PLoS ONE: MIR-196a Fremmer kræft i bugspytkirtlen Progression ved Målretning Nuclear Factor Kappa-B-Inhibitor Alpha

Abstrakt

afvigende ekspression af miR-196a er blevet hyppigt rapporteret i forskellige kræftformer, herunder kræft i bugspytkirtlen. Men dens funktion i bugspytkirtelkræft er ikke fuldt belyst. Her undersøgte vi ekspressionsmønster og den biologiske rolle af MIR-196a i bugspytkirtelkræft cellelinier, såvel som dets interaktion med en metastase-relaterede gen, nuklear faktor-kappa-B-inhibitor alpha (NFKBIA). Vi viste, at miR-196a blev opreguleret i humane bugspytkirtelkræft cellelinjer sammenlignet med immortaliserede bugspytkirtlen duktale epitelceller ved hjælp af microRNA microarray og QRT-PCR. Desuden nedregulering af miR-196a i PANC-1 undertrykte sin proliferation og migration med en stigning i G

0 /G

1 overgang og faldt udtryk for cyclin D1 og CDK4 /6. I mellemtiden, en øget ekspression i E-cadherin og reduceret ekspression i N-cadherin og vimentin blev også observeret. Vi identificerede en roman miR-196a mål, NFKBIA og nedregulering af miR-196a forbedret udtryk for NFKBIA protein. Luciferase assay bekræftede, at NFKBIA var en direkte og konkret mål for miR-196a. Silencing NFKBIA i PANC-1 celler styrket sin proliferation og migration. Tilsammen vores resultater viser, at miR-196a er stærkt udtrykt i bugspytkirtelkræft cellelinier, og kan spille en afgørende rolle i bugspytkirtelkræft proliferation og migration, eventuelt gennem sin nedstrøms mål, NFKBIA. Således kan miR-196a tjene som et potentielt terapeutisk mål for kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Huang F, Tang J, Zhuang X, Zhuang Y, Cheng W, Chen W, et al. (2014) MIR-196a Fremmer kræft i bugspytkirtlen Progression ved Målretning Nuclear Factor Kappa-B-hæmmer Alpha. PLoS ONE 9 (2): e87897. doi: 10,1371 /journal.pone.0087897

Redaktør: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: August 9, 2013; Accepteret: 3 januar 2014; Publiceret: 4 februar 2014

Copyright: © 2014 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (30973505), Videnskab og Teknologi Foundation i Guangdong provinsen (2009B030801005), Fonden for Guangzhou Videnskab og Teknologi Bureau (2009Y-C011-1) og Stiftelsen for Ministeriet for Uddannelse i Kina (20120171110075) til H. Yao. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er en aggressiv malignitet med en af ​​de værste resultater blandt alle kræftformer. For alle faser tilsammen, den 5-årige relative overlevelse er kun 5% [1]. Den høje dødelighed af kræft i bugspytkirtlen kan til dels skyldes muligheden af ​​bugspytkirtelkræftceller at erhverve invasive egenskaber under de tidlige stadier af carcinogenese. Det er således sandsynligt, at selv i den fase af en tilsyneladende lokaliseret sygdom, kan mikrometastaser være allerede er til stede i fjerne organsteder [2]. Konventionel kemoterapi er sjældent kurativ for metastatisk kræft i bugspytkirtlen. Behandling strategier, der specifikt er målrettet mod og forebygge metastaser kunne derfor har potentiale til markant at forbedre prognosen for denne triste sygdom.

Nylige undersøgelser har vist, at microRNA (miRNA) spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​forskellige biologiske og patologiske processer, herunder metastase [3]. Disse små, ikke-kodende molekyler udøver deres regulerende virkninger ved binding til den 3 ‘utranslaterede region af mål-mRNA, hvilket medfører enten nedbrydning af mRNA eller inhibering af deres oversættelse til funktionelle proteiner. Udtrykket af miRNA er blevet anerkendt som integrerede komponenter i mange normale biologiske processer, der involverer celledeling, differentiering, apoptose, og stress modstand [4]. Endnu vigtigere er det for nylig blevet foreslået, at aberrerende opregulering eller nedregulering af specifikke miRNA og deres mål i forskellige former for kræft er forbundet med udviklingen og progressionen af ​​cancer [5]. Den afvigende ekspression af nogle miRNA har vist sig at være involveret i bugspytkirtelkræft carcinogenese [6], [7]. Endvidere har vist sig MIR-196a, der skal overudtrykkes i bugspytkirtelkræft, og signifikant korreleret med dårlig overlevelsesrate [8]. Men mekanismen for dens funktion i bugspytkirtelkræft fortsat uklar.

nukleare faktor KB (NF-KB) spiller en væsentlig rolle i reguleringen af ​​immunresponset [9] og inflammation [10]. Det består af en familie af transkriptionsfaktorer involveret i reguleringen af ​​en bred vifte af biologisk proces, og voksende beviser demonstrerede sit engagement i tumorigenese [11] – [14]. Det er blevet impliceret i mange kendetegnende for kræft udviklingen og progressionen, herunder vækstfaktor-uafhængig proliferation [15], inhibering af apoptose [16], og væv invasion og metastase [17]. Også nye beviser indebærer, at NF-KB-aktivering spiller en vigtig rolle i progressionen af ​​pancreascancer [11], [18] – [20]. Inhibering af NF-KB sensibiliserer humane pankreatiske cancerceller til apoptose [21]. NFKBIA, også kendt som kBa, er en af ​​de familiemedlemmer cellulære proteiner, der hæmmer NF-KB transskription faktor. NFKBIA hæmmer NF-KB ved at skjule de nukleare lokalisering signaler (NLS) af NF-KB-protein og holde det afsondret i en inaktiv tilstand i cytoplasmaet [22]. Desuden at NFKBIA blokerer evnen af ​​NF-KB binder til DNA, som er væsentlig for funktionen af ​​NF-KB [23]. Det har vist sig, at der er en berigelse af specifikke enkelt-nukleotid polymorfier og haplotyper af NFKBIA i Hodgkins lymfom, kolorektal cancer og myelomatose, tyder på, at NFKBIA kunne være en tumor suppressor [24] – [26].

i denne undersøgelse, viser vi, at miR-196a er overudtrykt i bugspytkirtelkræft cellelinjer og har undersøgt effekten af ​​nedregulering af miR-196a på en bugspytkirtelkræft cellelinje, PANC-1. Vi har belyst, at NFKBIA er et mål for miR196a, og miR-196a spiller en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​bugspytkirtelkræft sandsynligvis ved at målrette NFKBIA.

Materialer og metoder

Cellelinjer

Fire humane bugspytkirtelkræft cellelinjer Panc-1, Capan-2, BxPC-3 og SW1990 blev købt fra Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Folkerepublikken Kina), og en udødeliggjort bugspytkirtlen ductal epitelial cellelinje H6C7 var venligt billede af Prof. Ming-lyd Tsao (Ontario Cancer Institute, Toronto University, Canada), og blev inkuberet i denne undersøgelse som tidligere rapporteret [27]. Fire humane pancreas cancer cellelinjer (Chinese Academy of Sciences, Shanghai, PR China) blev dyrket i DMEM (Gibco, Grand Island, NY) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, HyClone, Logan, UT), 100 forener /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin. H6C7, opnået fra Prof.Ming-lyd Tsao Ontario Cancer Institute (Ontario, Canada), blev dyrket ved 37 ° C i keratinocyt serumfrit medium (K-SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) indeholdende 100 U /ml penicillin, 100 U /ml streptomycin, 0,2 ng /ml rekombinant endotelvækstfaktor (rEGF) og 20 ng /ml oksehypofyseekstrakt (BPE). I alle eksperimenter blev celler holdt ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 luftatmosfære.

GeneChip Microarray af miRNA Salg

miRNA genekspressionsprofil af fire humane pancreascancer cellelinier og H6C7 blev bestemt ved GeneChip microarray analyse (Affymetrix, Santa Clare, CA, USA). Syntese af cDNA, hybridisering til chips, og vaske blev udført ifølge producentens protokol. GeneChips blev scannet på 3 mm tæthed med en GeneArray Scanner (Affymetrix). Billeder blev inspiceret for at sikre, at alle chips havde lav baggrund men lyse hybridiseringssignaler. Mean fluorescenssignal intensitet for hver probe var kvartil normaliseret. Gennemsnittet af tre middelværdier signaler for hver miRNA probe blev normaliseret til det for en ekstra kontrol oligonukleotid og var log

2 transformeret. Hver miRNA probe blev vurderet for ekspression baseret på en Wilcoxon Rank-Sum test af miRNA probe sæt signaler i forhold til fordelingen af ​​signaler fra baggrunden. Den studerendes

t

-test blev anvendt til at bestemme signifikante forskelle i miRNA udtryk mellem human bugspytkirtelkræft cellelinje og udødeliggjort bugspytkirtlen ductal epitelial cellelinje H6C7, hvor

P

0,05 blev fortolket som signifikant.

Kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR)

for at analysere ekspressionen af ​​miR-196a, blev QRT-PCR udført i fire humane bugspytkirtelkræft cellelinjer (PANC- 1, Capan-2, BxPC-3 og SW1990) og en udødeliggjort pancreatisk ductal epitelcellelinie H6C7. Kort beskrevet blev totalt RNA ekstraheret fra cellerne under anvendelse af TRIZOL (Invitrogen, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. U6 blev valideret som normalizer. Totalt RNA blev omvendt transkriberet under anvendelse af den tilsvarende RT Primer og TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR-primeren for moden MIR-196a blev designet som følger: MIR-196a sense, 5′-GCT CTG GCT CCG TGT CTT CAC TCC C-3 ‘, reverse, 5’-TGC CCC AGC ACA GCC CCC GTC CCT C-3 ‘. Udtrykket af miR-196a og dens kontrol U6 blev påvist ved anvendelse TaqMan miRNA analysesystem (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Transfektion af Panc-1 celler

To par syntetisk, kemisk modificerede korte enkelt- eller dobbelt-strenget RNA-oligonukleotider: anti-miR-196a og dens passende negativ kontrol (anti-miR-NC), blev miR-196a micmics og dens passende negativ kontrol (miR-NC) købt fra GenePharma (Shanghai, Folkerepublikken Kina). NFKBIA-siRNA (si-NFKBIA) og dens relevante negativ kontrol (si-NC) blev købt fra GeneChem (Shanghai, P. R. Kina). Transfektion blev udført ved lipofectamin 2000-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Til transfektion, 2 × 10

5 PANC-1-celler blev podet i hver brønd i en 6-brønds plade og inkuberet natten over. Ekspressionsniveauerne blev kvantificeret 24 timer efter transfektion.

Celleproliferationsassay

Celleproliferation blev påvist ved WST-8-metoden. Anti-MIR-196atransfected PANC-1-celler og anti-MIR-NCtransfected PANC-1-celler blev høstet og dissocieret til enkeltcelle-suspension, 1,2 x 10

3-celler blev podet i 96-brønds plade per brønd. Også si-NFKBIA transficerede PANC-1 celler, si-NC transficerede PANC-1 celler, si-NFKBIA + anti-miR-196a transficerede PANC-1 celler og si-NC + anti-NC PANC-1-celler blev høstet og dissocieret i enkelt cellesuspension blev 2 × 10

3-celler podet i 96-brønds plade per brønd. Celleproliferation blev undersøgt på forskellige tidspunkter (24, 48 h, 72 h). WST-8 reagens (10 pi per brønd) fra Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) blev tilsat, inkuberet i 4 timer, og absorbansen blev bestemt med et flere brønde spektrofotometer (BioTek, VT, USA) ved 450 nm og 630 nm.

cellemigrationsassay

Cell migration assay blev udført ved anvendelse af Transwell kammer (Corning, New York, USA) med en porestørrelse på 8,0 um. 72 timer efter transfektion total 10

5-celler blev resuspenderet i serumfrit medium og podes i det øvre rum af kammeret. Det nedre rum blev fyldt med fuld dyrkningsmedier indeholdende 10% FBS. Efter at være blevet inkuberet ved 37 ° C i 8 timer, blev kammeret fast, 0,1% krystalviolet-farves og tælles.

Flowcytometrianalyse

At påvise effekten af ​​nedregulering af miR -196a på cellecyklus og apoptose, flowcytometri analyse blev udført. For cellecyklusanalyse blev anti-MIR-196a-transficerede Panc-1cells høstet på forskellige tidspunkter (24 timer, 48 timer, 72 h) efter transfektion, og blev trypsinbehandlet og fikseret med iskold 70% ethanol i 18 timer ved 4 ° C. De fikserede celler blev farvet med 50 mg /ml propidiumiodid (BD Pharmingen, San Diego, CA) og 50 mg /ml RNase og derefter analyseret ved anvendelse af et flowcytometer (BD Pharmingen, San Diego, CA). For apoptose analyse blev anti-MIR-196a-transficerede Panc-1cells også høstet på forskellige tidspunkter (24 timer, 48 timer, 72 h) efter transfektion, farvet med FITC-Annexin V og propidiumiodid (PI) og derefter analyseret ved anvendelse af en flowcytometer (BD Pharmingen, San Diego, CA). Anti-miR-NC-transficeret Panc-1cells blev udført som kontrol.

Immunofluorescensanalyse

For at undersøge fænotype ændringer i PANC-1 transficeret med anti-miR-196a, blev udført immunofluorescens analyse . Observation af morfologi Blank, anti-MIR-NC og anti-MIR-196a gruppe blev udført ved mikroskop. Ekspressionen af ​​E-cadherin og vimentin, markører for EMT, blev detekteret ved immunfluorescens på 3

rd dag efter transfektion. Cellerne blev vasket med PBS og fikseret i 4% paraform i 15 minutter på is. Efter yderligere to phosphatpufret opløsning (PBS) vask blev cellerne dækket med 0,5% Triton 100 i 15 minutter på is, derefter vasket med PBS og inkuberet med 5% fedtfri mælk i 1 time ved stuetemperatur for at blokere ikke-specifik binding af IgG. Cellerne blev inkuberet med primært antistof muse-anti-humant E-cadherin (Abcam, MA, USA) eller vimentin (Abcam) i 2 timer ved stuetemperatur, derefter vasket med PBS og inkuberet med fluorochrom-konjugeret sekundært antistof ved stuetemperatur i 30 min i et mørkt kammer. Cellerne blev vasket med PBS og dækket med DAPI at farve kerner. Vi tog tilfældige fotos i 200 ganges forstørrelse.

Western blot-analyse

Koncentrationen af ​​totalt protein ekstraheret fra Blank, anti-MIR-NC og anti-MIR-196a gruppe blev bestemt med et BCA Protein Assay kit (Pierce, USA). Lige store mængder protein blev separeret ved 10% SDS-PAGE og overført elektroforetisk til PVDF-membraner (Millipore, Bedford, MA, USA) under anvendelse af en mini-trans-blot. Muse-anti-humant cyklin D1 (Abcam), CDK4 (Abcam), CDK6 (Abcam), E-cadherin (Abcam), vimentin (Abcam), kanin-anti-human N-cadherin (Cell Signaling Technology, MA, USA), NFKBIA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), blev anvendt til at detektere ekspressionen af ​​homologe proteiner. GAPDH (Santa Cruz Biotechnology) blev anvendt som en intern kontrol. Elektrokemiluminescensen blev udført med et Chemilmager 5500 billeddannende system (San Leandro, CA, USA), ifølge producentens anvisninger.

3’UTR luciferase reporter assay

Den humane NFKBIA 3’UTR luciferase reporter konstruere (NFKBIA-3’UTR WT) blev genereret ved kloning NFKBIA mRNA 3’UTR sekvens i nedstrøms pMIR-rapport konstruktion (jord, Guangzhou, PR Kina). MIR-196a target site-mutation NFKBIA 3’UTR luciferase reporter (NFKBIA-3’UTR mutation) blev dannet ved at ansætte direkte-site mutagenese hjælp mutation primere, der muterer den miR-196a bindingssted fra ACTACCT til ATCGATC. PANC-1-celler blev co-transficeret med miR-196a plasmid og vildtype eller mutant NFKBIA 3’UTR luciferase reporter konstruere og luciferaseaktiviteter blev målt ved hjælp af Dual-Glo Luciferase. Data blev normaliseret ved at dividere Firefly luciferaseaktivitet med den af ​​Renilla luciferase.

Statistisk analyse

Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD), beregnes ved hjælp af SPSS software, Version 13.0. Midlerne blev derefter sammenlignet ved hjælp af en en-vejs ANOVA med LSD blandt grupper eller studerende

t

test mellem grupperne.

P

. 0,05 angivet statistisk signifikans

Resultater

MIR-196a er overudtrykt i bugspytkirtelkræft cellelinjer

For at udforske den rolle, miR- 196a i bugspytkirtlen udvikling af kræft, for det første vi undersøgte ekspressionen af ​​miR-196a i fire bugspytkirtelkræft cellelinier (Capan-2, BxPC-3, Panc-1 og SW1990) og foreviget bugspytkirtlen ductal epitelial cellelinje H6C7 af miRNA microarray og real tid RT-PCR. Den hierarkiske klynge afslørede, at miR-196a udtryk i bugspytkirtelkræft cellelinjer var langt højere end i H6C7 (figur 1A). I mellemtiden er den resultatet af real-time RT-PCR var i overensstemmelse med microarray. Ekspression af MIR-196a var (706,4 ± 9,4) fold i Panc-1-celler, (310.1 ± 7,5) fold i SW1990-celler, (7,6 ± 1,1) fold i BxPC-3-celler og (204,9 ± 4,8) -fold i Capan-2 celler, sammenlignet med H6C7 (

P

0,05) (Figur 1B). Det antydes, at miR-196a kan spille en rolle i udviklingen af ​​den menneskelige bugspytkirtelkræft.

(A) Hierarkisk klyngedannelse analyse af miRNA, der enten differentieret op- eller nedreguleret i bugspytkirtelkræft cellelinjer og H6C7. MiRNA, der scorede en differentieret værdi på 1 eller større blev kategoriseret som forskelligt opreguleres, og miRNA, der scorede en værdi på -1 eller mindre blev kategoriseret som forskelligt nedreguleret. Skalaen bar over bunden af ​​Heatmap skildrer SD ændring fra middelværdien. MIR-196a udtryk var signifikant højere i bugspytkirtelkræft cellelinier i microarray. (B) Validering af miR-196a ekspressionsniveauet i bugspytkirtelkræft cellelinier ved QRT-PCR. MIR-196a var signifikant opreguleret i bugspytkirtelkræft cellelinjer. Ekspression af MIR-196a var (706,4 ± 9,4) fold i Panc-1-celler, (310.1 ± 7,5) fold i SW1990-celler, (7,6 ± 1,1) fold i BxPC-3-celler og (204,9 ± 4,8) -fold i Capan-2-celler, sammenlignet med H6C7 (*,

P

0,05).

Effekt af miR-196a på proliferation og apoptose af PANC-1 celler

Som vist i figur 1, mIR-196a-ekspression var meget højere i pancreas cancercellelinier sammenlignet med den immortaliserede pancreas ductal epitelcellelinje, især i PANC-1. For yderligere at vurdere den biologiske rolle miR-196a i bugspytkirtelkræft, valgte vi PANC-1 for at følge forsøgene for sin høje ekspression af miR-196a og undersøgte effekten af ​​målrettet knockdown af miR-196a på celledeling og apoptose. Det blev afsløret, at anti-MIR-196a blev effektivt indføres i cellerne (figur 2A, 2B) og nedreguleres MIR-196a ekspressionsniveauet (figur 2C). WST-8 assay viste, at celleproliferationen blev væsentligt forringet i Panc-1 celler transficeret med anti-miR-196a på 72 timer sammenlignet med kontrolgruppen anti-miR-NC (

P

0,05) (Figur 2D), mens ændring af miR-196a udtryk havde ingen signifikant effekt på celleproliferation sammenlignet med kontrolgruppen anti-miR-NC 24 timer (

P

= 0,987) og 48 timer (

P

= 0,241).

(A) Transfektion af anti-mIR-196a og anti-mIR-NC i PANC-1. (B) Sammenligning af transfektion på mellem anti-MIR-196a og anti-MIR-NC i PANC-1. Transfektionen sats af anti-MIR-196a var (88,76 ± 2,25)%, medens transfektion hastigheden af ​​anti-MIR-NC var (91.09 ± 1,77)% (

P

0,05

).

LM

:. Lysmikroskop

Desuden vi afgøres, om cellecyklus eller apoptose vil bidrage til hæmning af spredning. Flow-cytometrisk analyse blev udført. Efter tavshed miR-196a af anti-miR-196a på 72 timer, procentdel af G

0 /G

1 blev signifikant øget sammenlignet med kontrolgruppen anti-miR-NC, (67,20 ± 3,12)% (anti- miR-196a) vs (56,07 ± 7,93)% (anti-miR-NC) (

P

0,05), mens der ikke var nogen statistisk signifikans i G

0 /G

1between anti -miR-196a gruppe og anti-miR-NC-gruppe på 24 timer (

P

= 0,825) og 48 h (

P

= 0,785) (Figur 3A, figur 3B). Desuden detekteres vi ekspressionen af ​​cyclin D1 og CDK4 /6-protein. Det var interessant, at faldet udtryk for cyklin D1 og CDK4 /6 blev observeret efter silencing MIR-196a (figur 3C). I mellemtiden var der ingen signifikant forskel på apoptose blandt Blank, MIR-NC og anti-MIR-196a gruppe i PANC-1-celler (figur 3D). Tilsammen viser resultaterne, at knockdown af miR-196a undertrykker celleproliferation, dels på grund af G

0 /G

1 anholdelse med cyclin D1 og CDK4 /6 udtryk faldet, men den er ikke forbundet med induktion af apoptose .

(A) repræsentant flowcytometrianalyse af cellecyklus i PANC-1 med og tilbagetrækning silencing mIR-196a ved 24 timer, 48 timer og 72 timer. (B) Sammenligning af cellecyklus blandt anti-miR-196a, anti-miR-NC og Blank. Procentdelen af ​​celler ved G

0 /G

1 fase ved 72 timer blev forøget fra (56.07 ± 7,93)% (anti-MIR-NC) til (67,20 ± 3,12)% (anti-MIR-196a) (*,

P

0,05), mens der ikke var nogen statistisk signifikans i G

0 /G

1between anti-miR-196a gruppe og anti-miR-NC-gruppe på 24 timer og 48 timer. (C) repræsentant western blot analyse viste nedregulering af cyclin D1 og CDK4 /6 ekspression efter suppression af MIR-196a i PANC-1-celler ved 72 timer. (D) Sammenligning af apoptose blandt anti-miR-196a, anti-miR-NC og Blank.

nedregulering af miR-196a undertrykker PANC-1 celle migration

For at undersøge, om miR-196a havde en effekt på lette bugspytkirtelkræft celle migration, vi udførte Transwell assay under anvendelse PANC-1 celler. PANC-1 cellen blev valgt på grund af overekspression af MIR-196a og efterligning af bugspytkirtelkræft biologi bedre end andre cellelinjer, især i cellemigrering analyse [28]. Transwell assay viste, at migration evne PANC-1-celler markant reduceret med nedregulering af MIR-196a, ca. 28% sammenlignet med kontrol (

P

0,05) (figur 4A, 4B). I mellemtiden har vi spekulerede på, om mesenchymale-epitelial overgang (MET) har bidraget til undertrykkelse af PANC-1 celle migration efter lyddæmpende miR-196a, vi først observeret morfologi PANC-1 før og efter transfektion med anti-miR-196a. Til vores interesse, cellens morfologi ændret sig markant efter transfektion. I tomme og anti-miR-NC-gruppe, nogle celler var delvist spindel form, hvorimod blev anti-miR-196a celler tæt bundet, polygon celler med en epitelial fænotype. I mellemtiden, vi har registreret MET markører (vimentin og E-cadherin) udtryk ved immunfluorescens. Forøget ekspression af E-cadherin blev observeret efter silencing MIR-196a, med ekspression af vimentin faldt (figur 4C). Endvidere undersøgte vi proteinekspression er forbundet med behandling. Påfaldende, med reduktionen af ​​PANC-1 cellemigration efter silencing MIR-196a, forøget ekspression af E-cadherin-protein blev observeret, samt nedsat ekspression af N-cadherin og vimentin (figur 4D). Disse resultater indikerer, at MIR-196a faktisk bidrager til vandrende fænotype af bugspytkirtelkræftceller, dels gennem MET.

(A) repræsentant transwell assay indikerede, at migration evne PANC-1-celler markant reduceret med down- regulering af miR-196a. (B) Sammenligning af transmembrane celler blandt anti-miR-196a, anti-miR-NC og Blank (*,

P

0,05). (C) Morfologiske ændringer og immunfluorescensfarvning af MET markører blandt anti-miR-196a, anti-miR-NC og blank. (D) repræsentant western blot analyse afslørede, at mesenchymale-epithelial overgang bidraget til suppression af PANC-1 cellemigration efter silencing MIR-196a. Efter tavshed miR-196a, E-cadherinekspression steget, samt udtryk for N-cadherin og vimentin faldet.

NFKBIA er et mål for miR-196a i bugspytkirtelkræft

Vi undersøgte derefter de molekylære mekanismer, som miR-196a regulerer vandrende fænotype. De mulige MIR-196a målgener ved databaseanalyse er opsummeret i tabel S1. Online søgning efter miR-196a rettet mod gener ved Targetscan, Miranda og PicTar afslørede, at NFKBIA, en proto-onkogen forbundet med migration og invasion, kunne være et potentielt mål for miR196a (figur 5A). Vi næste afgjort, om NFKBIA udtryk negativt var forbundet med miR-196a niveau i bugspytkirtelkræft cellelinjer. Som bevist i figur 1, ekspressionen af ​​MIR-196a var den højeste i PANC-1-celler, og de laveste i BxPC-3-celler. Vi valgte derfor de to cellelinier til yderligere NFKBIA proteinekspression. Til vores interesse, NFKBIA proteinekspression var højere i BxPC-3-celler end i PANC-1-celler. Desuden NFKBIA steg efter nedregulering af MIR-196a i PANC-1-celler, og faldt efter opregulering af MIR-196a i BxPC-3-celler (figur 5B). For at sikre direkte miRNA-target interaktion, vi oprettet en luciferase reporter assay. Som vist i figur 5C, luciferaseaktiviteten i PANC-1-celler blev reduceret med WT-konstruktionen ved nedregulering af MIR-196a niveau, som delvis vil kunne genoprettes med mutante konstruktioner. Disse resultater antyder, at 3’UTR af NFKBIA er et direkte mål for MIR-196a.

(A) NFKBIA er et potentielt målgen af ​​MIR-196a forudsagt af beregningsanalyse. (B) repræsentant western blot analyse viste forholdet mellem MIR-196a ekspression og endogent NFKBIA proteinniveauet. Hæmningen af ​​miR-196a i Panc-1 celler øget endogene NFKBIA proteinniveauet, mens overekspression af miR-196a i BxPC-3 celler svækkede endogene NFKBIA proteinniveau. (C) Insertion af NFKBIA3’UTR målsekvenser i en luciferase reporter vektor blyholdig til formindsket luciferaseaktivitet i nærvær af MIR-196a i PANC-1-celler 24 timer efter co-transfektion. Histogrammer viste værdier resulterer som den gennemsnitlige ± SD fra tre uafhængige co-transfektioner (*,

P

0,05).

Silencing NFKBIA fremmer proliferation og migration af PANC-1 celler

for yderligere at bestemme den biologiske rolle NFKBIA i bugspytkirtelkræft, undersøgte vi effekten af ​​målrettet knockdown af NFKBIA i PANC-1 celler. I mellemtiden, som bevist før, NFKBIA er et mål for miR-196a, for at ophæve virkningen af ​​anti-miR-196a, vi co-transficeret siNFKBIA og anti-miR-196a i PANC-1 celler. Vi udførte WST-8 assay til påvisning af celleproliferation. Det blev afsløret, at celleproliferationen blev øget betydeligt i PANC-1 celler transficeret med si-NFKBIA på 72 timer sammenlignet med dets kontrolgruppe si-NC (

P

0,05), i mellemtiden, den celleproliferationen var steg betydeligt i PANC-1 celler transficeret med si-NFKBIA + anti-miR-196a på 72 timer sammenlignet med dets kontrolgruppe si-NC + anti-NC (

P

0,05). Der var ingen statistisk signifikans mellem si-NFKBIA og si-NFKBIA + anti-miR-196a (

P

0,05) (Figur 6A). Som vist før, udtryk for cyclin D1 og CDK4 /6 faldt efter lyddæmpende miR-196a. Vi undersøgt yderligere protein udtryk for cyclin D1 og CDK4 /6 efter lyddæmpende NFKBIA. Til vores interesse, øget udtryk for cyklin D1 og CDK4 /6 blev observeret efter silencing NFKBIA (figur 6B). Dernæst transwell assay foreslog inhibering af NFKBIA fremmet migration celler. Desuden dobbelt hæmning af NFKBIA og miR-196a fremmet celler migration (figur 6C, figur 6D), som indebar, at hæmning af NFKBIA blokeret effekten af ​​anti-miR-196a på celle migration. Disse data tyder på, at hæmning af NFKBIA fremmer kræft i bugspytkirtlen celle fremme og migration.

(A) Vækst kurve blandt si-NFKBIA, si-NFKBIA + anti-miR-196a og deres passende kontroller. WST-8 assay viste hæmning af NFKBIA forbedret PANC-1 celler spredning (*,

P

0,05). I mellemtiden dobbelt inhibering af NFKBIA og MIR-196a fremmet celleproliferation. (B) repræsentant western blot analyse viste opregulering af cyklin D1 og CDK4 /6 ekspression efter suppression af NFKBIA i PANC-1-celler ved 72 timer. (C) repræsentant transwell assay indikerede, at migration evne PANC-1-celler blev markant svækket ved nedregulering af NFKBIA. Endvidere inhibering af NFKBIA blokeret effekten af ​​anti-MIR-196a på cellemigrering. (D) Sammenligning af transmembrane celler blandt si-NFKBIA, si-NC, si-NFKBIA + anti-miR-196a, og si-NC + anti-miR-NC (*,

P

0,05) .

diskussion

microRNA analyse undersøgelser viser, at miR-196a er overudtrykt i flere kræftformer, såsom brystkræft [29], kolorektal cancer [30], gastrisk kræft [ ,,,0],31], og pancreascancer [6], [7]. Interessant, et stigende antal rapporter indikerer, at miR-196a spiller en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​cancer. Overekspression af miR-196a er forbundet med høj risiko kvalitet, metastaser og dårlig overlevelse blandt gastrointestinale stromale tumorer [32]. MIR-196a har vist sig at fremme proliferation og invasion af ikke-småcellet lungekræft celle, hvilket indikerer dets vigtige biologiske rolle i tumorudvikling [33]. Det forlyder, at MIR-196a er identificeret med forøget ekspression til at differentiere pancreascancer korrekt fra godartet pancreasvæv, og høj ekspression af MIR-196a findes at forudsige ringe overlevelse [6]. I mellemtiden er det rapporteret, at serum miR-196a ekspressionsniveauerne i inoperabel pancreascancer (faser III og IV) patienter er væsentligt højere end i resektable (fase I og II) patienter [7]. Endvidere serum MIR-196a ekspressionsniveau sig at have en potentiel værdi til at forudsige median overlevelsestid for patienter med pancreascancer. I vores forskning, vi belyst, at miR-196a var over-udtrykt i bugspytkirtelkræft og dens opregulering var signifikant associeret med migration potentiale, som kan fremme kræft i bugspytkirtlen progression og føre til dårlig prognose. EMT menes at være et vigtigt skridt for kræft invasion og metastase [34], [35]. Med nedsat potentiel migration efter lyddæmpende miR-196a, forhøjet udtryk for E-cadherin og nedsat ekspression af N-cadherin og vimentin blev observeret, hvilket indebar, at mesenkymale-epitelial overgang bidraget til undertrykkelse af PANC-1 celle migration efter lyddæmpende miR-196a. Desuden vi demonstreret, at miR-196a fremmet bugspytkirtelkræft spredning gennem G

0 /G

1 anholdelse og faldt cyclin D1 udtryk og CDK4 /6 udtryk, men ikke apoptose.

Desuden har vi undersøgt molekylære mekanisme af miR-196a i bugspytkirtelkræft tumorigenese. Emerging beviser indebærer, at MIR-196a bidrager til tumor patogenese via målretning af specifikke gener [36] – [39]. Vores data viser, at miR-196a bidrog til proliferativ og vandrende potentiale af kræft i bugspytkirtlen, som fremmet vores undersøgelse på target gener associeret med proliferation og migration. Nuklear faktor-kappa B (NF-KB), et kendetegn for det inflammatoriske respons, aktiveres hyppigt i tumorer og kan spille en afgørende rolle i sammenkoblingen inflammation til tumorudvikling og progression [40]. Tidligere undersøgelser viste, at NF-KB suppression i cancer inhiberer celleproliferation, forårsager celle-cellecyklusstandsnings, hvilket antyder, at NF-KB kan spille en vigtig rolle i celleproliferation.