkte visualisere cAMP niveauer rumligt, en FRET reporter beskæftiger EPAC som cAMP sensing domænet klemt inde mellem den fælles fiskeripolitik og YFP fluoroforer blev indført i cellerne ved transfektion. Blegning af YFP (acceptoren) fluorphore resulterede i en stigning i CFP (donor) fluorescens (23%) (figur 5A), som ikke blev set, når FFP og YFP blev udtrykt alene (2%) eller sammen, men på forskellige molekyler ( ~ 4%). Forhøjelse af cAMP med 8-Br cAMP (cAMP-agonist), forskolin (adenylcyclase aktivator) og 3-isobutyl-1-methylxanthin (phosphodiesterase inhibitor) forårsagede et tab af FRET til 10%, formodentlig på grund af udvidelse af EPAC molekylet på cAMP binding (data er opsummeret i figur 5B). FRET aflæsninger fra de enkelte celler i ikke-synkroniseret HeLa Par og HeLa26 kulturer afbildet i et konfokalt mikroskop blev korreleret med DNA-indhold og nuklear morfologi. Lejren niveauer i HeLa Par celler steg ~ 2 gange fra interfasen til mitose. Denne forskel blev næsten fuldstændig tabt i HeLa26 celler, som følge af øget interfase niveauer og faldt niveauet i mitotiske celler (Figur 5C). Sporing cAMP niveauer gennem en normal cellecyklus i HeLa par celler synkroniseret ved at dobbeltklikke thymidin blok, bekræftede, at cAMP niveauer forbliver lav i G1 og S, stiger i G2, højdepunkt i metafase, og derefter falde i den sidste del af mitose (figur 5D) . Disse “toppe og dale” af cAMP synes at være elimineret i HeLa26 celler som følge af diffusion af cAMP fra de relativt få M-fase celler, for flertallet af G1 /S-fase celler. Den deraf følgende stigning i cAMP i G1 /S fase celler inducerer aktivering af PKA, som er væksthæmmende på dette stadium af cellecyklus [39]. Dette forklarer resultaterne i Figur 4B, hvor knock-down af PKA (især under G1 /S fase) kan fjerne Cx26 vækst undertrykkende virkninger af Cx26, mens dens aktivering kan efterligne det.

(A) Repræsentation af acceptor fotoblegning FRET, viser en stigning i donor (FFP) fluorescens efter komplet acceptor (YFP) fotoblegning.

(B) FRET effektivitet er minimal, når den fælles fiskeripolitik og YFP udtrykkes separat eller sammen, men ikke forbundet gennem en common carrier. FRET effektiviteten af ​​den dobbelt mærket EPAC konstruere stiger med næsten 10 gange, men falder til kun 3-4 gange over baggrunden, når cAMP-niveauer øges.

(C) FRET målinger 1 dag efter serum Ud fra individuelle celler i enten mellemfasen eller mitose viser, at ændringerne i cAMP-niveauer med cellecyklus set i HeLa-celler elimineres ved ekspression af Cx26.

(D) FRET-analyse af en population af HeLaPar celler synkroniseret i G1, viser oscillerende mønster af cAMP med cellecyklus, hvor niveauet stadig er så lav i hele interfase, og topper under metafase del af mitose.

Scale bar repræsenterer ~ 40 uM. Et minimum af 25 celler gennemsnit for hver celletype og cellecyklus scenen for FRET.

(E) Immuncytokemi af aktiv phospho-PKA (katalytisk subunit alpha) 1 dag efter 1% serum tilføjelse (øverste række) afslører en heterogen farvning mønster i HeLaPar celler og celler, der udtrykker Cx43 eller gap junction-kanal deficient Cx26R75Y mutant. Omvendt p-PKA niveauer i HeLa26 er højere og mere ensartet på tværs af alle celler. Scoring individuelle celler for netto p-PKA-signalet og DNA-indhold som bedømt ved DAPI-farvning afslører en korrelation (lavere grafer), med p-PKA-niveauer var lave i G1 /S (lavere DNA-indhold) og høj i G2 /M (højere DNA tilfreds). Denne forskel er drastisk reduceret i HeLa26 kulturer.

For at bekræfte, om denne omfordeling af cAMP var i overensstemmelse med den generelle stigning i PKA fosforylering på aktivering Thr197 stedet [40] vi havde observeret (figur 3G), vi undersøgte også de rumlige mønstre af p- PKA farvning i HeLa Par, 26, 43 og 26R75Y kulturer (figur 5E). Farvningen af ​​individuelle celler var meget heterogen i alle kulturer, der viser en hurtig vækst i lav serum (HeLa Par, Cx43 og Cx26R75Y). Co-farvning med DAPI afslørede en klar sammenhæng mellem intensiteten af ​​P-PKA mærkning af hver celle med sin DNA-indhold (figur 5E – plots under hver immunfluorescent billede), med de højere niveauer af P-PKA efter DNA-replikation at kravet med observerede top i cAMP-niveauer i M fase er vist i figur 5B. HeLa26 celler præsenterede en undtagelse fra dette mønster ved, at farvning af celler var mere ensartet. Ikke overraskende, korrelationen mellem P-PKA intensitet med DNA-indholdet blev også dramatisk reduceret, i overensstemmelse med de minimale forskelle, vi ser i cAMP niveauer mellem M fase og S-fase celler i disse kulturer (figur 5C). Disse resultater er kun let forklares ved en omfordeling af cAMP via Cx26 kanaler, fra celler med højere koncentrationer (M fase), til celler med lavere koncentrationer (G1 /S fase). Dette resulterer tilsyneladende i en meget højere fraktion af celler der strækker cAMP-niveauer tilstrækkelige til at inducere phosphorylering af PKA, som fører til dens aktivering og en samlet opregulering af PKA-aktivitet i kulturen uden nogen reel stigning i de samlede cAMP-niveauer.

Cx43 og Cx32 kanaler var ineffektive i undertrykkelse af vækst som disse kanaler tæt under cellecyklus

Fordi HeLa43 og HeLa32 celler viser robust intercellulære kobling og givet forudgående dokumentation for, at cAMP kan passere effektivt gennem begge Cx43 og Cx26 kanaler i disse celler [37], vi søgte at afgøre, hvorfor Cx43 og 32 var ineffektive på at undertrykke vækst. Eftersom cAMP-niveauer kun stige i M-fasen, hvor det er blevet rapporteret, at kløften junktionel kobling kan falde, undersøgte vi, om disse tre connexiner reguleres differentielt under cellecyklussen. Celler blev synkroniseret i S-fase ved at dobbeltklikke thymidin blokeret normal (10%) serum. I modsætning til den adfærd i lavt serum (figur 1), alle HeLa cellelinier voksede med samme hyppighed i normalt serum. Graden af ​​synkroni, samt cellecyklusprogression efter frigivelse fra blok, viste sig at være den samme for alle tre connexin transfektanter i normalt serum betingelser. .

Støtte Information

Figur S1.