PLoS ONE: B3GNT3 Expression er en roman Marker korreleret med Pelvic lymfeknudemetastase and Poor Klinisk Outcome i den tidlige fase Livmoderhalskræft

Abstrakt

Baggrund

β1,3-N-acetylglucosaminyltransferase-3-gen (

B3GNT3

) koder et medlem af B3GNT familien, der fungerer som rygraden struktur af dimerisk sialyl-Lewis A og er involveret i L-selectinligandprotein biosyntese, lymfocyt homing og lymfocyt menneskehandel. B3GNT3 har været impliceret som et vigtigt element i udviklingen af ​​visse kræftformer. Imidlertid karakteristika B3GNT3 i udviklingen og progressionen af ​​cancer forbliver stort set ukendt. Således er vores undersøgelse havde til formål at undersøge udtrykket mønster og den prognostiske værdi af B3GNT3 hos patienter med tidlige fase livmoderhalskræft.

Metoder

mRNA og protein niveauer af

B3GNT3

udtryk blev undersøgt i otte livmoderhalskræft cellelinjer og ti parrede livmoderhalskræft tumorer, ved hjælp af real-time PCR og western blotting, hhv. Immunhistokemi (IHC) blev anvendt til at analysere B3GNT3 proteinekspression i paraffinindlejrede væv fra 196 tidlige fase cervikale kræftpatienter. Statistiske analyser blev anvendt til at vurdere sammenhængen mellem

B3GNT3

udtryk scoringer og kliniske parametre, samt patientens overlevelse.

Resultater

B3GNT3

udtryk var signifikant opreguleret i livmoderhalskræft cellelinjer og læsioner sammenlignet med normale celler og tilstødende noncancerous cervikale væv. I de 196 tilfælde af testede debuterende livmoderhalskræft prøver blev B3GNT3 proteinniveauet positivt korreleret med høj risiko typer af human papillomavirus (HPV) infektion (P = 0,026), FIGO stadie (P 0,001), tumorstørrelse (P = 0,025), tumor tilbagefald (P = 0,004), vital status (P 0,001), samtidig med kemoterapi og strålebehandling (P = 0,016), lymphovascular plads involvering (P = 0,003) og vigtigst, lymfeknudemetastase (P = 0,003 ). Patienter med høj B3GNT3 ekspression havde en kortere samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) sammenlignet med dem med lav ekspression af dette protein. Multivariat analyse foreslog, at B3GNT3 udtryk er en uafhængig prognostisk indikator for livmoderhalskræft kræftpatienter.

Konklusioner

Vores undersøgelse viste, at forhøjet B3GNT3 udtryk er forbundet med bækken lymfeknude metastaser og dårligt resultat i den tidlige fase livmoderhalskræft patienter. B3GNT3 kan være en roman prognostisk markør og terapeutisk mål for behandling af livmoderhalskræft

Henvisning:. Zhang W, Hou T, Niu C, Song L, Zhang Y (2015) B3GNT3 Expression er en roman Marker korreleret med Pelvic lymfeknudemetastase and Poor Klinisk Outcome i den tidlige fase livmoderhalskræft. PLoS ONE 10 (12): e0144360. doi: 10,1371 /journal.pone.0144360

Redaktør: Valli De Re, Centro di riferimento Oncologico, IRCCS National Cancer Institute, ITALIEN

Modtaget: Juni 16, 2015; Accepteret: November 17, 2015; Udgivet: December 28, 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hos kvinder livmoderhalskræft er den tredje mest almindeligt diagnosticeret ondartet svulst af den reproduktive tarmkanalen på verdensplan, der tegner sig for en anslået 274.000 dødsfald på verdensplan om året [1]. Talrige undersøgelser har vist, at høj risiko typer af humane papillomavirus (HPV) infektion er en største risiko for livmoderhalskræft udvikling, men det er stadig utilfredsstillende i diagnose og forudsige prognosen [2]. Fremskridt i terapeutiske metoder og diagnostiske værktøjer er faldet forekomsten og dødeligheden af ​​livmoderhalskræft [3]. Det er imidlertid stadig den vigtigste årsag til gynækologisk onkologi dødsfald i udviklingslandene, især patienter med lymfeknudemetastaser [4]. Desuden lymfeknude metastaser er den stærkeste prognostisk faktor for den tidlige fase livmoderhalskræft (FIGO stadie Ib-IIa), og det bestemmer behandlingen strategi for livmoderhalskræft [5]. Ændrede udtryk for onkogener, såsom

Bmi-1

,

URG4

og

C14ORF166

[6-8], er blevet identificeret som potentielle prognostiske markører i livmoderhalskræft. Men kraften i mange identificerede biomarkører til at forudsige lymfeknude metastaser og klinisk resultat af individuelle tumorer er begrænset. Således identifikation af hidtil ukendte og specifikke biomarkører for tidlig påvisning og forudsigelse af lymfeknudemetastase og prognosen hos livmoderhalskræft er vigtig.

Genet, der koder β1,3-N-acetylglucosaminyltransferase-3 (B3GNT3), tidligere kaldes core 1β3GlcNAcT, er placeret på kromosom 19q13.1 og omfatter tre exons [9]. Det er et medlem af β3GlcNAcT familie med en fuld-længde mRNA af 2720 bp som koder for et højt konserveret 43-kDa protein, der er klassificeret som et type II transmembranprotein [10]. Den β3GlcNAcT familien omfatter mindst otte forskellige β3GlcNAcTs der er forbundet med malign transformation [11]. Nedregulering af B3GNT1 er forbundet med dårligt resultat i pancreas duktalt adenokarcinom [12]. Etcheverry [13] fandt, at B3GNT5 blev overudtrykt med en hypomethylated promotor i glioblastom væv sammenlignet med kontrol hjernevæv. Shibata [14] vist, at B3GNT7, der fungerer i biosyntesen af ​​HMOCC-1-antigenet, udtrykkes i højere i humane ovariecancerceller forhold til normale æggestokke. Niveauet af B3GNT8 transkript blev øget markant og kan være involveret i malignitet i leukæmi, laryngeal carcinom, tyktarm og gastrisk cancer [15, 16, 17, 18].

B3GNT3 ekspression er blevet observeret i normalt væv, herunder tyktarmen, jejunum, mave, spiserør, placenta og luftrør [19]. For nylig, Ho [20] rapporterede, at B3GNT3 kan spille en vigtig rolle i at undertrykke de maligne fænotyper af neuroblastomceller, herunder migration og invasion, ved undertrykkelse af FAK, Akt og ERK, som er vigtige nedstrøms signaleringsmolekyler for integriner og talrige vækstfaktorreceptorer . Imidlertid rapporteres det, at B3GNT3 protein deltager i udviklingen og progressionen af ​​humane cancere, såsom ikke-Hodgkin lymfom (NHL), coloncancer, esophageal pladecellekræft (OSCC), og pancreas og hepatocellulære cancere [10,19,21 ]. For eksempel, han [21] fundet en sammenhæng mellem den

B3GNT3

locus, CA19-9 niveauer og sialyl Lewis A-antigen, som kan være den potentielle mekanisme i OSCC, bugspytkirtel og hepatocellulære kræftformer. I ætiologien af ​​NHL, B3GNT3 spiller en dominerende rolle i L-selectin ligand biosyntese, hvilket er vigtigt for tumorcelleoverlevelse og metastase [10]. B3GNT3 sandsynligvis er den mest sandsynlige kandidat involveret i biosyntesen af ​​rygraden struktur dimer sialyl Lewis A (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc), som er en cancerassocieret glycosphingolipid antigen i humane coloncancer væv og coloncancercellelinie Colo205 [19]. Desuden Yeh et al. [9] rapporterede, at B3GNT3 dirigerer udvidelse af kernen 1 mucin-typen O-glycan, som ofte danner 6-sulfo sialyl Lewis x antigen, en epitop udtrykt i højendotelvenoler (HEV) og fungerer som en L-selectin ligand kræves for lymfocytmålsøgning. Disse resultater antydede, at B3GNT3 kan spille forskellige roller i udviklingen og progressionen af ​​forskellige kræftformer. Ikke desto mindre undersøgelser af sammenhængen mellem B3GNT3 og kræft er sjældne, og der er ingen offentliggjorte rapport om kendetegnene for B3GNT3 udtryk og dets kliniske /prognostisk betydning i livmoderhalskræft, især sammenhængen mellem B3GNT3 udtryk og bækken lymfeknude metastaser (PLNM).

Her har vi til formål at udforske udtryk mønster af B3GNT3 i livmoderhalskræft cellelinjer og debuterende livmoderhalskræft prøver. Desuden undersøger vi forholdet mellem det og klinisk-patologiske parametre og analysere dens værdi i prognose af debuterende cervikale kræftpatienter baseret på kliniske outcome data.

Metoder

Etik erklæring

den videnskabsetisk komité af Cancer center, Sun Yat-Sen University (Kina), forudsat etisk godkendelse til denne undersøgelse, og alle patienter skal skriftligt informeret samtykke. Alle prøver blev håndteret og opbevaret anonymt i henhold til etiske og juridiske standarder.

Cellelinjer

Livmoderhalskræft cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, MD, USA). De cervikale cancercellelinier, herunder HeLa, HeLa229, HCC94, SiHa, ME-180, MS751, Caski og C-33A, blev opretholdt i RPMI-1640 medium (Gibco BRL, Rockville, MD) tilsat 10% føtalt bovint serum ( FBS) (HyClone, Logan, UT, USA) og 1% antibiotika (100 U /ml penicillin og 100 lg /ml streptomycin). Primære normale cervikale epitelceller (NC) blev isoleret fra noncancerous epitelvæv cervix uteri og blev dyrket i komplet KeratinocyteSFM medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Til brug for klinisk materiale til forskningsformål, blev tidligere skriftlige informerede samtykke opnået fra patienter og godkendelse blev opnået fra Sun Yat-sen University Cancer Center Institutional Research etiske komité.

Prøver og kliniske karakteristika

Alle patienter gav informeret skriftligt samtykke til analyse af deres væv til til forskningsformål, og undersøgelsen blev godkendt af Sun Yat-sen University Cancer center Institutional Review Board. I alt 193 paraffinembedded livmoderhalskræft prøver blev opnået fra Institut for Patologi på Sun Yat-sen University Cancer Center mellem 2007 og 2009. Tumor iscenesættelse og klinisk-patologisk klassifikation blev udført i overensstemmelse med Den Internationale Sammenslutning for Obstetrik og Gynækologi, 2009 (FIGO) klassifikation af carcinoma i livmoderhalsen. De 193 patienter var i IB1-IIA2 fase livmoderhalskræft og alle modtaget en radikal hysterektomi og lymphadenectomy uden præoperativ strålebehandling, kemoterapi eller hormonbehandling. I vores undersøgelse, Patienter med nogen af ​​høj risikofaktorer modtog postoperativ kemoterapi og /eller strålebehandling. I detaljer, “høj risiko” faktorer inkluderet PLNM, høj differentiering kvalitet, positiv parametrial engagement, positive lymphovascular plads engagement, positiv kirurgisk margen, dyb stromale invasion og stor tumorstørrelse ( 4 cm). Desuden patienter med kun dyb stromale invasion eller positive kirurgiske margener modtaget strålebehandling. Patienter med kun lymphovascular plads involvering, høj differentiering kvalitet, eller stor tumorstørrelse ( 4 cm) modtog kemoterapi. Klinisk-patologisk data blev indsamlet fra utålmodige journaler og sammenfattet i tabel 1. Alle patienter havde opfølgende poster for mere end 5 år og fristen opfølgning blev januar 2014. Overlevelse tid blev regnet fra datoen for kirurgi til føl- up deadline, eller datoen for død (som regel resultat af kræft tilbagefald eller metastaser). Den mediane follow-up tid til den primære livmoderhalskræft kohorte var 51 måneder, med en opfølgning tidsinterval på 3 til 99 måneder. Den præoperative HPV teste vores hospital anvendt til at undersøge infektion status patienter var polymerasekædereaktion detektion af HPV. I denne kohorte, viste 153 livmoderhalskræft patienter HPV-infektion (+), mens 40 livmoderhalskræft patienter var HPV-infektion (-). Seksten friske livmoderhalskræft og parrede tilstødende noncancerous cervikale væv (ANT) blev indsamlet til real-time PCR, Western blotting og immunhistokemi (IHC) analyse.

qPCR

Totalt cellulært RNA blev isoleret fra dyrkede celler og seksten frisk livmoderhalskræft og parrede tilstødende noncancerous cervikale vævsprøver under anvendelse af TRIzol Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) som fabrikanten instrueret. Disse RNA-prøver blev forbehandlet med RNase-fri DNase, og 2 ug RNA fra hver prøve blev anvendt til komplementær deoxyribonukleinsyre (cDNA) syntese priming med vilkårlige hexamerer. Primerne blev designet af Primer Express v 2.0 software (Applied Biosystems). Følgende primere blev anvendt: B3GNT3, 5′-GCCGGAGATACTTCATCCTG-3 ‘og 5′-GAGAGGAGCAGGTAGAGGGG-3′; glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) -gen, 5’-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3 ‘og 5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’. Påvisningsreagenset anvendt i dette eksperiment var SYBR Green. Samlet volumen af ​​hver prøve var 10 ul: 2 * SYBR Green mix: 5 pi; cDNA: 1UL; Forward primer: 0.5ul; Revers primer 0.5ul; ddH2O 3UL. Til PCR-amplifikation af B3GNT3 cDNA, en indledende amplificering under anvendelse B3GNT3-specifikke primere blev udført med en denatureringstrin ved 95 ° C i 10 min efterfulgt af 30 denatureringscykler ved 95 ° C i 60 s, primerannealing ved 55 ° C i 30 s, og primerforlængelse ved 72 ° C i 30 s. Efter afslutningen af ​​cykling trin, en endelig ekstension ved 72 ° C i 5 min blev gjort før reaktionsblandingen blev opbevaret ved 4 ° C. Real-time PCR blev derefter anvendt til at bestemme fold forøgelse af B3GNT3 mRNA i cervikale cancercellelinier forhold til normale cervikale epitelceller og i hver af de primære cervikale tumorer i forhold til det tilstødende normale væv taget fra den samme patient. Hvert eksperiment blev udført tre gange og gentages mindst tre gange. MRNA ekspression af B3GNT3 blev normaliseret til GAPDH.

Western blotting

Totalt protein blev fremstillet under anvendelse af celle-total protein udvinding kits ifølge producentens anvisninger (Millipore, Bedford, MA). Lige mængder af hver proteinekstrakt (30 ug) blev elektroforetisk separeret på 9,5% SDS polyacrylamidgeler. Efter overførsel til polyvinylidenfluorid (PVDF) membraner (Immobilon P, Millipore, Bedford, MA) blev membranerne blokeret i 1 time ved stuetemperatur med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween-20 (TBST) . Membranerne blev derefter inkuberet med anti-B3GNT3 antistof (1: 1000, Proteintech, 18.098-1-AP) natten over ved 4 ° C. Peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin-IgG-antistof (1: 2000, Santa Cruz, SC-2004) blev anvendt til bestemmelse B3GNT3 ekspression. Endelig blev B3GNT3 ekspression påvises under anvendelse af ECL prime Western blotting påvisningsreagens (Amersham) ifølge producentens instruktioner. Blottet membraner blev strippet og igen probet med et anti-alfa-tubulin-antistof (Sigma, St. Louis, MO) som en loading kontrol.

immunhistokemisk (IHC) analyse

Immunhistokemisk farvning blev udført ud til at vurdere protein ekspressionsmønsteret for B3GNT3 i 193 paraffinindlejrede humane cervikale cancervæv. Procedurerne blev udført med klassiske protokoller. Kort fortalt blev paraffinindlejrede vævsblokke fra cervikale kræftpatienter skåret i 4-um-tykke snit og bagt ved 65 ° i 30 min. Snittene blev afparaffiniseret med xylen og derefter rehydratiseret i vandet. Glassene blev nedsænket i EDTA antigen hentning buffer og derefter microwaving blev behandlet for antigen hentning. Dernæst blev endogen peroxidaseaktivitet blokeret med 3% hydrogenperoxid i 15 minutter, efterfulgt af inkubation med 1% bovint serumalbumin for at blokere uspecifik binding. Eksemplarerne blev inkuberet natten over ved 4 ° C med et kanin polyklonalt antistof mod B3GNT3 (Upstate Biotechnology, 1: 100, Proteintech, 18.098-1-AP). For negative kontroller blev den anti-B3GNT3 antistof erstattet med normalt gedeserum. Efter vask med PBST blev væv objektglassene successivt inkuberet med et biotinyleret anti-kanin sekundært antistof (Sigma) ved stuetemperatur i 30 minutter, efterfulgt af yderligere inkubation med streptavidin-peberrodsperoxidase-kompleks (Sigma) ved stuetemperatur i 30 min. De vævssnit blev nedsænket i 3-amino-9- ethyl carbazol og kontrastfarvet med 10% Mayers hæmatoxylin, dehydreret og monteret i Crystal Mount.

Evalueringen af ​​graden af ​​immunfarvning blev revideret og scorede uafhængigt af to patologer blindet for de histopatologiske træk og patientdata af prøverne. For semikvantitativ analyse, var stillingen af ​​hver vævsprøve baseret på både andelen af ​​positivt farvede tumorceller og intensiteten af ​​farvning. Immunofarvningen resultater for B3GNT3 blev bedømt på grundlag af følgende kriterier: (i) andelen af ​​positive tumorceller i tumorvævet: 0 (0%), 1 (1% -10%), 2 (11% -50%) , 3 (51% -75%) og 4 (76% -100%); (Ii) farvningsintensitet: 0 (ingen farvning), 1 (svag farvning = lysegul), 2 (moderat farvning = gul brun), 3 (kraftig farvning = brun). Farvningen indeks blev beregnet som produktet af andelen af ​​positive celler × farvningsintensiteten score (mellem 0 og 12). Cutoff værdier for B3GNT3 udtryk blev valgt på grundlag af en måling af heterogenitet med log-rank test statistisk analyse med hensyn til den samlede overlevelse. En optimal cutoff værdi blev identificeret som følger:. Farvningen indeksscore of≥ 6 blev betragtet som tumorer med høj B3GNT3 udtryk og ≤4 blev betragtet som tumorer med lav udtryk for B3GNT3

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af SPSS 16.0 statistisk programpakke (SPSS, Chicago, USA). Chi-square test og Fishers eksakte test blev anvendt til at vurdere forholdet mellem B3GNT3 udtryk og klinisk-patologiske karakteristika. Bivariate korrelationer mellem variable blev beregnet ved Spearman rang korrelationskoefficienter. Overlevelseskurver blev afbildet ved Kaplan-Meier-metoden, og forskelle blev analyseret under anvendelse af log-rank test. En Cox regression Cox proportional hazards model blev brugt til univariate og multivariate analyser for at bestemme den uafhængige betydning af relevante kliniske kovariater. Værdier på

P 0

.

05

i alle tilfælde blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Forhøjet udtryk for B3GNT3 i livmoderhalskræft cellelinjer

Real- time PCR og western blotting blev brugt til at undersøge niveauet af B3GNT3 udtryk i otte livmoderhalskræft cellelinier (HeLa, HeLa 229, HCC 94, C33A, CaSki, MS751, ME-180 og SiHa) sammenlignet med en normal cervikal epitel celle linje (NC ).

Western blotting-analyse viste, at alle otte livmoderhalskræft cellelinier (MS751, C33A, Hela, HeLa229, SiHa, HCC94, CaSki, og ME-180) udviste signifikant højere niveauer af B3GNT3 protein sammenlignet med NC ( fig 1A).

B3GNT3

mRNA-ekspression var mindst 3,5 gange større i de livmoderhalskræft cellelinjer sammenlignet med NC (Fig 1B). Disse resultater viste, at B3GNT3 er opreguleret i livmoderhalskræft cellelinjer.

(a og b) Angivelse af B3GNT3 mRNA og protein i livmoderhalskræft cellelinier (C33A, Ca Ski, HeLa, HeLa 229, MS751, Me- 180, blev SiHa og HCC 94) og normale cervikale cellelinier undersøgt ved western blotting (a) og kvantitativ real-time PCR (qPCR) (b). Ekspressionsniveauerne blev normaliseret mod α-tubulin og GAPDH hhv. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen af ​​middelværdien (SD), beregnet i tre parallelle forsøg. * P 0.05.

B3GNT3 er overudtrykt i livmoderhalskræft væv

Efter at om B3GNT3 opregulering findes i livmoderhalskræft cellelinjer var klinisk relevant blev bekræftet af kvantitativ real-time PCR (qPCR ) og western blotting analyse i 10 livmoderhalskræft væv (T) matchede med tilstødende noncancerous vævsprøver (ANT). Som vist i fig 2B, ekspressionen af ​​

B3GNT3

mRNA var dramatisk højere i de 10 livmoderhalskræft vævsprøver end i de parrede normale væv, med den differentielle ekspression niveau i området fra 4.2- til 17,4 gange. I overensstemmelse med disse resultater viste B3GNT3 protein højere overflod i alle 10 livmoderhalskræft prøver sammenlignet med den matchede ANT (Fig 2A).

(a) Repræsentative billeder af western blotting analyser af B3GNT3 proteinekspression i ti matchede par af livmoderhalskræft væv (T) og tilstødende noncancerous væv (ANT). a-tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. (B) Den gennemsnitlige T /ANT forhold mellem

B3GNT3

mRNA ekspression i parrede livmoderhalskræft (T) og tilstødende noncancerous væv (ANT) blev kvantificeret ved kvantitativ real-time PCR (qPCR) og normaliseret mod GAPDH. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen af ​​middelværdien (SD), beregnet i tre parallelle forsøg. (C) Immunohistokemisk analyse af B3GNT3 proteinekspression i ti par matchede livmoderhalskræft væv. * P 0.05.

associering mellem B3GNT3 overekspression og kliniske træk ved livmoderhalskræft

Immunhistokemi (IHC) blev udført for at undersøge udtrykket mønster af B3GNT3 protein i en retrospektiv kohorte af 193 tilfælde af livmoderhalskræft , herunder 85 tilfælde af scenen IB1 (44,1%), 29 tilfælde af scenen IB2 (15,0%), 56 tilfælde af scenen IIA1 (29,0%) og 23 tilfælde af scenen IIA2 (11,9%). Som vist i fig 3A, blev immunoreaktiviteten af ​​B3GNT3 protein påvist på forskelligt niveau og lokaliseret hovedsageligt i cellulære plasma. Positiv farvning for B3GNT3 protein blev set i 78 tilfælde (40,4%) af de 193 tilmeldte patientprøver, mens 115 sager (59,6%) farves negativt eller kun svagt for B3GNT3 protein (tabel 1). Intens udtryk for B3GNT3 protein blev bemærket i 24,7% (21/85), 41,4% (12/29), 58,9% (33/56), og 52,2% (12/23) af livmoderhalskræft af FIGO stadie Ib1, Ib2, IIa1and IIa2 henholdsvis (

P

0,05, χ

2 test). Interessant nok afslørede kvantitative ICH farvede data, at de gennemsnitlige optiske densitet (MOD) værdier af B3GNT3 farvning i lymfeknudemetastase gruppe var statistisk højere end i lymfeknudemetastase-fri gruppe (P 0,001, figur 3B).

Positiv B3GNT3 farvning blev observeret hovedsagelig i cytoplasmaet af cervikale cancerceller. (A) a og b, blev B3GNT3 ekspression ikke påvist i normale cervikale væv; c og d, repræsentative billeder af svag B3GNT3 farvning i livmoderhalskræft væv; e og f, repræsentative billeder af moderat B3GNT3 farvning i livmoderhalskræft væv; g og h, repræsentative billeder af stærk B3GNT3 farvning i livmoderhalskræft væv. (B) De statistiske analyser af den gennemsnitlige middelværdi optiske densitet (MOD) af B3GNT3 farvning i lymfeknude metastaser gruppen og lymfeknudemetastase-fri gruppe. * P 0,05. (C) Kaplan-Meier kurver af univariate analysedata (log-rank test) .Den samlede overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) for patienterne med høj versus lav B3GNT3 udtryk.

IHC farvning af B3GNT3 protein ekspressionsniveauerne blev analyseret yderligere for at bestemme deres forhold til de klinisk-patologiske karakteristika livmoderhalskræft. Som opsummeret i tabel 2, høj B3GNT3 proteinekspression tendens til at være stærkt korreleret med HPV-infektion, FIGO stadium, tumorstørrelse, tumortilbagevenden, vital status, samtidig med kemoterapi og strålebehandling, lymphovascular plads involvering og vigtigst, lymfeknudemetastase (tabel 2) . Disse data blev yderligere bekræftet af Spearmans korrelationsanalyse (tabel 3). Der blev imidlertid ikke signifikante relationer findes mellem B3GNT3 proteinekspression og patientens alder, histologisk differentiering kvalitet, planocellulært karcinom antigen, histologisk type, kemoterapi, strålebehandling, myometrium invasion, egenskaber af den kirurgiske margin og infiltration af parauterine orgel i patienter med livmoderhalskræft .

høj B3GNT3 udtryk forudsiger dårlig prognose for patienter med tidlige fase livmoderhalskræft

i vores undersøgelse kohorte, den prognostiske betydning af B3GNT3 proteinekspression i livmoderhalskræft blev udforsket hjælp Kaplan-Meier-analyse og log-rank test. Af log-rank test viste, at overlevelse var signifikant forskellig mellem de lave og høje B3GNT3 proteinekspressionssystemer grupper (begge P 0.001, fig 3C). Patienter med høj B3GNT3 niveauer havde en signifikant kortere samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) end dem med lave niveauer. De kumulative OS og DFS satser var 90,5% og 97,2%, henholdsvis i den lave B3GNT3 gruppen, mens de var kun 65,7% og 84,7%, henholdsvis i den høje B3GNT3 gruppen. En validering kohorte blev ansat til yderligere at evaluere prognostiske værdi af B3GNT3 for specifikke undergrupper af patienter, som blev stratificeret efter alder, HPV-infektion, FIGO Stage, PLNM, planocellulært karcinom antigen, tumorstørrelse, differentiering kvalitet, kemoterapi, strålebehandling, samtidig kemoterapi og strålebehandling, myometrium invasion, egenskaber af kirurgiske margin, infiltration af parauterine organ- og lymphovascular plads engagement. Ekspressionen af ​​B3GNT3 protein blev stærkt forbundet med OS varighed patienter uden PLNM (log-rank test, P 0,001), med pladecellecarcinom antigen ≥ 1,5 ng /ml (log-rank test, p = 0,002), med HPV-infektion (log-rank test, P = 0,001), med dyb stromale invasion (log-rank test, P = 0,028), med klinisk udvikling (fase Ib1-Ib2, log-rank test, P = 0,004; Stage IIa1-IIa2 , log-rank test, P = 0,040), med histologisk differentiering bedømmelse (grad 1-2, log-rank test, P 0,001; Grade 2-3, log-rank test, P = 0,001), og med kemoterapi ( log-rank test, P = 0,004) (figur 4). Univariate Cox regressionsanalyser viste, at på et højere niveau af B3GNT3, PLNM, planocellulært karcinom antigen, lymphovascular plads engagement og tilbagefald forudser en dårlig prognose for debuterende livmoderhalskræft patienter (tabel 4). Derefter multivariat analyse under anvendelse af Cox proportional hazard model for alle variabler, der var signifikant i univariate analyse afslørede, at B3GNT3 ekspression, PLNM og fornyet tjente som uafhængige prognostiske faktorer for patienter med cervikal cancer (tabel 4). Således er vores resultater viste, at B3GNT3 protein kan udgøre en potentiel prognostisk indikator for debuterende livmoderhalskræft kræftpatienter.

(a) Den samlede overlevelse (OS) af patienterne uden lymfeknude metastaser med høj versus lav B3GNT3 udtryk . (B) OS til patienter med pladecellecarcinom antigen 1.5ng /ml med høj versus lav B3GNT3 ekspression. (C) OS til patienter med HPV-infektion med høj versus lav B3GNT3 ekspression. (D) OS til patienter med dybe stromal invasion med høj versus lav B3GNT3 ekspression. (E) OS til patienterne på etaper Ib1-Ib2 med høj versus lav B3GNT3 udtryk. (F) OS til patienterne på etaper IIa1-IIa2 med høj versus lav B3GNT3 udtryk. (G) OS for patienterne ved differentiering 1-2 med høj versus lav B3GNT3 udtryk. (H) OS for patienterne ved differentiering 2-3 med høj versus lav B3GNT3 ekspression. (I) OS for patienterne med høj versus lav B3GNT3 udtryk som modtog kemoterapi.

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, viste vi, for første gang, at ekspressionen af ​​B3GNT3 protein opreguleres i livmoderhalskræft og korrelerer med kliniske karakteristika, især PLNM af patienter med tidlige fase livmoderhalskræft. Desuden høj B3GNT3 proteinekspression reduceret OS og DFS af disse patienter, især dem, der fik kemoterapi. Multivariat analyse afslørede, at B3GNT3 ekspression kan være en uafhængig prognostisk indikator for overlevelse i cervikale cancerpatienter.

B3GNT3 er involveret i biosyntesen af ​​poly-N-acetyllactosamin kæder og biosyntesen af ​​rygraden struktur dimer sialyl Lewis A . De væsentlige roller B3GNT3 i tumorigenese er blevet afsløret for nylig [10, 19, 20, 21]. Shiraishi [19] viste, at B3GNT3 blev højt udtrykt i coloncancercellelinie Colo205. De rapporterede, at humane coloncancer væv og den coloncancercellelinie Colo205 indeholder cancerassocierede glycosphingolipider med dimere Lewis A antigener (Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAcβ1-3Galβ1-3 (Fucα1-4) GlcNAc) og B3GNT3 sandsynligvis være den mest sandsynlige kandidat involveret i biosyntesen af ​​rygraden struktur dimer sialyl Lewis A (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-3GlcNAc). Cerhan [10] fandt, at B3GNT3 er relateret til immunfunktion og inflammation, og spiller en vigtig rolle i lymfocyttrafik og migration, som fører til tumorcelleoverlevelse og metastase i NHL. En anden undersøgelse viste, at

B3GNT3

locus er associeret med CA19-9 niveauer i bugspytkirtelkræft [21]. B3GNT3 er en β-1, 3-N-acetylglucosmaniyltransferase involveret i produktionen af ​​rygraden struktur dimer sialyl Lewis A, som er carbonhydratet antigene epitop af CA19-9. Derfor kan dette være potentiel mekanisme ligger til grund for sammenhængen mellem varianter i

B3GNT3

locus og CA19-9 koncentrationer. Deres undersøgelse [21] foreslog, at B3GNT3 spiller en onkogen rolle i visse typer cancer. Men Ho [20] rapporterede, at B3GNT3 kan spille en kritisk rolle i at undertrykke de maligne egenskaber af neuroblastomer og dens ændret ekspression kan bidrage til patogenesen af ​​neuroblastom. Det er almindeligt, at visse gener har onkogene roller i flere kræftformer, men har anti-onkogene roller i andre typer af cancere. For eksempel er PTK6 overudtrykt i invasiv duktal brystcarcinoma, serøs ovariecarcinom, ikke-småcellet lungekræft, coloncarcinom og hoved og hals kræft [22-26]. I modsætning hertil kan PTK6 være en vigtig tumorsuppressor i forskellige humane cancere, såsom human larynx pladecellecarcinom og esophageal pladecellecarcinom [27, 28]. Desuden rolle B3GNT3in cervical carcinoma er uklar. Derfor har vi vurderet, om B3GNT3 opreguleres i livmoderhalskræft og klinisk forbundet med udviklingen og progressionen af ​​livmoderhalskræft. I vores undersøgelse, vi rapporterede, at B3GNT3 mRNA og protein blev overudtrykt i cervikale cancercellelinier og livmoderhalskræft prøver (faser Ib-Ha). Et kommercielt tilgængeligt antistof mod B3GNT3 blev anvendt i immunhistokemi. IHC-farvning viste negativt eller kun svagt i normal cervikal væv. Blev dog positiv farvning for B3GNT3 protein set i livmoderhalskræft prøver. Desuden vores resultater af Realtime-PCR, Western blotting og IHC var konsekvent. Derfor er denne polyklonale antistof genkender specifikt kun B3GNT3 i livmoderhalskræft væv. Endvidere fandt vi, at B3GNT3 ekspression korrelerer med kliniske karakteristika for patienter med tidlig-fase livmoderhalskræft såsom HPV-infektion, FIGO stadium, tumorstørrelse, tumortilbagevenden, vital status, samtidig med kemoterapi og strålebehandling, lymphovascular plads involvering og vigtigst, lymfeknude metastase.