PLoS ONE: Øget MicroRNA-630 Expression i gastrisk kræft er forbundet med dårlig Samlet Survival

Abstrakt

MikroRNA’er er kodende RNA, der regulerer flere cellulære processer under kræft progression. Blandt forskellige microRNA har MIR-630 for nylig blevet identificeret til at være impliceret i mange kritiske processer i humane maligniteter. Vi havde til formål at undersøge betydningen og prognostiske værdi af miR-630 i human gastrisk cancer. Mavekræft og tilstødende normale prøver fra 236 patienter fra, som ikke havde fået neoadjuverende kemoterapi blev indsamlet. Ekspressionen af ​​MIR-630 blev undersøgt ved kvantitativ realtids-PCR assay og dets associering med samlet overlevelse af patienter blev analyseret ved statistisk analyse. MIR-630 ekspressionsniveauet blev signifikant forhøjet i gastrisk cancer i sammenligning med tilstødende normale prøver. Det er også bevist, at MIR-630-ekspression var at være forbundet med gastrisk cancer invasion, lymfeknudemetastase, fjernmetastaser og TNM fase. Desuden overlevelsesanalyse bevist, at forhøjet MIR-630-ekspression blev forbundet med dårlig samlet overlevelse af patienter. Multivariat overlevelsesanalyse viste sig også, at miR-630 var en uafhængig prognostisk markør efter korrigeret for kendte prognostiske faktorer. Den foreliggende undersøgelse beviste overekspression af miR-630 og dens tilknytning til tumor progression i human gastrisk cancer. Det gav også den første bevis på, at miR-630-ekspression var en uafhængig prognostisk faktor for patienter med mavekræft, som kan være en potentiel værdifuld biomarkør for mavekræft

Henvisning:. Chu D, Zhao Z, Li Y, Li J, Zheng J, Wang W, et al. (2014) Øget MicroRNA-630 Expression i gastrisk kræft er forbundet med dårlig Samlet overlevelse. PLoS ONE 9 (3): e90526. doi: 10,1371 /journal.pone.0090526

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: 14. september 2013; Accepteret: 3 feb 2014; Udgivet: 12 marts 2014

Copyright: © 2014 Chu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 81.201.927, 81.272.204 og 31.270.812) og Kina Postdoc Science Foundation (nr 2012M521862). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme på verdensplan [1]. Prognosen for mavecancer er fattige og patienter er generelt diagnosticeret på et forholdsvis langt fremme i de fleste lande [2], [3]. Den samlede 5-års overlevelse er således omkring 40%, og for de patienter med fjernmetastaser er mindre end 5% [4] – [8]. Ca. 700.000 gastrisk kræftpatienter dør årligt, hvilket gør det den næsthyppigste årsag til kræft dødsfald på verdensplan. Data viste, at det rå dødeligheden af ​​mavekræft var 25,2 per 100.000 (32,8 pr 100.000 hos mænd og 17,0 pr 100.000 hos kvinder) [1]. Men der findes bemærkelsesværdig geografisk variation i forekomsten af ​​mavekræft for østlige lande som Kina og Japan har højeste satser for mavekræft end vestlige lande [9], [10]. I Kina, mavekræft er den anden hyppigst diagnosticeret kræft og den tredje hyppigste årsag til kræft død, med en anslået 464 439 nye tilfælde og 352 315 kræftdødsfald i 2008. Den samlede anslåede alder-justeret ulykkesfrekvensen i 2008 var 29,9 pr 100.000 mennesker i Kina [9]. Så mavekræft fortsat et stort problem på verdensplan på trods af en faldende incidens i ikke kun vestlige lande, men også Kina.

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af højt konserverede, enkelt-strengede, små ikke-kodende RNA-molekyler, som er kendt som endogene regulatorer af post-transkriptionel genekspression regulering udtryk gennem translationel undertrykkelse og messenger RNA spaltning [11]. De kan inhibere genekspression på posttranskriptionel niveau ved at binde til den 3 ‘utranslaterede region af target mRNA’er kan resultere i mRNA nedbrydning eller translation inhibering, afhængigt af graden af ​​komplementær baseparring [12], [13]. Det er blevet almindeligt accepteret, at miRNA spiller afgørende roller i forskellige biologiske processer, herunder udvikling, celledeling, differentiering, apoptose og metabolisme [14]. Akkumuleret tyder også, at miRNA deltage i tumorangiogenese, invasion og metastase af human malignitet [15]. Afvigende miRNA udtryk er blevet forbundet med onkogenese, og nogle miRNA fungere som tumorsuppressorer, mens andre som onkogener, afhængigt af deres mål, som kan give indsigt i diagnose og prognose af menneskelige maligniteter [16]. For nylig har beviser vist, at ekspression af miRNA dereguleres i forskellige typer af humane maligniteter såsom gastrisk cancer, brystcancer, colorektal cancer, prostatacancer, lungecancer, pancreas cancer og kronisk lymfatisk leukæmi [17] – [19]. I human gastrisk cancer, har flere miRNA med afvigende ekspression blevet identificeret, for eksempel MIR-21, MIR-22, MIR-23, MIR-127, MIR-148, MIR-202 og MIR-433, som spillede onkogen eller suppressiv rolle [20] – [25]. Disse resultater viste, at miRNA kan spille forskellige og afgørende roller i menneskelige maligniteter inklusive mavekræft. Imidlertid ekspressionsprofilen af ​​miRNA er stærkt vævs- og kræft typespecifikke og miRNA specifik, hvilket således viser den funktionelle og kliniske betydning af en specifik miRNA kan tilvejebringe klinisk relevante indsigt i miRNA funktion og virkningsfuld cancer forvaltning [12], [15]. Så vidt vi ved, indtil nu, den kliniske og prognostiske betydning af MIR-630-ekspression i mavekræft er ikke blevet rapporteret endnu.

I den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt ekspressionsniveauet for MIR-630 i klinisk gastrisk prøver og tilstødende normale væv, samt at analysere dens association med samlet overlevelse af patienter.

Materialer og metoder

patienter og prøver

den foreliggende undersøgelse er blevet godkendt af den etiske komité i fjerde Military Medical University. Alle medlemmer involverede har givet skriftlig informeret samtykke. Friske kliniske mavekræft prøver og tilstødende normale væv blev indsamlet fra 236 patienter, som gennemgik kirurgi mellem januar 2007 og december 2008 i Xijing Hospital i Digestive Diseases, fjerde Military Medical University. Ingen af ​​disse patienter havde fået kemoterapi før operation. Desuden blev normale vævsprøver taget fra 18 patienter, som gennemgik operation for andre end malignitet som normale kontrolprøver årsager. Den histomorphology alle vævsprøver blev bekræftet af Patologisk Institut, fjerde Military Medical University. Prøver blev sat straks i flydende N

2 efter kirurgisk resektion i 10 min, derefter ind i en -70 ° C ultra-fryseren i mRNA isolation. Patienternes kliniske oplysninger, såsom alder, køn, differentiering status og TNM stadie, blev opsamlet og opbevaret i en database. Komplet opfølgning blev gjort tilgængelig i mindst 5 år. Samlet overlevelse er defineret som den tid der er gået fra kirurgi til døden af ​​patienter med gastrisk cancer. Opfølgning information af alle deltagere blev opdateret hver tredje måned telefonisk besøg og spørgeskemaundersøgelser bogstaver. Død af deltagere blev konstateret ved at rapportere fra familien og verificeret ved gennemgang af offentlige registre.

kvantitativ real-time PCR

Total RNA blev oprenset fra alle de 236 mavekræft og matchende tilstødende normale prøver af fabrikanten under anvendelse Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Kun de samlede RNA-prøver med OD A260 /A280-forhold tæt på værdi på 2,0, hvilket indikerer, at RNA er ren, blev efterfølgende analyseret. MIR-630 og RNU44 intern kontrol specifik cDNA blev syntetiseret ud fra total RNA ved anvendelse af genspecifikke primere ifølge TaqMan miRNA tests protokol (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Revers transkription blev derefter amplificeret og detekteret ved real-time PCR under anvendelse Taqman MicroRNA assay (Applied Biosystems) specifikt for HSA-MIR-630. Hver prøve blev undersøgt i tre eksemplarer og rådata blev præsenteret som den relative kvantificering af MIR-630-ekspression vurderet ved den sammenlignende tærskelcyklus (CT) metode, normaliseres med hensyn til RNU44. Mean normaliseret MIR-630 ekspression ± standardafvigelse (SD) blev beregnet ud fra tredobbelt analyse. Real-time PCR blev udført under anvendelse af et ABI 7500-system (Applied Biosystems) og sammenlignende 2

-ΔΔCt analyse blev udført under anvendelse af SDS 2.2.2 software (Applied Biosystems).

Statistical Analysis

Associations mellem mIR-630 ekspression og klinisk-patologiske karakteristika blev analyseret ved Mann-Whitney-test og Kruskal-Wallis test, alt efter omstændighederne. Overlevelseskurver blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og forskelle i overlevelse distributioner blev evalueret ved log-rank test. Cox ‘proportionale farer modellering af faktorer potentielt relateret til overlevelse blev udført for at identificere, hvilke faktorer kan have en betydelig indflydelse på overlevelse, og kontrollere for alder, køn og differentiering status. Forskelle med

P

værdi på 0,05 eller derunder blev anset for at være statistisk signifikant.

Resultater

MIR-630 Expression Fundet i Gastric Cancer

I real-time PCR-analyse, 236 tilfælde af mavecancer, matchende tilstødende normale prøver og 18 tilfælde af normale kontrolprøver blev undersøgt. Relativ ekspression af MIR-630 normaliseret til RNU44 i gastrisk cancer viste sig at være 8,51 ± 1,63 (gennemsnit ± SD), mens der i matchende tilstødende normale var 3,25 ± 0,63. Statistiske resultater viste, at ekspression af miR-630 i mavekræft var betydeligt højere end i tilstødende og normale kontrolprøver (

P

0,05). Disse resultater indikerede, at MIR-630 kunne spille en onkogen rolle i gastrisk cancer. For at lette yderligere analyse på sammenhængen mellem miR-630 udtryk og kliniske funktioner, vi definerede mavekræft manuelt med miR-630 udtryk lavere end 3,88 (Mean + SD udtryk for miR-630 i tilstødende prøver) så lav miR-630 udtryk gruppe, mens prøver med mIR-630-ekspression ikke lavere end 3,88 blev defineret som høj mIR-630-ekspression gruppe. Således blandt 236 tilfælde af mavekræft, blev 98 sager overdraget til lav udtryk gruppe, mens 138 sager blev tildelt høj ekspression gruppe.

Forholdet mellem MIR-630 til klinisk-patologisk Karakteristik af mavekræft

som vores undersøgelse beviste, at mIR-630-ekspression blev øget i gastrisk cancer, hvilket indikerede, at mIR-630 kan virke som et onkogent rolle i gastrisk cancer. Vi undersøgt yderligere sammenslutningen af ​​miR-630 udtryk med klinisk-patologiske karakteristika af patienter til at udforske sin potentielle rolle i mavekræft progression. Statistiske analyseresultater, viste i tabel 1, viste sig at øget MIR-630-ekspression blev forbundet med fremskreden gastrisk invasion kræft siden high MIR-630-ekspression var hyppigere skal detekteres i T3 og T4 tumorer (

P

= 0,007 ). Hvad angår tumormetastase blev betragtet, var forhøjet MIR-630-ekspression i forbindelse med positive lymfeknuder og fjern metastase til høj MIR-630-ekspression var hyppigere skal detekteres i tumorer med positiv lymfeknude (

P

0,001) eller fjernmetastaser (

P

= 0,002). Derudover når vi målte patienternes kliniske træk ved TNM, fandt vi, at MIR-630-ekspression blev signifikant associeret med TNM fase af mavekræft fordi høj MIR-630-ekspression var mere tilbøjelige til at blive detekteret i tumorer med fremskreden TNM stadium (

P

0,001). Disse resultater antydede, at MIR-630 kunne spille en onkogen rolle i progressionen af ​​gastrisk cancer. den positive ration af miR-630 blev imidlertid ikke fundet, at være forbundet med patienternes køn (

P

= 0,788), alder (

P

= 0,471), differentiering status (

P

= 0,890), tumor websted (

P

= 0,835) eller lauren klassifikation (

P

= 0,160).

Forholdet af MiR- 630 til Samlet overlevelse af patienter “med mavekræft

Under hele opfølgningsperioden, 130 af de 236 patienter (55,1%) med mavekræft var død og median samlet overlevelse tid for alle rekrutterede patienter var 48 måned. Kaplan-Meier-analyse blev anvendt til at undersøge prognostiske værdi af MIR-630-ekspression til samlet overlevelse af patienter med gastrisk cancer. Resultaterne viste, at patienter med mavekræft høj miR-630 udtryk tendens til at have dårligere samlet overlevelse (log rank test:

P

0,001, figur 1). Den mediane overlevelsestid på patienter med lav miR-630-ekspression kan ikke vurderes, da mere end 50% af patienterne overlevede i follow-up perioden. Mens den postoperative median overlevelsestid for patienter med høj MIR-630-ekspression var 34 måneder (95% CI: 28,2-39,8). Når ikke-justerede hazard ratio (HR) blev betragtet med lav miR-630 udtryk som reference (1,00), patienter med mavekræft høj miR-630-ekspression havde en 2,28 gange højere risiko for at dø (95% CI: 1,57-3,32;

P

0,001). Så vidt klinisk-patologiske karakteristika blev betragtet, lymfeknude metastaser (log rank test:

P

= 0,002), fjernmetastaser (log rank test:

P

0,001) og TNM stadie (log rank test:

P

0,001) blev også vist sig at være forbundet med den samlede overlevelse, da patienter med mavekræft af lymfeknude metastaser, fjernmetastaser eller avanceret klasse tendens til at have dårligere samlet overlevelse og højere risiko for død. Men køn (log rank test:

P

= 0,168), alder (log rank test:

P

= 0,572) differentiering status (log rank test:

P

= 0,156), tumor websted (log rank test:

P

= 0,632) eller lauren klassifikation (log rank test:

P

= 0,573) havde ingen prognostisk værdi på samlet overlevelse af patienter med mavekræft .

som miR-630-ekspression vist sig at være forbundet med den samlede overlevelse af patienterne i univariat overlevelse analyse, vi yderligere undersøgt, om miR-630 kunne fungere som en uafhængig prognostisk markør for patienter med mavekræft. Fordi lymfeknude metastaser og fjernmetastaser oplysninger blev medtaget i data TNM stadie, vi udførte Cox proportionel risiko model, som justeres efter køn, alder og TNM stadie. Resultaterne viste, at den justerede HR af høj miR-630 udtryk gruppe var 3,51 (95% CI: 1,83-6,72;

P

0,001). Disse resultater viste sig at MIR-630 var en uafhængig prognostisk faktor samlet overlevelse for patienter med gastrisk cancer. Således steg miR-630 udtryk kunne være en indikator for dårlig samlet overlevelse uden hensyntagen til alder, køn eller TNM stadie (tabel 2).

Diskussion

Ifølge de seneste undersøgelser, mere end 1.900 humane miRNA er blevet identificeret, som skønnes at regulere over 60% af gener i pattedyr [26]. På grund af deres store betydning i reguleringen af ​​genekspression, er det blevet almindeligt accepteret, at miRNA er involveret i flere cellulære funktioner, herunder proliferation, apoptose og differentiering, således er gennemført i forskellige fysiologiske og patologiske processer lige fra udvikling til kræft [27 ] – [29]. Tidligere undersøgelse adspurgte udtryk profiler af miRNA i fase I ikke-småcellet lungekræft at identificere mønstre, der kunne forudsige tilbagefald efter kirurgisk resektion fandt, at mir-630 var en af ​​de mest almindeligt miRNA blandt de 1.000 klassificører identificeret [30]. En anden undersøgelse af ikke-småcellet fundet, at MIR-630 kunne regulere cisplatin-induceret celledød, hvilket indikerer MIR-630 var en potentiel modulator af cisplatin respons i ikke-småcellet lungecancer [31]. MIR-630 blev også fundet at være opreguleret i hoved og hals pladecellecarcinom efter cisplatin behandling og kan modulere protein ekspression af ATG5, ATG6 /BECN1, ATG10, ATG12, ATG16L1 og UVRAG [32], [33]. Nylig undersøgelse viste, at opregulering af miR-630 i bugspytkirtelkræftceller kunne inducere apoptose ved at målrette IGF-1R [34]. Da individuelle miRNA i forskellige cancertyper kan have et stort antal forskellige genmål dermed har forskellige funktioner i forskellige maligniteter. Så kan den funktionelle opdagelse af individuelle miRNA muliggøre dybere indsigt i regulering af genekspression og kompleksitet kræft progression.

I den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt miR-630 mRNA-ekspression ved real-time PCR-analyse i 236 tilfælde af mavekræft fra patienter, som ikke havde fået neoadjuverende kemoterapi. Baseret relative ekspression beregning analyserede vi associering af MIR-630 med klinisk-patologiske karakteristika samt prognose af patienterne. Resultaterne viste, at MIR-630-ekspression blev øget i gastrisk cancer sammenlignet med i tilstødende og normale kontrol væv til høj ekspression af MIR-630 var mere tilbøjelige til at blive detekteret i gastrisk cancer prøver, som angiver dens mulige deltagelse på carcinogenese. Det er også fundet, at MIR-630-ekspression var nært beslægtet med gastrisk cancer invasion, lymfeknudemetastase, fjernmetastaser og TNM fase for høj ekspression af MIR-630 var hyppigere skal detekteres i tumorer med dyb invasion, lymfeknudemetastase, fjernt metastase eller avanceret TNM stadie, hvilket tyder på en mulig deltagelse af miR-630 på mavekræft invasion og metastase. Sammen med de ovennævnte beviser, blev det derfor foreslået, at MIR-630 kan spille vigtige roller i gastrisk cancer carcinogenese og progression.

Som blev fundet MIR-630-ekspression at være forbundet med gastrisk cancer invasion og metastase, overvejer invasion af cancer til nærliggende væv og metastase til distale væv er afgørende faktorer påvirker prognosen for patienter, kan mIR-630 være en potentiel prognostisk markør for patienter med gastrisk cancer. For at undersøge den prognostiske rolle MIR-630 på gastrisk cancer, udførte vi Kaplan-Meier-analyse af den samlede overlevelse. Resultaterne viste, at patienter med gastrisk cancer høj MIR-630-ekspression tendens til at have ringere samlet overlevelse sammenlignet med patienter med tumor med lav MIR-630-ekspression, hvilket antydede, at MIR-630-ekspression var en prognostisk markør for patienter med gastrisk cancer. For yderligere at evaluere den prognostiske værdi af miR-630 i mavekræft, vi udførte Cox proportionel risiko model, som blev justeret for køn, alder og TNM stadie af patienterne. Resultaterne viste, at øget MIR-630-ekspression var en markør for dårlig samlet overlevelse uafhængig af justerede faktorer, således MIR-630 kunne anvendes til at bestemme patienternes prognose med ud overvejer TNM fase. Disse resultater viste, at miR-630 kunne udgøre en molekylær prognostisk markør tilsætningsstof til TNM stadie for patienter med mavekræft, identificere højrisiko personer, der er mere tilbøjelige til at have tumor tilbagefald i klinisk praksis, således gode kandidater til at modtage mere aggressiv behandling. Disse resultater var i overensstemmelse med undersøgelser, der fokuserer på ikke-småcellet lungekræft, der angiver konsistens MIR-630 funktion i disse typer af tumor. Således positiv forbindelse mellem MIR-630 overekspression og dårlig prognose, kan ikke kun anvendes til at identificere gastriske cancerpatienter med højere risiko for tidlig tumortilbagefald men også til at tilvejebringe værdifulde spor for at forstå den mulige mekanisme af gastrisk cancer invasion og metastase.

som konklusion har vi vist, at mIR-630-ekspression blev øget i gastrisk cancer og associeret med tumorudvikling. Den foreliggende undersøgelse viste også for første gang, at MIR-630-ekspression var en uafhængig prognostisk faktor af patienter med gastrisk cancer. Derfor er det muligt, at MIR-630 kan spille en vigtig rolle i invasivitet og metastase af mavekræft. Det er også muligt, at MIR-630 tjener som prognostisk markør i klinisk praksis og selv inhiberingen for MIR-630 ved anvendelse af specifikke inhibitorer kan blive en ny terapeutisk fremgangsmåde til behandling af gastrisk cancer.