PLoS ONE: Transforming Growth Factor Beta receptor 2 (TGFBR2) Ændringer sialyleringen i mikrosatelitter Ustabil (MSI) Tyktarmskræft cellelinje HCT116

Abstrakt

Aberrant glykosylering er et fælles træk ved mange maligniteter, herunder kolorektal kræft (CRC’er ). Ca. 15% af CRC viser mikrosatellit instabilitet (MSI) fænotype, der er forbundet med en høj frekvens af biallele rammeskift mutationer i A10-kodende mononukleotid mikrosatellit af

transformerende vækstfaktor beta receptor 2

(

TGFBR2

) genet. Om og hvordan forringet TGFBR2 signalering i MSI CRC-celler påvirker celleoverfladen glycan mønster er stort set uudforsket. Her anvendte vi den TGFBR2-deficiente MSI koloncarcinomcellelinie HCT116 som modelsystem. Stabile kloner, der giver doxycyclin (dox) -inducerbare udtryk for en enkelt kopi vildtype

TGFBR2

transgen blev genereret ved rekombinase-medieret kassette udveksling (RMCE). I to uafhængige kloner blev dox-inducerbar ekspression af vild-type TGFBR2 protein og rekonstituering af dens signalering funktion vist. Metaboliske mærkning ved hjælp af den tritierede sialsyre forløber

N

acetyl-D-mannosamin (ManNAc) viste et markant fald (-30%) af dets inkorporering i nyligt syntetiserede sialoglycoproteins i en TGFBR2-afhængig måde. Især vi opdaget et signifikant fald i sialylerede SS1-integrin på rekonstitueret TGFBR2 signalering, som ikke har indflydelse SS1-integrin protein omsætning. Især gjorde TGFBR2 rekonstituering ikke påvirke Udskriften niveauer af nogen af ​​de kendte menneskelige sialyltransferaser når undersøges ved real-time RT-PCR-analyse. Disse resultater antyder, at rekonstitueret TGFBR2 signalering i en isogen MSI cellelinie modelsystem kan modulere sialylering af celleoverfladeproteiner såsom SS1-integrin. Desuden vil vores model-system være egnet til at afdække de underliggende molekylære mekanismer i ændret MSI tumor Glycobiology

Henvisning:. Lee J, Ballikaya S, Schönig K, Ball CR, Glimm H, Kopitz J, et al. (2013) transformerende vækstfaktor Beta receptor 2 (TGFBR2) Ændringer sialyleringen i mikrosatelitter Ustabil (MSI) Tyktarmskræft HCT116. PLoS ONE 8 (2): e57074. doi: 10,1371 /journal.pone.0057074

Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, Taiwan

Modtaget: November 17, 2012; Accepteret: 17 Januar 2013; Publiceret: 27 feb 2013

Copyright: © 2013 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Økonomisk støtte blev leveret af DFG (GE592 /6-1) til JK og J. G. og DFG (KFO 227) til C.R.B. og HG De finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

om 15% af arvelige og sporadiske kolorektale tumorer vise den høje frekvens mikrosatellit ustabilitet (heri betegnet MSI) fænotype. MSI manifesterer sig som variationer af talrige korte repetitive sekvenser (mikrosatellitter) forårsaget af tab af normalt DNA mismatch repair (MMR) funktion i disse tumorceller længde. Hvis MSI påvirker kodende mikrosatellitter af udtrykte gener de resulterende læserammeforskydningsmutationer føre til for tidlig translationel terminering og nedsat proteinfunktion [1] – [3]. Et stort antal gener, der huser mikrosatellitter i deres kodende regioner er blevet identificeret og viste sig at være hyppigt påvirket af læserammeforskydningsmutationer i MSI kolorektale tumorer [4] – [7]. Mutationer i et begrænset antal af disse gener antages at drive MSI tumorigenese.

TGFBR2

er en af ​​de mest interessante MSI målgener fordi det er en del af en nøgle signaleringsvej i kolonepitelceller og viste sig at blive inaktiveret ved høj frekvens af biallele rammeforskydningsmutationer i MSI kolorektale tumorer [8]. TGFBR2 er en transmembran serin-threonin-kinase, der er i stand til at undertrykke proliferation og inducerer apoptose og differentiering udløses af transformerende vækstfaktor beta (TGF-ß) aktivering også [9] – [11]. Efter binding af liganden TGF-SS1 dannelsen af ​​en hetero-tetramert receptorkomplekset består af type 1 (TGFBR1) og type 2 (TGFBR2) -receptorer initieres og nedstrøms proteiner, såsom SMAD2 og SMAD3 bliver phosphoryleret [10], [12] . Disse phosphorylerede SMAD proteiner derefter associere med Smad4 og efter translokation til kernen direkte transskription af forskellige målgener som

SMAD7

[13] eller

SERPINE

[14].

Mange proteiner, især celleoverfladeproteiner, er glykosyleret og kræver glycan ændringer for at give normale funktion i celle kommunikation, anerkendelse og vedhæftning. Endvidere har ændret celleoverflade glycosylering blevet impliceret i tumorgenese og metastase [15] – [17]. I coloncancer, blev fundet mRNA-ekspression af forskellige glycosyltransferaser skal øges sammenlignet med tilsvarende normale colon mucosa [18], [19]. Desuden har fucosylering af celleoverfladeproteiner også været impliceret i cancer [20]. Fucosyltransferaser er forbundet med dannelsen af ​​tumorantigener som sialyl-Le

x og -Le

a [21]. Sialinsyre er en vigtig del af glycoproteiner og er blevet korreleret med metastaser [22]. Forskellig positionering af sialinsyre på celleoverfladen fører til maskering eller demaskering af specifikke saccharider, der er vigtige for metastase [23]. Det er blevet påvist, at sialsyre korrelerer med

in vivo

tumorgenicity i CRC HCT116 [24].

SS1-Integrin er et medlem af et stort protein familie af adhæsionsproteiner kendt at være stærkt sialylerede. Integriner er glycoproteiner, der danner hetero-dimer komplekser af a- og ß-underenheder bibringer forskellige ligand affiniteter. Da signalering af integriner er involveret i flere vigtige cellulære processer som omdrejningspunkt vedhæftning og motilitet, har nedsat integrin signalering været impliceret i cancer metastaser [25], [26]. Det er blevet rapporteret, at bindingen af ​​lectinet SNA at sialylerede SS1-integrin forøges i colontumorvæv forhold til normal tyktarmsepitelet [27]. Desuden blev de-sialylering af SS1-integrin vist sig at stimulere dets binding til glycoproteiner af den ekstracellulære matrix [28], [29].

Selvom TGFBR2 signalering er involveret i celle-celle-kommunikation, celleadhæsion og Migration rolle denne vej i glycosyleringsmønster celleoverfladeproteiner er stort set uudforsket. Eksperimentelle beviser foreslået en mulig forbindelse mellem muterede MSI målgener og glycosyleringsmønster ved celleoverfladen [30]. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi TGFBR2-rekonstituerede MSI colorektal cancercellelinie HCT116 som et modelsystem til at analysere TGFBR2-afhængige ændringer i proteinglycosylering. Vi har registreret et fald i den globale sialylering af nyligt syntetiserede proteiner derved omvendt afspejler den øgede sialyleringen observeret i primære kolorektale tumorer. Især vi identificeret TGFBR2 signalering som en modulator af sialyleringen niveauer af SS1-integrin.

Materialer og Metoder

plasmider

S2F-cLM2CG-FRT3 [31] indeholder en tet-styret tovejs transskription enhed til samtidig regulering af de to reportergener ildflue

luciferase

og røde fluorescerende protein

mCherry.

Denne ekspressionskassette er flankeret af to hetero-specifikke sites FLP-anerkendelse, en muteret F3 og en vildtype F websted [32]. For retroviral samling, vi brugte vektorerne pVPack-GP og pVPack-VSV-G (Stratagene). Rekombination blev medieret af enzymet Flpo-rekombinase, der er kodet af plasmidet pCAGGS-Flpo-IRES-Puro opnået fra Michael Hahn (DKFZ, Heidelberg). Plasmidet pE11.F3.HygTK.F [31] koder for et hygromycin B-phosphotransferase-thymidinkinase (HygTK) translationel fusionsprotein blev anvendt til antibiotisk udvælgelse og frembringelse af HCT116-HygTK mester cellelinie. Den retrovirale vektor S2F-cLM2CG-FRT3-TGFBR2 blev genereret ved PCR-amplifikation af vildtype

TGFBR2

cDNA fra ekspressionsplasmidet pcDNA3.1 /His-TGFBR2 [30] anvendelse af primere, der bærer

EcoRI

eller

NotI

(NEB) restriktionssteder (tabel S1) og udskiftning af

EcoRI

/

NotI mCherry

fragment af S2F-cLM2CG-FRT3. Kontrol af korrekt isætning stedet og sekvens af vildtype

TGFBR2

genet blev bekræftet ved DNA-sekvensanalyse.

cellelinier

Alle cellelinjer blev dyrket i DMEM (PAA) suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS Gold (PAA) og 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (PAA) under anvendelse af standardbetingelser. Den parentale CRC HCT116 er blevet købt fra European Collection of Cell Cultures (ECACC). Dette MMR-mangelfuld cellelinje udviser MSI fænotype og er refraktære over for TGF-ß-medieret signalering grund biallele læserammeforskydningsmutationer i A10 kodning mikrosatellit af det endogene

TGFBR2

gen. HCT116 AWE17 (HCT116-Tet-On) cellelinie er en stabilt transficeret derivat af den parentale HCT116 cellelinien giver konstitutiv ekspression af den omvendte transkriptionelle transaktivator (rtTA) og EGFP-proteinet [33]. The HepG2-cellelinjen blev anvendt som en positiv kontrol for SMAD2 signalering. 293T-celler blev opnået fra ATCC. Til signalering eksperimenter blev celler sultet i 17 timer i nærvær og fravær af 1 ug /ml DOX (Sigma) og efterfølgende inkuberet med 10 ng /ml rekombinant TGF-SS1 (Cell Signaling) i 1 time. Transfektionsforsøg blev udført under anvendelse Fugene HD transfektionsreagens ifølge producentens anvisninger (Roche). Antibiotisk selektion blev udført ved anvendelse hygromycin B (Hyg, 100 ug /ml, PAA), puromycin (1,5 ug /ml, Sigma) og ganciclovir (Gan, 40 uM, Roche) for de angivne trin.

Generering af HCT116-TGFBR2 Celler

Vi har anvendt en retroviral tilgang beskrevet tidligere [31]. Kort fortalt, 10

6 293T-celler blev cotransficeret med 3 provirale plasmider [34], [35]. 10

5 HCT116-Tet-On celler (-30% sammenflydning) blev inficeret ved en MOI på 0,01 og 0,05 for at sikre enkelt kopi virus integration. Succesfuld transduceret HCT116-Tet-On-celler blev induceret med 0,2 ug /ml DOX og mCherry-positive celler blev screenet og isoleret ved FACS (On-Off-On). Single mCherry-positive celler blev selekteret for klonal ekspansion (HCT116-mCherry). I det første rekombinationstrin (RMCE), 5 x 10

5 HCT116-mCherry celler blev co-transficeret på 6-brønds plader med 2 ug pE11.F3.HygTK.F plasmid, der bærer en Hyg-TK ekspressionskassetten flankeret af to rekombinationssteder (F3 /F) og 2 ug pCAGGS-Flpo-IRES-Puro (figur 1a). De resulterende HCT116-HygTK mester celle kloner, som er Hyg resistente og følsomme over for Gan (Hyg

r, Gan

s), undergik en anden RMCE resulterer i HCT116-TGFBR2 kloner, der er tillagt dox-inducerbar ekspression af TGFBR2 og luciferase sideløbende (figur 1A). Kvantificering af DOX-inducerbar ekspressionsniveauer blev bestemt ved luciferaseassays.

(A) Skematisk oversigt over rekombination-medieret kassette udveksling (RMCE). Retroviral transduktion blev udført under anvendelse af provirale vektor S2F-cLM2CG-FRT3, der indeholder en tovejs dox promotor (P

tetbi) tillader samtidig ekspression af to markørgener (

luciferase

mCherry

) i HCT116-mCherry kloner. Ekspressionskassetter er flankeret af mutant (F3) og vildtype Flp-rekombinasemålsteder (F), der tillader rettet kassette udveksling via Flpo-rekombinase. Retroviral pakkende signal (Ψ

+) og lange terminale gentagelser (LTR) er vist. (B) Karakterisering af virale integration sites af nrLAM-PCR og sekventering. I den øvre del, klon-specifikke integration websteder og påvirkede genomisk loci (åben læseramme (orf);

Aldehyd dehydrogenase familie 1 medlem L1 Hotel (

ALDH1L1

)) er afbildet. I den nederste del, 5′- og 3′-virale LTR-DNA-sekvenser (små bogstaver) såvel som de flankerende genomiske DNA sekvenser (store bogstaver) er vist.

PCR og sekventering

Standard PCR blev udført ved hjælp af HOT FIREPol DNA Polymerase (Solis Biodyne) med følgende cykelforhold: indledende denaturering 95 ° C 15 min; 35 cykler af 95 ° C denaturering i 30 s, 60 ° C annealing i 30 sekunder, 72 ° C forlængelse i 1 minut og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 2 min. DNA-sekventering blev udført under anvendelse af BigDye Terminator v1.1 sekventeringskit (Invitrogen). Analyse blev udført på en ABI3100 genetisk analysator (Applied Biosystems).

Lineær amplifikation-medieret (LAM) -PCR

Genomisk DNA blev ekstraheret fra cellelinierne ifølge producentens protokol hjælp DNeasy Blood Tissue Kit (Qiagen). Ikke-begrænsende (NR) LAM-PCR blev udført som tidligere beskrevet [36]. Kort fortalt blev 1 ug gDNA afledt fra transducerede cellekloner, der anvendes til lineær forstærkning af vektorgenomet kryds med biotinyleret primer (tabel S1). Efter berigelse af de amplificerede fragmenter via magnetiske perler blev den anden DNA-streng frembringes. Efter ligering af et kendt oligonukleotid til det ukendte del af amplikoner blev to indlejrede eksponentielle PCR’er udført. For yderligere forberedelse af prøverne adaptere blev føjet til begge ender af amplikoner med yderligere eksponentiel PCR at give Roche 454-specifik forstærkning og sekventering. For parallel sekventering af forskellige prøver en 6-10 bp stregkode blev brugt. 40 ng DNA blev amplificeret under anvendelse af følgende PCR program: indledende denaturering i 120 s ved 95 ° C; 12 cyklusser ved 95 ° C i 45 s, 58 ° C i 45 s og 72 ° C i 60 s; endelig forlængelse 300 s ved 72 ° C. Rå LAM-PCR amplicon sekvenser blev adskilt efter den indførte stregkode, yderligere trimmet og tilpasset til det humane genom sekvens ved hjælp BLAT (Assembly februar 2009) [37].

Luciferase Assay

Luciferaseaktivitet blev målt ved Luciferase assay System (Promega) i to eksemplarer ifølge fabrikantens instruktioner og normaliseret til proteinkoncentrationen bestemt ved Bradford-assay (BioRad). Salg

Western blot-analyse

Cellepellets blev resuspenderes i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natrium-deoxycholat, 0,1% SDS, 0,1 mM CaCI

2 og 0,01 mM MgCl

2) . Efter sonikering, inkubering (1 time, 4 ° C) og centrifugering (12.000 g, 20 min, 4 ° C) proteinkoncentrationen af ​​lysatet blev målt ved Bradford-assay. For immunoblotting blev 50 ug protein separeret på 4-12% Bis-Tris-geler (NuPAGE, Invitrogen) og elektroblottet til en nitrocellulosemembran. Efter blokering af membranen i 30 minutter ved stuetemperatur (RT) i 5% skummetmælk /TBST (20 mM Tris-HCI pH 7,5, 0,5 M NaCl og 0,1% Tween-20), de følgende primære antistoffer blev anvendt i blokeringsopløsning: muse-anti-TGFBR2 (sc-17799, Santa Cruz, 1:500, 4 ° C, natten over); muse-anti-ß-actin-(MP Biomedicals; 1:30,000, RT, 1 h); kanin-anti-phospho-SMAD2 (Ser465 /467; Cell Signaling, 1:1000, 4 ° C, natten over); kanin anti-SMAD2 (86F7, Cell Signaling, 1:1000, 4 ° C natten over). Efter adskillige vasketrin (10 min hver ved stuetemperatur) i TBST, blots blev inkuberet med det sekundære antistoffer fåre-anti-muse-IgG HRP (1:5000; GE-Healthcare) og gede-anti-kanin-IgG HRP (1:2500; Promega) i 1 time ved stuetemperatur. Efter tre vasketrin (10 minutter hver ved stuetemperatur) i TBST, blev signalerne detekteret under anvendelse Western Lightning Plus ECL (PerkinElmer).

Real-Time RT-PCR

1 ug totalt RNA var isoleret med RNeasy Kit (Qiagen) og revers transkriberet under anvendelse af oligo-dT-primere og SuperScript II revers transkriptase ifølge fabrikantens protokol (Invitrogen). For real-time revers transkription (RT) -PCR eksperimenter blev specifikke primere (tabel S1 og S2) og PowerSYBR Green Master Mix (Applied Biosystems), der anvendes. Triplikater af forskellige cDNA prøver (-dox versus + DOX) blev analyseret i StepOnePlus termo-cykliseringsapparat (Applied Biosystems) med følgende program: 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Data blev analyseret ved StepOne Software V2.1 (Applied Biosystems). Genekspression blev normaliseret til ekspressionen af ​​reference- gener

GAPDH

hydroxymethylbilane syntase

(

HMBS

).

proliferationsassav

MTS proliferationsassays blev udført tre gange med CellTiter 96 Aqueous kit (Promega) ifølge fabrikantens instruktioner.

Inkorporering af radioaktivt mærkede, monosaccharider

5-10 × 10

4 celler /brønd blev podet i tre eksemplarer på en plade med 6 brønde. Efter 24 timer blev cellerne fodret igen med 2 ml nye medier indeholdende 0,185 MBq af det respektive

3H-mærket saccharid (

3H-ManNAc (

N

– [mannosamin-6-

3H]), [185-370 GBq /mmol] eller

3H-L-fucose (L-6-

3H), [1,48-2,22 TBq /mmol], American Radiolabeled Chemicals, Inc.) og 10 ng /ml TGF-SS1. Celler blev dyrket i nærvær eller fravær af 0,5 ug /ml DOX til opnåelse af en konfluens på 60-80%. Efter 72 timer blev cellerne vasket 3 gange med PBS og skrabet af. Celler blev centrifugeret 5 min ved 1000 g ved stuetemperatur og vasket med PBS. Cellepelleten blev solubiliseret i 400 pi 0,2 N NaOH i 1 time ved 56 ° C. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved Lowry-assay. 1 ug BSA og 400 pi 10% TCA tilsat for at udfælde proteiner ved centrifugering (10 min, 12.000 g, stuetemperatur), og at fjerne ikke-inkorporerede mærkede saccharider. Pelleten blev derefter resuspenderet i 400 pi 1 N NaOH og neutraliseret med 200 pi 2,5 N eddikesyre og blandet med 10 ml scintillationscocktail (Ultima Gold, PerkinElmer). Prøverne blev talt ved hjælp af en væskescintillationstæller analysator (TRI-CARB 2900TR, Packard) og dpm målinger blev udført med automatisk quench korrektion anvender den transformerede Spectral Index of (tSIE /AEC) metode den eksterne Standard /Automatisk Efficiency Control. Resultaterne blev udtrykt som dpm og normaliseret til protein beløb (mg).

radioaktiv mærkning og SS1-Integrin Immunfældning (IP)

For dobbelt mærkning ved hjælp af

35S-L-methionin [37 TBq /mmol] (American Radiolabeled Chemicals, Inc.) og

3H-ManNAc, 1-2 × 10

6-celler blev podet i tre eksemplarer på 10 cm plader. Efter 24 timer blev mediet erstattet med 5 ml nye medier indeholdende 1,11 MBq

3H-ManNAc, 0,37 MBq

35S-L-methionin og 10 ng /ml TGF-SS1. Celler blev dyrket i nærvær eller fravær af 0,5 ug /ml dox. Efter 72 timer blev cellerne vasket 3 gange med PBS og skrabet af. Cellerne blev centrifugeret 5 min ved 1000 g ved 4 ° C og vasket med PBS. Pelleten blev resuspenderet i 150 pi RIPA buffer. Celler blev sonikeret og inkuberet 1 time ved 4 ° C under rotation. Efter centrifugering ved 4 ° C i 30 minutter ved 12.000 g den resulterende lysat blev anvendt til at bestemme proteinkoncentrationen ved Bradford-assay. For SS1-integrin undersøgelsesperioden blev 1,6 mg lysat inkuberet med 1,7 ug SS1-integrin-antistof (P5D2 fra DSHB, Iowa) i et volumen på 300 pi i 2 timer ved 4 ° C. Som en kontrol for uspecifik binding til perlerne, blev hver celleklon inkuberet uden antistoffet i nærvær eller fravær af DOX og tællinger blev trukket fra resultaterne. 25 pi protein A /G agarose (Oncogene) blev vasket 3 gange med 1 ml RIPA-buffer og derefter inkuberet med lysatet og antistoffet natten over ved rotation ved 4 ° C. Perlerne blev vasket 5 gange med 500 pi RIPA buffer og elueret med 2 x 200 pi 1x protein prøvepuffer (106 mM Tris-HCI, 141 mM Tris-base, 2% SDS, 10% glycerol, 0,51 mM EDTA) ved 99 ° C i 5 min. Prøverne blev blandet med 10 ml scintillationscocktail og tælles af en luquid scintillations analysator anvende tSIE /AEC metode. Resultaterne blev udtrykt som dpm. Som en kontrol for uspecifik binding elueringen af ​​undersøgelsesperioden blev analyseret ved SDS-PAGE og efterfølgende farvet med SYPRO-Ruby (Invitrogen). Parallelt hermed blev de tilsvarende bånd detekteret ved Western blotting under anvendelse af en SS1-integrin-antistof (Cell Signaling) (data ikke vist). For pulssporingsforsøg, Celler blev podet og behandles som beskrevet ovenfor, pulseret i 72 timer med 1,11 MBq

35S-L-methionin /5 ml frisk medium og derefter høstet på 5 forskellige tidspunkter (0h, 4h, 8h , 16h, 24h, chase). Efterfølgende blev celler lyseret som beskrevet ovenfor. 1,5 mg lysat blev inkuberet med 1,3 ug SS1-integrin antistof i et totalvolumen på 300 pi RIPA-buffer og roteret i 2 timer ved 4 ° C. Efter tilsætning af protein A /G agarose blev prøver behandlet som beskrevet ovenfor.

Resultater

Generering af doxycyclin-inducerbare HCT116-mCherry Kloner

For at undersøge TGFBR2- afhængige ændringer af proteinglycosylering, søgte vi at generere en MSI colorektal cancer cellelinje model system, der giver inducerbar rekonstituering af TGFBR2 ekspression i en isogen baggrund. Generelt dette system omvendt afspejler situationen af ​​primære MSI colorektale tumorer, der har mistet TGFBR2 ekspression under tumorprogression. Som et første skridt, MSI HCT116-Tet-On, der konstitutivt udtrykker dox-regulerede rtTA [33] blev genetisk modificeret ved transduktion med selvstændige inaktivere retrovirus udtrykker tet-kontrollerede luciferase og mCherry (S2F-cLM2CG-FRT3) ved lav infektionsmultiplicitet (MOI) for at favorisere enkelt integration kopi. Kvantitativ analyse af stabile kloner identificerede to HCT116-mCherry kloner (# 5 og # 22) med 40-70 gange dox-reguleret induktion af reporter genekspression, som bestemt ved luciferaseassays. Identifikation og molekylær karakterisering af retroviral integration sites af nrLAM-PCR og sekventering bekræftede, at kun en enkelt kopi var blevet indsat. Integration af

luciferase-mCherry

ekspressionskassette blev lokaliseret på kromosom 1 (

C1orf159)

for klon # 5 og på kromosom 5 (

ALDH1L1

) for klon # 22, (figur 1B). Vigtigere er, at integrerede ekspressionskassetter ikke ændre væksten af ​​HCT116-mCherry kloner sammenlignet med deres HCT116-Tet-On progenitorer. For at dirigere indsættelse og dox-inducerbare udtryk for

TGFBR2

transgen på netop disse genomiske steder, vi forfulgte en to-trins strategi (figur 1A). I et første rekombinationstrin,

luciferase-mCherry

kassette blev erstattet af en ekspressionskassette kodende for Hyg-TK-fusionsproteinet hvorved der dannes to master cellelinier HCT116-HygTK # 5 og # 22, der tillader integration af ethvert gen af interesse på disse to genomiske loci. Derfor erstattet vi

HygTK

ekspressionskassette i et andet RMCE af en

luciferase-TGFBR2

ekspressionskassette resulterer i HCT116-TGFBR2 klonerne # 5 og # 22, der blev karakteriseret og anvendes til efterfølgende analyser .

Karakterisering af HCT116-TGFBR2 Kloner

Dernæst analyserede vi disse HCT116-TGFBR2 celler i flere detaljer. Luciferase analyse afslørede, at reportergen induktion niveauer, oprindeligt opnået i HCT116-mCherry celler (40-70 gange), også blev påvist i HCT116-TGFBR2 celler. Dette udelukker eventuelle virkninger RMCE funderede eller ekspressionskassetten anvendes på inducerbarhed af vores model system. Desuden, når vi anvendte transkript-specifikke primere i real-time RT-PCR-analyse for at sammenligne ekspressionen af ​​det endogene A9 mutant

TGFBR2

transkript, det transgene A10

TGFBR2

vildtype transkript eller begge transkripter på dox eksponering, ingen ændring i den endogene

TGFBR2

udskrift niveau blev observeret. I stedet dox behandling førte til en stærk induktion af den transgene

TGFBR2

vildtype-transkriptet (figur 2A). For at udelukke, at den rekonstituerede

TGFBR2

vildtype gen kunne have erhvervet tilsvarende inaktiverende mutationer på grund af mangel på DNA MMR funktion i disse celler, vi sekventeret afskrift-specifikke

TGFBR2

cDNA og identificeret udelukkende A9 muterede eller A10 vildtype gentagelser i endogene eller transgene

TGFBR2

udskrifter hhv. Således mutations inaktivering af det rekonstituerede

TGFBR2

transgen i disse MSI og MMR-mangelfulde HCT116-TGFBR2 kloner kunne udelukkes. Ud over disse transcript analyser undersøgte vi også inducerbarheden og funktionaliteten af ​​TGFBR2 protein ved immunoblotting. I fravær af DOX, blev der ikke TGFBR2 protein påvist henviser i nærvær af DOX blev specifikke TGFBR2 proteinbånd med den forventede størrelsesområde (75 kDa) observeret. Hvornår blev udført tidsforløb analyse, TGFBR2 protein niveauer nåede et højdepunkt inden for 6 timer, men faldt efterfølgende indenfor 24 til 48 timer (figur 2B). For bevis for funktionaliteten af ​​den rekonstituerede TGFBR2 protein, vi undersøgte dens signalering evne. Følgelig phosphorylering af SMAD2, den første nedstrøms effektor af TGFBR2 signalering, blev undersøgt ved Western blot-analyse (figur 3A). I fravær af TGFBR2 ekspression (-dox), TGF-SS1 behandling inducerede et basalt niveau af pSMAD2 i både parentale HCT116-Tet-on og HCT116-TGFBR2 celler. Men når TGFBR2 blev induceret (+ DOX) i nærvær af dens ligand, TGF-SS1, en betydelig stigning i pSMAD2 niveauer langt over det basale niveau blev observeret. Desuden har vi analyseret, om disse

TGFBR2

-reconstituted celler er i stand til at regulere transskription af flere kendte TGFBR2 målgener som

SMAD7

SERPINE

. Real-time RT-PCR-analyse afslørede dox-afhængige

SMAD7

SERPINE

opregulering og dermed bekræftet normal signalering aktivitet (figur 3B). Endvidere er proliferation reduceres, når TGF-SS1 signalering fremkaldes i HCT116-TGFBR2 celler efter DOX og TGF-SS1 behandling sammenlignet med HCT116-TGFBR2 celler udsat for TGF-SS1 i fravær af dox. Men spredning forblev upåvirket blandt ikke-induceret (-dox) og induceret (+ dox) forældrenes HCT116-Tet-på celler eller HCT116-TGFBR2 (- /+ dox) celler i fravær af TGF-SS1 ligand (figur S1A). Ingen af ​​disse celler viste nogen morfologiske forandringer (Figur S1B). Samlet viser disse resultater, at begge TGFBR2 kloner udtrykker et funktionelt intakt TGFBR2 protein og udviser korrekt TGFBR2-medieret signalering.

(A) Real-time RT-PCR-analyse af endogen mutant (A9), transgene vildtype (A10 ) eller begge

TGFBR2

udskrifter i fravær og tilstedeværelse af DOX (1 pg /ml) er vist. Resultaterne repræsenterer middelværdien af ​​tre uafhængige observationer ± standardafvigelse. (B) Western blot-analyse, hvilket viser tilstedeværelsen af ​​DOX-inducerbar (1 ug /ml) TGFBR2 ekspression i en tidsafhængig måde. ß-Actin tjente som en belastning kontrol. Data er vist for HCT116-TGFBR2 klon # 5, men gælder også for klon # 22 (data ikke vist).

(A) Phosphorylering af SMAD2 (pSMAD2) blev påvist ved Western blot analyse. Behandling med dox (1 ug /ml) og TGF-SS1 (10 ng /ml) viste højere niveauer af pSMAD2 sammenlignet med celler dyrket i fravær af dox. Den parentale HCT116 cellelinie tjente som negativ kontrol, mens TGF-SS1 responsiv HepG2 celler blev anvendt som positiv kontrol. Total SMAD2 har været brugt som en loading kontrol. (B) Target gentranskription af TGFBR2 signalering. Real-time RT-PCR-forsøg afslørede dox-afhængige

SMAD7

SERPINE

opregulering. Data er vist for HCT116-TGFBR2 klon # 5, men gælder også for klone # 22 (data ikke vist). Værdier repræsenterer hjælp af tre uafhængige eksperimenter ± SD

TGFBR2-afhængige Glycan Ændringer

Da vi ikke afsløre eventuelle ændringer i steady state niveauer af celleoverfladeproteiner ved Lectin-FACS analyse (figur S2) og lectin-Western blotting (fig S3), udførte vi radioaktive mærkningseksperimenter under anvendelse af to uafhængige

3H-mærkede monosaccharider, ManNAc og L-fucose. Med denne tilgang, vi fokuserede vores målinger på nyligt syntetiserede glycoproteiner. I indledende forsøg blev forskellige tidsperioder (24, 48T og 72H) undersøgt. Indarbejdelsen af ​​

3H-ManNAc, en forløber for sialinsyre, steg over tid med en top på omkring 72 timer. Ved dox eksponering og tilsætning af TGF-SS1 i 72 timer, en signifikant reduktion af inkorporeret

3H-ManNAc forekom både TGFBR2 kloner, men ikke i den parentale Tet-On cellelinje (figur 4A). Derfor har vi analyseret alle 20 kendte sialyltransferaser og to sialidaser (Neu1 og Neu3) i realtid RT-PCR på 24, 48 timer og 72 timer efter induktion (tabel S2). Men vi var ikke i stand til at opdage eventuelle ændringer i mRNA-ekspressionsniveauer (figur S4). Re-ekspression af TGFBR2 førte til et signifikant fald i protein fucosylering i en af ​​begge kloner med

3H-L-fucose (figur 4B). Disse resultater antyder, at TGFBR2 regulerer sialylering af

de novo Salg proteiner.

Radioaktive mærkningsforsøg blev udført i nærvær og fravær af DOX (0,5 ug /ml) og ved udsættelse for TGF-SS1 ( 10 ng /ml) i 72 timer. (A) Inkubation med

3H-ManNAc resulterede i en betydelig reduktion af inkorporeret ManNAc i TGFBR2 kloner # 5 og # 22, men ikke i den parentale HCT116-Tet-On-cellelinje. (B) Inkorporering af

3H-L-fucose blev let reduceret i nærvær af DOX i begge TGFBR2 kloner i modsætning til HCT116-Tet-On celler. Værdier repræsenterer middelværdien af ​​tre uafhængige forsøg ± SD

SS1-integrin Ekspression og sialylering

Da det er kendt, at SS1-integrin er en yderst sialylerede protein, hvis ekspression ændres af TGF -ß1 [38], vi næste undersøgt, om SS1-integrin sialylering kan være påvirket af TGFBR2 udtryk og signalering. Baseret på vores observation, at TGFBR2 synes at modulere kun sialylering af

de novo

proteiner, vi udførte radioaktive eksperimenter dobbelt mærkning (

3H-ManNAc og

35S-L-methionin) at bestemme inkorporeringen af sialinsyre og som en kontrol syntesen af ​​SS1-integrin i TGFBR2-inducerede celler (figur 5). Efter mærkning for 72 timer, blev cellerne høstet og SS1-integrin var immun-udfældet. Mens rekonstitueret TGFBR2 signalering førte til forøget ekspression af SS1-integrin mRNA (2 gange) (ikke vist) og protein som bestemt ved metabolisk mærkning (figur 5A), inkorporering af ManNAc viste en TGFBR2-afhængigt fald (figur 5B). Ved at normalisere sialinsyre inkorporering til SS1-integrin syntese virkningen af ​​TGFBR2 på SS1-integrin kunne illustreres mere slående, vist i figur 5C. For at bestemme, om virkningen af ​​TGFBR2 på SS1-integrin ekspression skyldes en virkning af ændret sialylering på SS1-integrin stabilitet blev et pulssporingsforsøg udført. Som angivet i fig 5D halveringstiden af ​​SS1-integrin protein var omkring 16 timer, og denne omsætning forblev uændret i nærvær eller fravær af TGFBR2 ekspression. Samlet set tyder disse data, at TGFBR2 signalering regulerer sialyleringen af ​​

de novo

proteiner i almindelighed og af SS1-integrin især uden at påvirke omsætningen.

(A-C) Dobbelt mærkning af celler med

3H-ManNAc og

35S-L-methionin blev udført i nærvær og fravær af DOX (0,5 ug /ml) og i nærvær af TGF-SS1 (10 ng /ml) i 72 timer.