PLoS ONE: A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostisk strategi for kolorektal Cancer

Abstrakt

Baggrund

For at forbedre livskvaliteten for kolorektal cancer patienter, er det vigtigt at etablere nye screeningsmetoder for tidlig diagnosticering af kolorektal cancer.

Metodologi /vigtigste resultater

Vi udførte serum metabolomet analyse ved hjælp gaschromatografi /massespektrometri (GC /MS). Først blev nøjagtigheden af ​​vores GC /MS-baseret serum metabolomiske analysemetode vurderet ved beregning af RSD% -værdier på serumniveauer af forskellige metabolitter. For det andet blev den intra-dag (morgen, dagtimerne, og nat) og inter-dag (blandt 3 dage) varianser af serum metabolitniveauer undersøgt. Derefter blev serum metabolit niveauer sammenlignet mellem patienter med tyktarmskræft (N = 60; N = 12 for hvert trin fra 0 til 4) og alders- og køn-matchede raske frivillige (N = 60) som et træningssæt. Den metabolitter, hvis niveauer viste signifikant ændringer blev udsat for multipel logistisk regressionsanalyse ved anvendelse af trinvis variabel udvælgelsesmetode, og en kolorektal cancer forudsigelse model blev etableret. Forudsigelsesmodellen bestod af 2-hydroxybutyrat, asparaginsyre, kynurenin og cystamin og dens AUC, følsomhed, specificitet og nøjagtighed var 0,9097, 85,0%, 85,0% og 85,0%, henholdsvis ifølge træningssættet data. I modsætning hertil følsomhed, specificitet og nøjagtighed af CEA var 35,0%, 96,7% og 65,8%, henholdsvis og de af CA19-9 var 16,7%, 100%, og 58,3%, henholdsvis. Gyldigheden af ​​forudsigelsen model blev bekræftet ved hjælp af kolorektal cancer patienter (N = 59) og raske frivillige (N = 63) som en validering sæt. Ved validering sæt, følsomhed, specificitet og nøjagtighed af forudsigelsen model var 83,1%, 81,0% og 82,0%, henholdsvis, og disse værdier var næsten den samme som dem, der opnås med træningssættet. Hertil kommer, at modellen viste høj følsomhed til påvisning af etape 0-2 kolorektal cancer (82,8%).

Konklusioner /Betydning

Vores forudsigelse model etableres via GC /MS-baserede serum metabolomiske analyse er værdifuldt til tidlig opdagelse af tyk- og endetarmskræft og har potentiale til at blive en ny screeningstest for tarmkræft

Henvisning:. Nishiumi S, Kobayashi T, Ikeda a, Yoshie T, Kibi M, Izumi Y, et al. (2012) A Novel Serum Metabolomics-Based Diagnostisk strategi for tyktarms- og endetarmskræft. PLoS ONE 7 (7): e40459. doi: 10,1371 /journal.pone.0040459

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Marts 28, 2012; Accepteret: 7 jun 2012; Udgivet: 11. juli 2012 |

Copyright: © 2012 Nishiumi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud til den globale COE Program, Global center of Excellence for uddannelse og forskning på Signal transduktion Medicin i den kommende generation fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi (MEXT) i Japan (TK, TY, MK, TA, og MY); en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning om innovative områder fra MEXT of Japan (SN og TA); uddannelsesprogrammet for Specialized klinikere i støtteprogrammet for Forbedring Graduate School Education fra MEXT of Japan (AI); og Tilskud til projekt forskning (Udvikling af grundlæggende teknologi til analyse og evaluering af funktionelle landbrugsprodukter og funktionelle fødevarer) fra ministeriet for landbrug, skovbrug, og fiskeri (MAFF) i Japan (MY). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er en af ​​de mest almindelige årsager til kræft død i udviklede lande [1]. Behandlingsmetoder baseret på koloskopi og kirurgi har avanceret hurtigt, og et stort antal af patienter med kolorektal cancer opnå forbedringer efter terapi. Imidlertid fremskredent stadium colorectal cancer nedsætter livskvaliteten for patienter, der modtager operativ behandling eller kemoterapi. Derfor metoder, der tillader tidlig påvisning og diagnosticering af kolorektal cancer i øjeblikket søges. Fecal okkult blodprøve (FOBT) er den mest almindeligt anvendte screeningsmetode til diagnosticering kolorektal cancer og er en noninvasiv og billig metode. Men FOBT har lav følsomhed, især for tidligt tyktarmskræft. Koloskopi er en mere nøjagtig og pålidelig fremgangsmåde til diagnosticering af colorektal cancer, men det er vanskeligt for ældre eller alvorligt syge patienter til at gennemgå koloskopi, og de høje omkostninger er også et problem. Således har undersøgelser, der involverer en kombination af konventionelle screeningsmetoder blevet anvendt til diagnose af colorektal cancer; Sådanne undersøgelser detektere kun ca. 40% af colorektale cancere [2]. Derfor er det nødvendigt at etablere nye screeningsmetoder til tidlig diagnosticering af kolorektal cancer, der er meget følsomme, specifikke, nem og noninvasive.

Det menneskelige genom var blevet fuldstændig identificeret ved udgangen af ​​2003. Siden , proteomik, som er den omfattende undersøgelse af hele sæt af proteiner udtrykt af et genom, er blevet grundigt undersøgt, og mange forskere har forsøgt at anvende proteomisk analyse til det medicinske område for at finde effektive diagnostiske markører og belyse ukendte patologiske tilstande [ ,,,0],3]. For nylig, metabolomik, som er den omfattende undersøgelse af lavmolekylære metabolitter, er også blevet udviklet. I klinisk forskning med metabolom analyse under anvendelse af en kombination af høj-throughput væske-chromatografi /massespektrometri (LC /MS) og gaschromatografi /massespektrometri (GC /MS), Sreekumar et al. vist, at sarcosin er en potentielt vigtig metabolisk mellemmand for prostatakræft celle invasion og aggressivitet [4]. Desuden blev en omfattende og kvantitativ analyse af de ladede metabolitter i tumor og normale væv fra colorectale og gastrisk kræftpatienter udført under anvendelse af kapillarelektroforese-massespektrometri (CE /MS) [5]. Således har forskellige typer af kliniske prøver blevet analyseret af metabolomet analyse under anvendelse af kernemagnetisk resonans (NMR), GC /MS, LC /MS, CE /MS, og /eller maldi-massespektrometri (MALDI-MS) i for at belyse sygdomsdebut mekanismer og opdage nye biomarkører [6]. Blandt disse teknikker, GC /MS har en lang historie og er lettere at bruge end CE /MS eller MALDI-MS, selv om GC /MS har lav følsomhed sammenlignet med LC /MS. Desuden er der flere databaser over GC /MS-baserede serum metabolit analyseresultater end af LC /MS-baserede serum metabolit analyseresultater. Desuden kan GC /MS anvendes til store studier med relativ lethed grund af sin høje gentagelsesnøjagtighed. Derfor, i denne undersøgelse, serum metabolit niveauer af kolorektal kræftpatienter og raske frivillige blev analyseret ved GC /MS-analyse for at etablere nye diagnostiske værktøjer for tarmkræft, og stabilitets- og inter-dag og intra-dages afvigelser fra disse serum metabolit niveauer blev også evalueret. Ved hjælp af et træningssæt bestående af patienter med tyktarmskræft (N = 60) og raske frivillige (N = 60) blev en colorectal cancer-forudsigelse model etableres via multipel logistisk regressionsanalyse ved anvendelse af trinvis variabel udvælgelsesmetode. Derefter blev gyldigheden af ​​forudsigelsen model vurderes ved hjælp af en validering sæt bestående af patienter med tyktarmskræft (N = 59) og sunde frivillige (N = 63).

Metoder

Etik og Deltagere

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité på Kobe University Graduate School of Medicine, og udføres mellem Feb. 2009 og december 2011. de menneskelige prøver blev anvendt i overensstemmelse med retningslinjerne fra Kobe Universitetshospital, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle fag. At beregne den relative standardafvigelse (RSD)% for serum metabolomet analyseresultater opnået ved GC /MS blev blodprøver opsamlet fra en rask 30-årig mand frivilligt efter faste i de tidlige morgentimer, og serummet blev separeret ved centrifugering ved 3.000 x g i 10 min ved 4 ° C. Serummet blev overført til et rent rør og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. For at evaluere den intra-dag varians i serum metabolitter blev fuldblodsprøver indsamlet fra raske frivillige (n = 16) på 8:00-9: 12:00 før morgenmaden, 12:00-1: 12:00 før frokost, og 18:00-7: 12:00 før middag. Til evaluering af inter-dages varians i serum metabolitniveauer, fuldblodsprøver (n = 16) blev opsamlet ved 08:00-9: 12:00 før morgenmad gang om dagen i alt 3 dage. For træningssættet blev 60 serumprøver hver fås fra kolorektal kræftpatienter og raske frivillige efter faste i de tidlige morgentimer. For validering sæt, blev 59 og 63 serumprøver indsamlet fra kolorektal kræftpatienter og raske forsøgspersoner, hhv. De serumprøver fra patienter med tarmkræft blev indsamlet ved Kobe Universitetshospital. Ingen af ​​kræftpatienter havde nogen komplicerende sygdomme. Patienterne blev diagnosticeret ved mikroskopi, biopsi eller kirurgisk resektion og klassificeret ved hjælp af den sjette udgave af Den Internationale Union Against Cancer klassifikation (UICC). Serumprøverne fra raske frivillige blev opnået fra Kobe University Hospital og to andre faciliteter. I Kobe Universitetshospital, blev det bekræftet, at der ikke er unormalt for blodprøver, endoskopiske undersøgelser, billeddiagnostik og /eller medicinsk interview. På to andre faciliteter blev raske frivillige vælges via sundhedstjek herunder blodprøver, endoskopiske undersøgelser, billeddiagnostik og /eller medicinske interviews. Personer, der var blevet diagnosticeret som kræver behandling, detaljerede undersøgelser og /eller observationer blev ikke behandlet som raske frivillige. Karakteristika for alle individer er opsummeret i tabel 1, tabel S1, og tabel S2.

Eksperimentelle procedurer

udvinding af lavmolekylære metabolitter blev udført ifølge fremgangsmåden beskrevet i vores tidligere rapport [7]. Kort fortalt blev 50 pi serum blandes med 250 pi af en opløsningsmiddelblanding (MeOH: H

2O: CHC

3 = 2,5: 1: 1) indeholdende 10 pi 0,5 mg /ml 2-isopropylæblesyre (Sigma -Aldrich, Tokyo, Japan) opløst i destilleret vand som en intern standard, og derefter blev opløsningen rystet ved 1.200 rpm i 30 min ved 37 ° C, før den blev centrifugeret ved 16.000 x g i 3 minutter ved 4 ° C. To hundrede og femogtyve pi den resulterende supernatant blev overført til et rent rør, og 200 pi destilleret vand blev tilsat til røret. Efter blanding blev opløsningen centrifugeret ved 16.000 x g i 3 minutter ved 4 ° C, og 250 pi af den resulterende supernatant blev overført til et rent rør, før de lyofiliseret ved anvendelse af en frysetørrer. For oximering, blev 40 pi 20 mg /ml methoxyaminhydrochlorid (Sigma-Aldrich, Tokyo, Japan) opløst i pyridin blandet med en lyofiliseret prøve, før den blev rystet ved 1.200 rpm i 90 minutter ved 30 ° C. Derefter blev 20 pi N-methyl-N-trimethylsilyl-trifluoracetamid (MSTFA) (GL Science, Tokyo, Japan) tilsat til derivatisering, og blandingen blev inkuberet ved 1.200 rpm i 30 min ved 37 ° C. Blandingen blev derefter centrifugeret ved 16.000 x g i 5 min ved 4 ° C, og den resulterende supernatant blev underkastet GC /MS-måling.

Ifølge fremgangsmåden beskriver i en tidligere rapport [8], GC /MS analyse blev udført ved hjælp af en GCMS-QP2010 Ultra (Shimadzu Co., Kyoto, Japan) med en smeltet silica kapillarsøjle (CP-SIL 8 CB lav bløder /MS, 30 m × 0,25 mm indvendig diameter, lagtykkelse: 0,25 um; Agilent Co, Palo Alto, CA). Den forreste indløbstemperatur var 230 ° C. Strømningshastigheden af ​​helium gas gennem søjlen var 39,0 cm /sek. Søjlen Temperaturen blev holdt ved 80 ° C i 2 minutter og derefter hævet med 15 ° C /min til 330 ° C og holdt der i 6 min. Overførselsledningen og ion-source temperaturer var 250 ° C og 200 ° C, hhv. Tyve scanninger i sekundet blev registreret over masseinterval 85-500 m /z ved hjælp af Advanced Scanning Speed ​​Protocol (ASSP, Shimadzu Co.). I denne undersøgelse blev påvisning spænding bekræftet hver dag før GC /MS-analyse, fordi denne værdi reflekterer graden af ​​forurening i instrumentet. Desuden blev de blindprøver målt før måling af serumprøverne. Under GC /MS-analyse blev de 20 prøver om en dagen målt, og membranen og glas liner i GC-tilførsel blev ændret hver 100 injektioner til søjlen.

Databehandling blev udført ifølge fremgangsmåderne beskrevet i tidligere rapporter [8], [9]. Kort fortalt blev MS-data eksporteres i NetCDF format. Toppen påvisning og tilpasning blev udført under anvendelse af MetAlign software (Wageningen UR, Holland). De fremkomne data blev eksporteret i CSV-format og derefter analyseret med in-house analytisk software (AIoutput). Denne software gør det muligt peak identifikation og semi-kvantificering ved hjælp af en in-house metabolit bibliotek. For semi-kvantificering blev tophøjden for hver ion beregnet og normaliseret til den maksimale højde på 2-isopropylæblesyre som en intern standard. Navne blev tildelt hver metabolit spids baseret på den beskrevet i en tidligere [9] rapport metode. Alle data fra serumprøver blev udsat for MetAlign software på en gang, fordi de samme tilpasningskravene skulle udføres under alle dataanalyse. I GC /MS-analyse, multiple toppe undertiden detekteret for en bestemt metabolit grund TMS-derivatisering isomer form, etc. I sådanne tilfælde top, som mest afspejler niveauet af metabolitten blev vedtaget for semikvantitativ vurdering.

Statistisk Analyse

patienterne (N = 119), blev tildelt de uddannelses- og validering sæt som følger. De kolorektal cancer patientprøver for træningssættet blev indsamlet uden kriterier forudindstillede udvælgelseskriterier, og 12 kolorektal cancer patienter blev udvalgt til hver sygdom etape (N = 60). Som for de raske frivillige, der anvendes til træningssættet blev alders- og køn-kontrollerede prøver fremstillet (N = 60). I træningssættet undersøgelsen blev niveauerne af metabolitter sammenlignet mellem patienter med tyktarmskræft og raske forsøgspersoner ved anvendelse af Mann-Whitney U test. Blandt de metabolitter, der vises markant forskellige niveauer mellem grupperne (

s

0,05), valgte vi de metabolitter med RSD% værdier på ikke mere end 20%, og det gjorde ikke vise signifikant intra-dag eller inter- dag afvigelser i henhold til Wilcoxon-test og Stål-Dwass test, hhv. De udvalgte metabolitter blev underkastet en trinvis variabel udvælgelsesmetode efterfulgt af multipel logistisk regressionsanalyse, og disse analyser blev udført ved anvendelse af standard betingelser for JMP9 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Den multikollinearitet af de udvalgte via trinvis variabel metode valg metabolitter blev bekræftet ved at beregne deres varians inflation faktorer (VIF). AICC, som er Akaike s Information Criterion (AIC) med en korrektion for finite stikprøvestørrelser, blev beregnet til at belyse det optimale antal faktorer skal medtages i prædiktiv model. Nagelkerke R

2 blev også beregnet til at vurdere egnethed multivariat logistisk model. Receiver operating characteristic (ROC) analyse blev udført ved anvendelse JMP9 (SAS Institute Inc.), og den optimale afskæringsværdi og AUC, specificitet, følsomhed og nøjagtighed blev beregnet. I valideringen sæt undersøgelse blev forudsigelse model revurderes ved hjælp af forskellige prøver, og specificitet, sensitivitet, og nøjagtigheden af ​​modellen blev undersøgt ved hjælp af cut-off værdi fås fra træningssættet.

s

værdier på mindre end 0,05 blev anset for at indikere en signifikant forskel.

Resultater

I vores GC /MS-baserede metabolomisk analysesystem, som primært målrettet vandopløselige metabolitter, blev påvist 132 metabolitter i fagene sera (tabel S3). Blandt de 132 metabolitter, 1 metabolit; dvs. 2-isopropylæblesyre, blev anvendt som en indre standard, og 5 metabolitter blev formentlig ekstraheret fra ikke-serum, for eksempel blev de afledt af eppendorfrør. Derfor blev disse 6 metabolitter udelukket fra de efterfølgende analyser. Da oxaleddikesyre blev omdannet til pyruvat under proceduren forbehandlingen blev oxaleddikesyre påvist som pyruvat i vores system. Derfor er det beskrevet som ‘pyruvat + oxaleddikesyre’ i Støtte tabeller og som ‘pyruvat «, som faktisk blev opdaget ved GC /MS-analyse, i dette manuskript. På grund af deres lignende strukturer blev citronsyre og isocitronsyre detekteres på samme retentionstid af vores system. Derfor er de beskrevet som ‘citronsyre + isocitronsyre «. Da cysteamin blev konverteret til Cystamin under proceduren forbehandlingen, blev cysteamin detekteret som cystamin af vores system. Derfor er det beskrevet som ‘cysteamin + cystamin’ i Støtte tabeller og som ‘cystamin «, som faktisk blev opdaget ved GC /MS-analyse, i dette manuskript. Da cystein blev omdannet til cystin under proceduren forbehandlingen, blev cystein detekteret som cystin af vores system. Derfor er det beskrevet som “cystein + cystin ‘i Støtte tabeller og som” cystin «, som faktisk blev opdaget ved GC /MS-analyse, i dette manuskript.

For at vurdere stabiliteten af ​​dette system ved hjælp af menneskelige serum, serumniveauerne af forskellige metabolitter blev separat analyseret under anvendelse serumprøver (n = 10) opnået ved 1 rask frivillig (mand, 30 år), og derefter RSD% værdierne af metabolitter blev beregnet (tabel S3). Procentdelen af ​​metabolitter med RSD% værdier på mindre end 20% og 30% var 68,5% og 86,5%, henholdsvis. Dernæst blev den inter-dag (blandt 3 dage) og intra-dag (morgen, dagtimerne, og nat) variansen på serum metabolitter evalueret ved brug af Wilcoxon-test og Stål-Dwass test (tabel S3), fordi den betydelige intra-dag og /eller inter-dage varians vil sandsynligvis føre til lav følsomhed og specificitet på klinisk anvendelse. Mange metabolitter ikke vise betydelige inter-dag og intra-dages afvigelser, men 30 metabolitter, for eksempel dihydroxyacetone og tryptophan, viste betydelige variationer. I GC /MS-analyse, multiple toppe undertiden detekteret for en bestemt metabolit grund TMS-derivatisering isomer form, etc. I disse tilfælde blev den top, der mest afspejler niveauet af metabolitten vedtaget for efterfølgende evaluering. For disse metabolitter, udtrykkene »_1″, “_2”, og “(TMS)” blev sat til enderne af deres navne i overensstemmelse med metoden af ​​en tidligere rapport [9]. De udstødte toppe er angivet ved betegnelsen “Minor” i tabel S4, og efter at udelukke “Mindre” toppe i alt 107 metabolitter havde deres niveauer sammenlignet mellem kolorektal kræftpatienter og raske frivillige (figur 1, tabel S4).

middelværdien fold ændringer i niveauerne af 107 metabolitter observeret i en sammenligning mellem colorectale cancerpatienter (N = 60) og hos raske frivillige (N = 60) (træningssæt) er vist i figur 1. i GC /MS-analyse, flere toppe undertiden detekteres for en bestemt metabolit grund TMS-derivatisering isomer form, etc. i sådanne tilfælde top, som mest afspejler niveauet af metabolitten blev vedtaget for efterfølgende evaluering. Derudover har hvert metabolit havde begrebet “_1”, “_2 ‘eller’ (TMS)” føjes til slutningen af ​​sit navn, som beskrevet i en tidligere rapport [7]. Dette tal omfatter ikke baggrunden metabolitter eller mindre peak-afledte metabolitter.

I træningssættet undersøgelsen blev serum metabolit niveauer af kolorektal cancer patienter og sundhed forsøgspersoner sammenlignet ved anvendelse af Mann-Whitney U test (tabel S4). Sættet træning bestod af patienter med tyktarmskræft (N = 60) og alders- og køn-matchede raske frivillige (N = 60) (tabel 1, tabel S1). Der var ingen signifikant forskel i den gennemsnitlige alder eller BMI værdier af de to grupper (tabel 1). I denne undersøgelse blev kolorektal cancer også inddeles i 2 grupper; dvs. gruppe 1 omfattede fase 0, 1, og 2 sygdom (fravær af invasion og metastase) og gruppe 2 inkluderet stadie 3 og 4 sygdom (tilstedeværelse af invasion og metastase). Ud fra resultaterne af GC /MS-analyse blev 27 metabolitter, der opfyldte følgende betingelser udvalgt som biomarkør kandidater: en RSD% værdi på 20%; ingen signifikant (p≥0.05) intra-dag eller inter-dage afvigelser i henhold til Wilcoxon-test og Stål-Dwass test; og tilstedeværelsen af ​​en signifikant forskel (p 0,05) mellem niveauerne af de kolorektale kræftpatienter og raske frivillige ifølge Mann-Whitney U test. ROC-kurver blev fremstillet under anvendelse af data for disse 27 metabolitter, (fig S1), og afskæringsværdien, AUC, følsomhed, specificitet og nøjagtighed af hver metabolit blev beregnet (tabel 2). Som et resultat, nonansyre (C9) og p-hydroxybenzoesyre vises relativt høj følsomhed, med værdier på 86,7% og 90%, hhv. Vedrørende specificitet, cystamin og cystin der udviser værdier på 90%, og ornithin (86,7%), citrullin (85,0%), og palmitoleat (85,0%) viste også relativt høj specificitet. Men der var ingen metabolitter med nøjagtighed værdier på mere end 80%, hvilket tyder på at det er nødvendigt at udføre evalueringer ved hjælp af flere metabolit biomarkører.

Som en ny evalueringsmetode, anvendeligheden af ​​en multipel logistisk regressionsmodel involverer flere metabolit biomarkører blev undersøgt. Blandt de 27 metabolitter blev de 10 metabolitter, viste de største forskelle mellem deres niveauer i kolorektal cancer patienter og dem i raske frivillige og havde de højere niveauer i kolorektal cancer patienter sammenlignet med raske frivillige valgt: cystamin cystin, asparaginsyre syre, arabinose, p-hydroxybenzoesyre, glutaminsyre, 2-hydroxybutyrat, kynurenin, meso-erythritol, og lactitol (tabel 3). De fleste af disse metabolitter viste signifikant-ændrede niveauer i fase 0-4 (N = 60), trin 0-2 (N = 36), og scene 3-4 (N = 24) grupper. Blandt disse metabolitter, arabinose, meso-erythritol, og lactitol hyppigt indtages i kosten. Derfor blev de resterende 7 metabolitter underkastes en trinvis variabel metode markering. Som et resultat, 2-hydroxybutyrat, asparaginsyre, kynurenin, og cystamin blev udvalgt. Disse 4 metabolitter udviste ikke multikollinearitet (data ikke vist). Derefter blev en multipel logistisk regressionsmodel til forudsigelse kolorektal cancer fastsat på grundlag af data for disse metabolitter (tabel 4)

Den prognosemodel er som følger:.

p = 1 /[1 + e – {- 8,32 + 286,59 (2-hydroxybutyrat) 33,87 (asparaginsyre) 1634,96 (kynurenin) 78,78 (cystamin)}]

Nagelkerke R

2 værdi var 0,4533. AUC, følsomhed, specificitet og nøjagtighed af denne model var 0,9097 {95% konfidensinterval (95% CI): 0,8438 til 0,9495}, 85,0%, 85,0%, og 85,0% (tabel 5, figur 2). Selvom vi har valgt 2, 3, 5 eller 6 metabolitter via trinvis variabel metode udvælgelse og derefter udføres yderligere multipel logistisk regression analyser, kunne vi ikke etablere en bedre model (data ikke vist). Tværtimod når træningssættet data blev anvendt, følsomhed, specificitet og nøjagtighed CEA var 35,0%, 96,7%, og 65,8%, henholdsvis, og de af CA19-9 var 16,7%, 100%, og 58,3% , henholdsvis. Vores forudsigelse model viste også høj følsomhed (83,3%) i fase 0-2 colorectal cancer patientgruppe, hvorimod CEA og CA19-9 viste følsomhed 30,6% og 5,6%, henholdsvis.

Det faste kurve er ROC-kurven for forudsigelsesmodellen fastsat på grundlag af træningssættet. AUC og cut-off værdier var 0,9097 {95% konfidensinterval (95% CI): 0,8438 til 0,9495} og 0,4945 hhv. Den følsomhed, specificitet og nøjagtighed af denne model er opsummeret i tabel 5.

De 27 metabolitter valgt i træningssættet (tabel 2) og den etablerede forudsigelse model blev undersøgt ved hjælp af validering sæt, som bestod af patienter med tyktarmskræft (N = 59) og raske frivillige (N = 63) (tabel 1, tabel S2). Med hensyn til de 27 metabolitter, blev den følsomhed, specificitet og nøjagtighed træningssættet delvist korreleret med de valideringen sæt, og korrelationskoefficienterne for disse parametre var 0,425, 0,655, og 0,587 henholdsvis (figur S2). Ingen af ​​metabolitterne viste høj følsomhed, specificitet og nøjagtighed værdier (tabel 2). Tværtimod når valideringen sæt blev anvendt følsomhed, specificitet og nøjagtighed af forudsigelsen model var 83,1%, 81,0% og 82,0%, henholdsvis, og disse værdier var næsten den samme som dem, der opnås med træningssættet (tabel 5). Derudover modellen vises også høj følsomhed til detektering stadium 0-2 kolorektal cancer (82,8%).

Discussion

I denne undersøgelse undersøgte vi en ny screeningsmetode til tidlig diagnose af kolorektal cancer baseret på GC /MS metabolomics. Selv træningssættet omfattede patienter med tidligt tyktarmskræft, såsom fase 0 eller fase 1, forudsigelsen model viste høj AUC (0,9097), følsomhed (85,0%), og nøjagtighed (85,0%) værdier, der var højere end serum tumormarkører (CA19-9 og CEA). Hertil kommer, når valideringen sæt blev brugt modellen også udstillet høj følsomhed for tidligt tarmkræft (83,1%). Tilsammen patogenesen af ​​kolorektal cancer synes at føre til ændringer i niveauerne af en bred vifte af serum metabolitter, selv om disse udsving spænder fra små til store.

Evalueringer af data opnået ved metabolomics skal behandles omhyggeligt. For eksempel blandt de serum metabolitter detekteres af vores GC /MS-baserede metabolomisk systemet blev intradag-og inter-dages afvigelser observeret. For eksempel blev tryptofan koncentrationer observeret i eftermiddag og natten faldt betydeligt i forhold til dem detekteret i morgen (tabel S3 og fig S3), og disse forskelle kan have været på grund af virkningerne af diæt og /eller daglig aktivitet. Tidligere undersøgelser har også vist intra-dag og inter-dage varians i mængderne af visse aminosyrer [10], [11], [12]. Derfor er det vigtigt at evaluere de inter-day og intra-day varianser af serum metabolitniveauer i metabolomiske forskning samt blodprøver før morgenmaden blev anvendt i denne undersøgelse. Desuden bør nøjagtigheden af ​​data opnået ved instrumentel analyse af serumprøver vurderes omhyggeligt, fordi det kan blive påvirket af den anvendte metode. Derfor, for at opdage pålidelige roman metabolit biomarkører, vi beregnede RSD% værdier for serum metabolit niveauer opnået ved GC /MS-analyse og derefter evalueret inter-dage og intra-dag varianser i koncentrationen af ​​hvert serum metabolit. I GC /MS-analyse, er undertiden registreres flere toppe til en bestemt metabolit. For eksempel er der variationer i antallet af TMS molekyler, der binder til bestemte molekyler, og dermed detekteres større og mindre toppe. De mindre toppe kan være ustabile, hvilket kan føre til ukorrekt fortolkning af dataene. Faktisk, i denne undersøgelse RSD% værdier opnået ved at udelade resultaterne for de mindre peak-afledte metabolitter var bedre end dem, der opnås ved hjælp af alle de data: hvornår blev brugt alle data, den procentdel af metabolitter med RSD% værdier på mindre end 20 % og 30% var 68,5% og 86,5%, henholdsvis. I modsætning hertil, når resultaterne for de mindre peak-afledte metabolitter blev udeladt, de var 72,0% og 90,0%, hhv. Således forventes nøjagtig evaluering af data opnået ved metabolomics til at producere nyttige oplysninger. Baseret på disse evalueringer blev 27 metabolitter udvalgt som metabolit biomarkør kandidater, men disse metabolitter viste individuelle AUC-værdierne for 0,6-0,8 og relativt lav følsomhed eller specificitet (tabel 2), hvilket indikerer, at enkelt metabolit biomarkører er ikke praktiske til screening sygdom og /eller diagnose og der kunne være bedre for at opdage kandidater med høj følsomhed og specificitet brugen af ​​flere biomarkører, selvom metabolomisk fremgangsmåder er blevet anvendt i vid udstrækning til at opdage enkelt sygdom biomarkører. Derefter, med henblik på at evaluere anvendeligheden af ​​flere biomarkører til diagnosticering colorektal cancer, multipel logistisk regressionsanalyse ved anvendelse af trinvis variable udvælgelsesmetode (i denne undersøgelse) og principal komponent analyse (PCA) (data ikke vist) blev udført. Desværre fik PCA ikke producere værdifulde resultater. PCA er en analytisk metode til at analysere et reduceret antal variabler; dvs. den er en reduktion dimension teknik, og har ingen afhængige variable. Tværtimod kan multipel logistisk regressionsanalyse med trinvis variabel metode udvælgelse anvendes til at vælge den optimale del af variablerne og kræver afhængige variable. Således kan PCA være uegnet til store undersøgelser, fordi det kan give uventede forskelle mellem grupperne der sammenlignes, selvom overvåget PCA, kan delvis mindste kvadraters diskriminant analyse (PLS-DA), og ortogonale PLS-DA (OPLS-DA) være gælder for fastslå diagnosen modeller, fordi forskelsbehandling af kolorektal kræftpatienter og kontroller blev vist via OPLS-dA [13]

Den etablerede forudsigelse model bestod af 4 metabolitter.; dvs. 2-hydroxybutyrat, asparaginsyre, kynurenin, og cystamin (cysteamin + cystamin). 2-hydroxybutyrat er dannet som et biprodukt under dannelse af α-ketobutyrat via en reaktion katalyseret af lactatdehydrogenase eller α-hydroxybutyrat-dehydrogenase. I en tidligere undersøgelse [13], blev der observeret øget niveau på 2-hydroxysmørsyre i sera af kolorektal kræftpatienter, som er i overensstemmelse med vores resultater. De serum α-hydroxybutyrat-dehydrogenase og total lactatdehydrogenase aktiviteter af patienter med ovariecancer var signifikant højere end de patienter med benign ovarietumor [14], men niveauet af mælkesyre i kolorektal cancer var lavere end hos raske frivillige (tabel S4) . Derfor ville 2-hydroxybutyrat ikke produceres i blodet ved lactatdehydrogenase, men den enzymatiske produktion af 2-hydroxybutyrat ved α-hydroxybutyrat-dehydrogenase kan forårsages i blod og /eller 2-hydroxybutyrat ville secerneres fra cellerne.