PLoS ONE: En mDia2 /ROCK Meldefunktioner Axis Regulerer Invasive Egress fra Epithelial kræft i æggestokkene Spheroids

Abstrakt

Multi-cellulære sfæroider er beriget i ascites af epitelial kræft i æggestokkene (OvCa) patienter. De repræsenterer en invasiv og kemoterapi cellulære befolkning grundlæggende for metastatisk spredning. De molekylære mekanismer, der udløser enkelt celle invasiv udgang fra sfæroider forbliver gådefulde. mDia formins er Rho GTPase effektorer, der er vigtige regulatorer af F-actin cytoskeletale dynamik. Vi antager, at mDia2-drevne F-actin dynamik fremmer enkelt celle invasive overgange i klinisk relevante tredimensionelle (3D) OvCa sfæroider. Den aktuelle undersøgelse er en dissektion af bidraget fra F-actin samling faktor mDia2 formin i invasive overgange og bruge en klinisk relevant ovariecancer klumpformet model. Vi viser, at RhoA-instrueret mDia2 aktivitet er nødvendig for stram kugleformet organisation, og berigelse af mDia2 i de invasive cellulære fremspring af kollagen-embedded OVCA429 sfæroider. Nedbrydende mDia2 i ES-2 sphæroider forbedret invasiv udbredelse af enkelte amoeboid-formede celler. Dette står i kontrast sfæroider behandlet med kontrol siRNA, hvor en mesenchymal invasion program fremherskende. Hæmning af anden RhoA effektor, ROCK, havde ingen indvirkning på ES-2 klumpformet dannelse, men dramatisk hæmmet klumpformet invasion gennem induktion af en meget langstrakt morfologi. Samtidig hæmning af ROCK og mDia2 blokeret enkelt celle invasion fra ES-2 sphæroider mere effektivt end hæmning af enten protein alene, hvilket indikerer, at invasive udgang af amoeboid celler fra mDia2-udtømte sphæroider er ROCK-afhængig. Vores resultater indikerer, at multiple GTPase effektorer skal undertrykkes for fuldt blokere invasiv udgang fra kræft i æggestokkene sfæroider. Desuden stramt reguleret samspil mellem ROCK og mDia2 signalveje dikterer invasive kapacitet og typen af ​​invasion program udnyttes af bevægelige sfæroid-afledte ovariecancer celler. Som tab af genet, der koder mDia2,

DRF3,

har været forbundet med kræft progression og metastase, vores resultater sat scenen for forståelsen af ​​molekylære mekanismer involveret i mDia2-afhængig udgang af invasive celler fra primære epiteliale tumorer.

Henvisning: Pettee KM, Dvorak KM, Nestor-Kalinoski AL, Eisenmann KM (2014) En mDia2 /ROCK Meldefunktioner Axis Regulerer invasive Egress fra Epithelial kræft i æggestokkene Spheroids. PLoS ONE 9 (2): e90371. doi: 10,1371 /journal.pone.0090371

Redaktør: Pontus Aspenström, Karolinska Institutet, Sverige

Modtaget: 22 oktober, 2013; Accepteret: 3 feb 2014; Udgivet: 28 februar 2014

Copyright: © 2014 Pettee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af universitetet i Toledo Foundation (KME, ALNK), Department of Defense kræft i æggestokkene Concept Award (KME, OC073269), den DeArce Memorial Endowment Fund til støtte for medicinsk forskning og udvikling (KME), og National Cancer Institute ( KME, ALNK R01CA151632). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene (OvCa) er 5

th hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i amerikanske kvinder. The American Cancer Society forudser 22.000 nye diagnoser og 15.000 dødsfald som følge af epitelial ovariecancer (EOC) i 2012. Celler afledt af æggestokkene overfladeepitelet konto for 90% af den primære OvCa og metastatiske læsioner [1]. Eksfolierede OvCa celler påvises i peritoneale ascites som enkelte celler, små aggregater eller stærkt bestilt og komprimerede flercellede sfæroider [1] – [5]. Komprimerede sfæroider er dårligt forstået invasive og kemoterapi strukturer. Celle-celle sammenvoksninger, støttet delvist af N- og E-cadherin drive dannelse og komprimering af OvCa sfæroider [6]. Det er uklart, hvad specifikke molekylære eller miljømæssige signaler bidrager til invasive overgange i sfæroiderne.

En voksende mængde af beviser tyder på, at kompakte spheroids fremmer OvCa metastaser i bughulen.

In vitro

celler indenfor OvCa sfæroider undergår forankringsuafhængig vækst, opsplitte ved at overholde tredimensionelle (3D) collagen-I geler og invadere underliggende mesotelceller [7] – [9]. Vigtigere, kugleformet dannelse og komprimering direkte korrelerer med invasion [3], [4]. Humane OvCa celler med evnen til at danne kompakte sfæroider

in vitro

kan generere robuste tumorer når injiceres intraperitonealt i immunsvækkede mus. I modsætning hertil ikke-sfæroide dannende celler ikke danne tumorer i mus [10]. Den tilsyneladende sammenhæng mellem dannelsen af ​​kompakte sfæroider og udbredelse af invasive OvCa celler understreger behovet for en bedre forståelse af molekylære mekanismer, der støtter disse processer [11].

Som reaktion på ekstracellulære signaler, kan epitel-afledte kræftceller konvertere til en mesenchymal-lignende fænotype. Dette kan opnås via dissociation af tætte og adherensovergange (AJ), udstationering af enkelte celler fra epitel ark eller 3D strukturer og migration i tilstødende væv (revideret i [12] – [15]). Hallmark cellulære og molekylære forandringer forbundet med epitel-mesenkymale overgang (EMT) og invasion ind i de omkringliggende stroma omfatte tab af E-cadherin udtryk, opregulering af matrix metalloprotease (MMP), aktivering af transkriptionelle regulatorer og vedtagelse af en spindel-lignende, polariseret fibroblastisk morfologi. Under mesenchymale migration, ekspansion af den forreste kant og tilbagetrækning af bagkanten af ​​de motile celler involverer koordinere reguleringen af ​​cortical F-actin-polymerisation og actomyosin sammentrækning. F-actin samling forud sammentrækning fremme udvidelsen af ​​actin-rige fremspring, og ROCK-medieret phosphorylering af myosin let kæde (pMLC) regulerer actomyosin sammentrækning [16].

Formins er dukket op som vigtige regulatorer af F-actin og mikrotubulus cytoskeletale dynamik. Formin familie proteiner er Rho GTPase effektorer. De pattedyr Diaphanous (mDia) -relaterede formins (mDia1-3) har kritiske roller i diverse cellulære aktiviteter, herunder gentranskription, cellecyklusprogression, og membran handel. mDia proteiner også regulere F-actin netværk kritisk for at opretholde integriteten af ​​flercellede epitel strukturer [17] – [22]. For eksempel, udtømning af mDia hæmmer dannelsen af ​​celle-celle kryds i MDCK-celler [23], og ødelægger MCF-7 monolag ved mislocalizing E-cadherin væk fra celle-celle-kontakter [24]. Desuden undertrykke Diaphanous, den mDia homolog i

D. melanogaster,

faldt pMLC på AJs og destabiliserer normale væv grænser og øget celle protrusiveness [25]. Kollektivt, disse data implicerer mDia-Rho signalering akse i organiseringen af ​​komplekse 3D strukturer er vigtige for morfogenese, og potentielt, for tumor progression.

Flere linjer af beviser tyder på, at formins spiller bevarede roller i reguleringen af ​​kræft celle motilitet , invasion og metastase. mDia2 påvirker invasive opførsel af brystcancerceller, hvilket i sidste ende afhænger af MMP og dannelse af actin-rige fremspring kaldet invadopodia [26]. Interaktion af mDia2 med sin negative regulator, DIP [27], fremmer overgang mesenkymale MDA-MB-231 celler i meget bevægelige og invasive ROCK-afhængige amoeboid celler [28]. Ligeledes modulation af mDia2 påvirker også amoeboid invasion og migration i DU145 prostatacancerceller [29], [30]. Et beslægtet formin, mDia1 dirigerer neutrofilkemotaksi [31], [32], celle invasion [33], og T-celle migration og menneskehandel i perifere lymfoide organer [34], [35]. Andre formin familiemedlemmer, herunder isoformer af FRL, FHOD og Formin1, har også været impliceret i reguleringen vandrende plasticitet og omdannelse mellem mesenkymale og amoeboid motilitet i bryst- og anden tumorceller [36] – [41].

gener, der koder mDia eller FMNL /FRL ofte tabt i bryst-, prostata-, tyktarms-, hepatiske carcinomer, og hæmatopoetiske kræft [29], [30], [41], [42]. mDia proteiner også fungere i normalt ovarie samt ovariecancere. Afbrydelse af

Diaphanous

er forbundet med tidlig ovariesvigt [43]. Tab af

DIAPH1 /DRF1

, genet, der koder mDia1, blev vist i en model af OvCa progression [10]. Desuden gener, der koder mDia2 (

DIAPH3 /DRF3

) og formin 1 (

FMN1

) blev nedreguleret i tidligt til sent stadie OvCa celler. Dette var ledsaget af forstyrrelser i F-actin ophobning og stigninger i celle deformerbarhed [44], [45]. Tilsammen de foregående observationer antyder en rolle for mDia-styrede actin dynamik i progression af ovariesyndrom. Det er uklart, om ændringer i aktivering staten mDia indflydelse celle-celle sammenvoksninger at opretholde OvCa kugleformet integritet, eller hvis modulation af mDia dirigerer overgangene der ligger til grund celle invasion i den underliggende mesothelium.

For at udforske disse spørgsmål, vi undersøgte rollen som Rho /mDia signalering i OvCa migration og invasion. Vores resultater viser, at en RhoA /mDia2 /ROCK signalering akse drev invasive overgange i ES-2 OvCa celler i 2D kulturer og en 3D-klumpformet invasion model. Aktivering af RhoA blev forøget under kugleformet dannelse, mens undertrykkelse af mDia2 forstyrret sfæroide arkitektur. I modsætning til virkningerne af mDia2, udtømning af mDia1 havde ingen effekt på dannelsen eller integritet sfæroider. Når mDia2-depleterede sfæroider blev indlejret i kollagen-I-geler, var det muligt at forbedre enkelt celleinvasion gennem en ROCK-afhængig amoeboid overgang. Disse resultater viser den gensidige afhængighed mellem mDia2 og ROCK til fremme af invasive overgange i OvCa sfæroider.

Resultater

Rumlig lokalisering af mDia proteiner i migrere humane OVCA celler

Vi opnåede et panel af humane OvCa cellelinier, der repræsenterer flere kliniske undertyper, herunder serøse og clear cell adenocarcinomer. Nogle af disse cellelinjer danner kompakte sfæroider (OVCA429 og ES-2), mens andre danner løsere honeycomb strukturer (SKOV3) (Figur S1 og [4]). Alle celletyper udtrykte mDia1 og mDia2, uanset sfæroid-dannende evne (figur 1A).

A. mDia1 og mDia2 blev vurderet ved immunopræcipitation og /eller Western blotting i et panel af humane OvCa celler. Tubulin blev blottet som en loading kontrol. B. celleadhæsion til BSA- eller Collagen-I-coatede brønde. Eksperimentet blev udført i tredobbelte brønde og eksperimentet blev gentaget tre gange. p-værdier er BSA vs. collagen-I for hver cellelinie. C. Transwell migration assays blev udført i tredobbelte brønde og eksperimentet blev gentaget tre gange i 5 timer mod SFM eller 20% FBS. MDA-MB-231 humane brystkræftceller er en positiv kontrol migration. p-værdier er for SFM vs. 20% FBS i hver cellelinie. D. Transwell invasion assays blev udført i tredobbelte brønde og eksperimentet blev gentaget tre gange i 24 timer gennem 2 mg /ml kollagen-I-geler mod enten SFM eller 20% FBS. MDA-MB-231 celler er en positiv invasion kontrol. p-værdier er SFM vs. 20% FBS i hver cellelinie. E. OVCA429 celler migreret mod 20% FBS i 5 timer i et Dunn kammer. mDia1, mDia2 og F-actin arkitektur blev visualiseret ved IF. Pil angiver retningen af ​​gradienten. N.S. = Ikke signifikant. Alle fejl barer svarer SDS Vist er repræsentative eksperimenter fra hver analyse.

OVCA panel blev screenet for lim, vandrende og invasive egenskaber (Figur 1, B-D, henholdsvis) for at identificere en meget invasiv , sfæroid-dannende cellelinie. SKOV3, OVCA429 og ES-2 celler var lige klæbemiddel på collagen 2D substrater. Men OVCA429 og ES-2 celler var mere vandrende og invasiv end SKOV-3 linie som reaktion på FBS gradienter. Derfor blev vores resterende undersøgelser udført med enten OVCA429 eller ES-2 celler.

Den rumlige lokalisering af endogene mDia proteiner blev evalueret i migrere OVCA429 celler ved hjælp af en Dunn kammer til at opretholde en stabil FBS gradient. Immunofluorescens (IF) blev udført efter 5 timer migration (figur 1E). Både mDia1 og mDia2 udstillet en polariseret fordeling orienteret mod FBS gradient inden migrere OVCA429 celler (pil angiver gradient placering). mDia1 og mDia2 lokaliseret overvejende til lamellerne, i modsætning til F-actin rige lamellapodia, som tidligere set i migrerende epithelceller [46]. Disse resultater tyder på en mulig rolle for mDia1 og /eller mDia2 stabilisere kortikale actin puljer under OvCa kemotaksi.

Krav om mDia2 i kemotaktisk migration i OVCA429 celler

Vi næste spurgte, om mDia protein aktivitet og /eller ekspression var nødvendige for kemotaktisk migration. Afstanden migreret af transfekterede OVCA429 celler i et Dunn kammer blev kvantificeret ved live-cell tracking. Cellerne blev manipuleret til at udtrykke enten mDia-YFP-fusionsproteiner alene eller forskellige kombinationer af kontrol YFP vektor og FLAG-mærkede proteiner. mDia overekspression blev valideret ved Western blotting (figur 2A). Celler, der udtrykker dominant-negative YFP-mDia-FH2ΔN, som forstyrrer både mDia1 og mDia2-drevne F-actin forsamling, [34], [47], [48] migrerede dårligt forhold til YFP kontrol. Omvendt celler, der udtrykker den konstitutivt aktiveret mDia2 M1041A [49], hvor autoinhibited tilstand er lettet, udstillet øget migration i forhold til YFP + 3XFLAG tom vektor kontrol. mDia1 overekspression ændrede ikke cellemigration i forhold til tomme vektor kontrol. Disse data antyder, at mDia2 autohæmning skal frigives, for effektiv cellemigrering at forekomme. I den næste række undersøgelser, blev rollen som mDia2 i kemotaktisk migration vurderet ved såning mDia2-udtømte OVCA429 celler i transbrøndene. Mens lipid- og kontrol siRNA-behandlede celler robust migrerede mod FBS (i forhold til serumfrie kontrolbrønde) blev migration signifikant reduceret i mDia2-depleterede celler (figur 2C). Tilsammen indikerer disse data, at mDia2 ekspression og /eller aktivitet er påkrævet for optimal kemotaktisk migration af OVCA429 celler.

A. Transficerede OVCA429 migreret til 5% FBS. Levende encellede sporing af transficerede celler blev udført, og den samlede afstand migreret beregnet. Mindst 10 celler blev sporet pr tilstand. p-værdier, der er anført beregnes i forhold til de respektive tomme vektor kontrol. B. OVCA429 celler blev transficeret med lipid kun, kontrol siRNA eller siRNA rettet mod mDia2 ved stigende koncentrationer (25, 50, 100 nM, betegnet med kiler) for enten 72 eller 96 timer. mDia2 depletering blev bekræftet ved Western blot. C. OVCA429 celler blev transficeret med 100 nM siRNA i 72 timer, og transwell migration assays udført i 5 timer til en SFM eller 10% FBS. Assayet blev udført i tredobbelte brønde og eksperimentet blev gentaget tre gange. Et repræsentativt eksperiment er vist. p-værdi vist er 10% FBS behandlede kontrol vs. mDia2-forarmet celler. Alle fejl barer svarer SDS for at repræsentativt eksperiment.

Den RhoA /mDia2 signalering akse i dannelse af kompakte OvCa spheroids

Rho-responsive mDia proteiner kan regulere celle-celle-kontakter og fremme enkelt cellemotilitet [18], [26] – [28], [49]. Vi næste afgjort, om RhoA /mDia2 signalering akse var involveret i OvCa klumpformet formation. ES-2-celler hurtigt dannet stærkt komprimerede sfæroider (fig S1) og blev anvendt til de resterende undersøgelser. Kravet om Rho GTPase aktivitet i sfæroid-dannelse blev testet ved at udsætte ES-2-celler til stigende koncentrationer (0,5-2,0 ug /ml) af C3 transferase, en inhibitor af RhoA-C. Som vist i figur S2A, C3-behandlede sfæroider blev mere løst organiseret og mindre sammenpresset i forhold til vehikelbehandlede kontroller. Da tidligere arbejde har vist, at de samlede niveauer af RhoA øges i sfæroider afledt af leverkarcinom [50], vi næste bad, hvis der sker ændringer i RhoA aktivitet sammenholdt med dannelsen af ​​ES-2 sfæroider. Sfæroider blev dannet fra 500 celler inden for 24 timer (figur 3A). RhoA og udtryk for dens downstream effektorer, mDia1 og mDia2 blev derefter evalueret i lysater fra cellemonolag og samlede sfæroider høstet mellem 24-120 timer. Samlet set mDia2 niveauer faldt i sfæroiderne forhold til monolag. Inden for de sfæroide populationer, blev der observeret tidsafhængige forskelle i mDia2 ekspression, med lidt lavere niveauer blev konstateret i 72 og 96 h sfæroider, i forhold til 24, 48 og 120 timer sfæroider (figurerne 3B og S3A). I modsætning til mDia2, blev niveauerne af mDia1 forøget i sfæroiderne forhold til monolag. I sfæroiderne faldt mDia1 smule fra 24 t gennem 120 timer (figur 3B og S3B). Total RhoA niveauer faldt også i sfæroiderne, i forhold til monolag. Alligevel RhoA niveauer dramatisk inddrives ved 120 timers klumpformet dannelse (figur 3B og S3C). Da interaktionen af ​​RhoA med sine nedstrømseffektorer (såsom mDia eller ROCK) er afhængig af aktivering af GTP-bindende, vi næste kvantificeret niveauerne af aktiv GTP-bundne RhoA i sfæroider af G-LISA. Mængden af ​​RhoA-GTP blev signifikant forøget i sfæroider dannet i 48-120 timer sammenlignet med ikke-stimulerede ES-2 cellemonolag, der nærmer sig observeret i monolag blev behandlet med en kendt RhoA aktivator, lysophosphatidsyre (LPA) (figur 3C). Derfor er de overordnede niveauer af RhoA aktivering forbedret på klumpformet modning.

A. ES-2 sfæroider afbildet af lysfeltmikroskopi. Scale bar = 250 um. (Bemærk: ude af fokus plade-coating imaging artefakt og /eller kondens i uregelmæssige plastplader set her er fælles for BF billeddannelse). B. Lysater fra ES-2 monolag eller sfæroider blev Western-blottet efter de angivne tidspunkter. C. RhoA G-Lisas blev udført ved ubehandlede eller LPA-behandlede ES-2-monolag, eller sfæroider. p-værdier er i forhold til ubehandlede monolag. Eksperimentet blev udført i firdobbelte brønde, og forsøget blev derefter gentaget tre gange. Data samlet fra 3 forsøg er vist. p-værdier er vist ovenfor barer og er i forhold til ubehandlede monolag kontroller. D. Spheroids dannet i 72 timer blev indlejret, faste og mDia2 visualiseret ved konfokal mikroskopi. Billeder blev opnået ved hjælp af en 20 × mål med 3D-gengivelse af serielle skiver. Bar = 25 um. Åbne pile angiver områder af overlap, mens lukkede pile angiver en sammenstilling af F-actin og mDia2. Alle fejl barer svarer SDS for at repræsentativt forsøg, medmindre noteret.

Som et første skridt i retning af at bestemme, om RhoA-afhængig aktivering af mDia2 kan påvirke dannelsen af ​​celle-celle vejkryds, vi næste spurgte, om mDia2 og F-actin er co-lokaliseret i sfæroider ved celle-celle vejkryds (Figur 3D). Sfæroider dannet i 72 timer afslørede distinkte F-actin-beriget celle-celle kryds med punktformet mDia2 underliggende /proximalt til disse knudepunkter (fyldte pilespids). I nogle kryds, mDia2 syntes at co-lokalisere med F-actin (ubesatte pilespids). Dette tyder på en potentiel rolle for mDia2 i regulering af F-actin dynamik, der er nødvendige for udvikling eller vedligeholdelse af celle-celle vejkryds.

mDia2 udtynding fører til dannelsen af ​​mindre, uorganiserede sfæroider

For yderligere at evaluere rolle mDia proteiner i æggestokkene kugleformet dannelse /integritet, anvendte vi et RNA interferens strategi. Robust siRNA-medieret knockdown af enten mDia2 eller mDia1 valideret gennem 120 h i monolagskulturer, med lille opsving med 144 h (figur 4A og S4). Sfæroider blev dannet af monolag celler 72 timer efter siRNA behandling. Sfæroid diametre blev derefter målt 24-48 timer senere (96-120 h total siRNA behandling). mDia2 udtømning ved 48 timer resulterede i en beskeden, men statistisk signifikant fald (10-20%) i forhold sfæroide diameter til kontrol siRNA behandling. Lignende resultater blev opnået, når mDia2 blev udtømt med siRNA puljer eller individuel siRNA rettet mod mDia2 (figur S4), selv om undertrykkelsen af ​​mDia2 udtryk med puljet siRNA var mere konsekvent og vedholdende. Derfor blev alle efterfølgende undersøgelser udført under anvendelse af poolede siRNA. Ud over den lille fald i sfæroid diameter, mDia2-depleterede ES-2 sfæroider var synligt mindre organiseret med ujævne kanter og nogle enkelte celler løst fastgjort til kanterne. En lignende uorganiserede kugleformet fænotype skyldes tilsætning af en mDia1 /mDia2 FH2 inhibitor, SMIFH2 (fig S5) [51]. Der resultater tilskrives mDia2 udtømning, som mDia1 udtømning havde ingen effekt på klumpformet størrelse (figur 4B, C).

A. siRNA-medieret mDia1 (øvre) eller mDia2 (lavere) knockdowns blev udført på ES-2 monolag (Bemærk: ude af fokus plade-belægning imaging artefakt /kondens i uregelmæssige plastplader set her er fælles for BF billeddannelse). B-C. Efter 72 timer post-siRNA eller kontrolbehandling blev sfæroider dannet og diametre målt under lysfeltmikroskopi 48 timer senere (120 timer efter siRNA behandling). Bar = 100 um. Mindst 30 sfæroider blev målt for hver betingelse. p-værdier er anført ovenfor, barer og er i forhold til at styre siRNA sfæroider. D-E. ES-2-monolag var ubehandlet eller behandlet med de udpegede siRNA’er i 48 timer, sfæroider dannet i yderligere 48 timer, og Western blots eller RhoA G-Lisas udføres på lysater. LPA er en positiv kontrol for RhoA aktivering. G-LISA forsøg blev udført to gange, fire gange, og kombineret data er vist med p-værdier er anført ved siden af ​​søjler. P-værdier er i forhold til enten ubehandlede eller kontrol siRNA-behandlede sfæroider, som bemærket. F. Ubehandlet (UT), blev lipid kun eller siRNA-medieret kontrol- og mDia2 knockdowns udføres på ES-2 monolag for 72 timer og pMLC2 niveauer vurderes af Western blotting. G. Kontrol og mDia2 knockdowns blev udført i 72 timer, og sfæroider dannet. Sfæroider blev opdelt på de angivne tidspunkter efter dannelse og celler talt. Forsøget blev gentaget 5 gange. Et repræsentativt eksperiment er vist. Fejlsøjler svarer SDS fra et repræsentativt eksperiment.

En mulig forklaring på den lidt mindre størrelse af ES-2 sfæroider kunne omfatte formindsket celleproliferation, nedsat gennemsnitlig cellestørrelse, Cellefrigørelse eller større sfæroid komprimering via øget RhoA-dirigeret pMLC2 aktivitet. Vi bestemt derfor hvis RhoA-GTP niveauer blev ændret i mDia2-forarmet sphæroider. mDia2 udtømning blev valideret i sfæroider dannet for 24-48 timer (siRNA behandling for 72-96 h) (figur 4D). På 96 timer efter siRNA behandling, RhoA-GTP aktivitet var upåvirket i kontrol og mDia2-udtømte sfæroider (Figur 4E). I overensstemmelse med denne observation, pMLC2 forblev uændret i cellemonolag (Figur 4F). Desuden har mDia2 udtømning ikke ændre de cellulære numre inden opdelt sfæroider (Figur 4G). Dette indikerer, at hverken celledeling eller tab af de-levet celler var eneansvarlig for den mindre klumpformet størrelse. Det tyder også på, at mens siRNA-medieret depletion af mDia2 forårsager en mere uorganiseret og uregelmæssig kugleformet samling, den resterende mDia2 proteinet sandsynligvis tilstrækkelig til at opretholde både RhoA-medieret kontraktilitet og cellulær proliferation. Sidstnævnte koncept er konsistent med en tidligere undersøgelse af mDia1 i T-celleaktivering, hvor lave niveauer af mDia proteiner syntes at være tilstrækkelig til at opretholde nogle cellulære processer (

f.eks

., F-actin akkumulering vs. mikrotubulusdynamik) , mens samtidigt forringe andre funktioner [52].

mDia2 udtømning forbedrer ES-2 klumpformet invasion via en amoeboid overgang

for at vurdere, om de RhoA /mDia2 akse funktioner i klumpformet invasion, ES-2 sfæroider blev indlejret i kollagen ved (T0) og fik lov til at invadere gennem 168 timer (figur 5A). Et hurtigt fremme foran invasive celler optrådte ved 24 timer, og gelkontraktion var omfattende nok til at rippe geler indenfor 72 timer. Sfæroid invasion blev målt ved at trække et område af interesse omkring omkredsen af ​​den invasive front, hvilket omfattede mindst 95% af invasive celler (som bestemt ved fluorescens mærkning). Invasion afhang Rho-GTPaser, som den invasive fronten blev markant reduceret i ES-2 sfæroider, der blev dyrket og indlejret i nærvær af C3 transferase, afhængigt af køretøjets kontrol-behandlede sfæroider (figur S2, B og C). Da Rho rettede mDia proteiner drev invasion i forskellige epitel-afledte cancerceller [26], [29], [30], vi visualiseret den rumlige lokalisering af mDia proteiner i faste invasive ES-2 sfæroider. mDia2 blev fordelt i et polariseret mønster, med berigelse ved sfæroide kanter, hvor invasive celler aura ind i collagen (figur 5B). Ved højere forstørrelse af den invasive front var mDia2 dramatisk lokaliseret til aflange strukturer ligner tubulated endosomer [53], som udvidet gennem de lange fremspring af mesenkymale celler. Interessant, mDia1 var for det meste nukleare i invaderende celler, i overensstemmelse med tidligere rapporter for nuklear aktiveret mDia1 lede SRF-medierede F-actin dynamik i kernen [54]. Vi observerede flere cellulære morfologier i invasive celler i collagen, herunder sfæriske amoeboid celler (~ 40% invaderende celler), og aflange, polariserede mesenkymale celler (-60% invaderende celler) migrerer i strenge (data ikke vist). Interessant invasive sfæroider reproducerbart (ved hjælp af flere primære antistoffer med forskellig vært og kommercielle afledninger) viste distinkt, punktformet mDia2 farvning i matrixen (figur 5C, og data ikke vist). Tidligere blev mDia proteiner påvist i pro-migrerende OvCa-afledte mikropartikler [55] og mDia2 instrueret pro-vandrende oncosome dannelse i prostata kræftceller [29]. Biokemiske undersøgelser er i øjeblikket på at karakterisere de mDia2-berigede ekstracellulære partikler i invaderende OvCa sfæroider.

A. Sfæroider blev dannet først i 48-I-geler, og afbildes af lysfeltmikroskopi efter de udpegede tidspunkter. Bar = 150 um. B. Spheroids blev dannet i 72 timer, indlejret i kollagen I geler og fik lov til at invadere i 24 timer. Sfæroider blev fikseret og IF udført for mDia1, mDia2 og F-actin. Bar = 100 um. C. Højere forstørrelse billede (63 ×) af invaderende celler fra den udpegede ROI i B. mDia1, mDia2, og F-actin blev visualiseret ved konfokal mikroskopi. Bar = 25 um. D. Efter 56 timer post-siRNA behandling blev sfæroider dannet og indlejret i kollagen ved 104 timer efter siRNA behandling. Arealet for ROI trukket svarende til 95% af invasive celler blev beregnet for 0 og 18 timer efter invasion (122 timer efter siRNA behandling). Repræsentative sphæroider på 4X er vist farvet for phalloidin og billeder kontrastforbedret. Bar = 100 um. Mindst 30 sfæroider blev målt for hver betingelse. p-værdier er vist ovenfor histogrammet og er i forhold til invasion på 18 timer til enten lipid eller kontrol behandlet sfæroider. E. Forlængelse indeks blev beregnet for invasive celler fra D. Mindst 30 invasive celler blev målt per tilstand. Repræsentativ phalloidin-farvning er vist. Bar = 25 um. EI 2 (stiplet linie) anses mesenchymal celletype. p-værdier er vist ovenfor plottet og er i forhold til invasion på 18 timer til enten lipid eller kontrol behandlet sfæroider. Alle fejl barer svarer SDS fra et repræsentativt eksperiment.

For at vurdere betydningen af ​​mDia i enkelt celle invasion, vi målte den invasive område af indlejrede mDia1 eller mDia2-udtømte ES2 sfæroider efter 0 timer (104 h post-knockdown) og 18 timer (122 timer efter knockdown). Ubehandlede og kontrol siRNA-behandlede sfæroider robust invaderede collagenmatrix inden 20 timer. Men mDia2-udtømte sphæroider afslørede markant forbedret invasion i forhold til kontroller (figur 5D og figur S4C), på trods af deres beskedne mindre størrelse på indlejring (figur 4C). Omvendt mDia1-udtømte sphæroider invaderet i samme omfang som kontrol sfæroider (Figur S6), hvilket indikerer, at mDia1 ikke spiller en væsentlig rolle i OvCa klumpformet invasion. Da ændringer i mDia2 ekspression og /eller funktion i forbindelse med amoeboid overgange [27] – [29] beregnede vi forlængelses indekser (El) i de invasive celler afledt af sfæroiderne ved at dividere den lange akse af cellen ved den korte akse; En EI på 2 eller mere indikerer en aflang mesenchymale form, mens en EI på mindre end 2 angiver en mere fremtrædende afrundet, amoeboid fænotype. Resultaterne indikerer, at i sfæroiderne hvor mDia2 udtømning forbedrede invasion, de invasive celler var overvejende amoeboid i form i forhold til ubehandlede og styre siRNA-behandlede sfæroider (figur 5E).

ROCK understøtter både mesenkymale og amoeboid 3D motilitet programmer i invasive ES-2 sfæroider

Amoeboid overgange kan involvere Rho-rettet ROCK signalering til direkte kontraktilitet [56], [57]. ROCK antagoniserer også mDia proteiner med hensyn til opretholdelse af celle-celle kryds i 2D monolag [18]. Men samspillet mellem ROCK og mDia proteiner for at opretholde celle-celle vejkryds i 3D-strukturer, såsom OvCa sfæroider er uklar. Vi vurderede således sin rolle ROCK aktivitet i sfæroide formation. Vi blokeret ROCK aktivitet ved behandling sfæroider med den specifikke inhibitor, Y27632. Sfæroid størrelse blev let reduceret gennem 48 timer af behandlingen (figur 6A), hvilket antyder, at ROCK /myosin-medieret tværbinding af mDia-regulerede F-actin kan spille en rolle i sfæroid formation. Hæmning af ROCK dramatisk undertrykt klumpformet invasion i forhold til kontrol (figur 6B), i overensstemmelse med tidligere undersøgelser implicerer ROCK i blebbing af kolorektal [58] og Caov3 æggestokkene kræft monolag celler [59]. En påfaldende overdrevet mesenkymale overgang dominerede i de få celler befolker beskedne invasive front i celler behandlet med ROCK hæmmer (figur 6C), hvilket indikerer et krav om ROCK effektivt direkte cellulære kontraktilitet i både amoeboid og mesenkymale invasion programmer.

A. Sfæroider blev dannet i nærvær af køretøjet eller 90 uM Y27632 i de angivne tidsrum. Sfæroide diametre blev derefter målt i mindst 30 sfæroider ved 10 ×. Bar = 100 um. p-værdier er vist ovenfor plottet og er kontrol H

20-behandlede sphæroider. B. Spheroids blev dannet i 48 h i overværelse af Y27632, og derefter indlejret i kollagen-I for 0-48 timer i nærværelse af køretøjet eller Y27632. Invasive fronter blev målt på hvert tidspunkt i mindst 30 sfæroider pr tilstand. Bar = 400 um. Repræsentative sfæroider på 4 × er vist farvet for phalloidin og billeder kontrastforbedret. P-værdier er angivet over grafen og er i forhold til at styre H

20-behandlede sphæroider. C. Forlængelse indeks blev beregnet for invasive celler i kollagengeler vist i B. EI 2 (stiplet linie) blev anset mesenchymal celletype. Mindst 30 celler blev målt pr tilstand.