PLoS ONE: Søst Hæmmer Prostata Cancer Invasion

Abstrakt

inhibitorer af Wnt signalering har vist sig at være involveret i prostatakræft (PC) metastase; dog rolle Sclerostin (Sost) er endnu ikke blevet undersøgt. Her viser vi, at forhøjet Wnt signalering afledt Sost deficiente osteoblaster fremmer PC invasion, mens rhSOST har en hæmmende virkning. I modsætning hertil rhDKK1 fremmer PC forlængelse og filopodia dannelse, morfologiske ændringer er karakteristiske for en invasiv fænotype. Endvidere blev rhDKK1 fundet at aktivere kanoniske Wnt signalering i PC3-celler, hvilket antyder, at Sost og DKK1 har modstående roller på Wnt signalering i denne sammenhæng. Genekspressionsanalyse af PC3-celler co-dyrket med obs udviser varierende mængder af Wnt signalering identificeres CRIM1 som en af ​​de transkripter opregulerede under meget invasive betingelser. Vi fandt CRIM1 overekspression til også fremme celle-invasion. Disse resultater tyder på, at knogle-afledte Wnt signalering kan øge PC tropisme ved at fremme CRIM1 udtryk og lette cancercelleinvasion og vedhæftning til knogle. Vi konkluderede, at Søst og DKK1 har modsatrettede effekter på PC3 celleinvasion og at knogle-afledt Wnt signalering positivt bidrager til invasive fænotyper af PC3 celler ved at aktivere CRIM1 udtryk og lette PC-OB fysisk interaktion. Som sådan undersøgte vi virkningerne af høje koncentrationer af Sost

in vivo

. Vi fandt, at PC3-celler, der overudtrykker Sost injiceret via halevenen i NSG mus ikke let metastaserer, og dem injiceret intrafemorally havde signifikant reduceret osteolyse, hvilket antyder, at målrette det molekylære knogle miljø kan påvirke knogle metastatisk prognose i kliniske omgivelser.

Henvisning: Hudson BD, Hum NR, Thomas CB, Kohlgrüber A, Sebastian A, Collette NM, et al. (2015) Søst Hæmmer Prostata Cancer Invasion. PLoS ONE 10 (11): e0142058. doi: 10,1371 /journal.pone.0142058

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, UNITED STATES

Modtaget: Januar 21, 2015; Accepteret: 17 okt 2015; Udgivet: November 6, 2015

Copyright: © 2015 Hudson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

data Tilgængelighed: Microarray data er offentligt tilgængelig på NCBI ved tiltrædelsen nummer GSE56582

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institute of Health Grant No. DK075730 og P41MI03483 Lawrence Livermore National Laboratory Grant No. LDRD-10-ERD-020. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PC) er den hyppigst diagnosticerede kræft og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt mænd i USA. Hvis opdages på et tidligt tidspunkt er prognosen ganske gunstige; imidlertid aggressive former for metastatisk PC spredes primært skelettet [1]. Knogletumorer forårsage stor smerte, fremme frakturer, og i sidste ende repræsenterer den vigtigste årsag til sygdom hos patienter, der lider af avanceret PC, med en incidens 70% dokumenteret ved obduktion [2]. De fleste patienter med avanceret PC vil opleve store komplikationer fra knoglemetastaser kendetegnet ved en blanding af osteoblastiske og osteolytiske læsioner, hvori den osteoblastiske komponent oftest dominerer. Det er blevet en hypotese, at knoglen mikromiljø er en stor bidragyder til pc’en metastatiske proces gennem udskillelsen af ​​parakrine faktorer, der tiltrækker, modulerer, fastholde og fremme spredning af PC celler i knoglerne. Derfor kendskab til den lokale knogle mikromiljø er afgørende for forståelsen potentielle muligheder for at forhindre dannelsen af ​​sekundære knogletumorer i PC patienter [3].

Wnt signalering har vist sig at spille mange vigtige roller under fosterudviklingen, orgel og vævshomeostase, og knogle biologi. Aktivering af Wnt /β-catenin signalering forekommer ved binding af Wnt-ligander til 7-transmembrane domæne der spænder over frizzlede receptor koblet med lav densitet lipoprotein receptor-relateret protein 5 og 6 (LRP5 /6) co-receptorer. Intracellulære signaler genereres gennem et protein kompleks, som omfatter Disheveled, Axin og Frat-1, som forstyrrer en GSK3-afhængig protein-kompleks, der normalt inhiberer β-catenin funktion ved at målrette det for nedbrydning. Stabiliseret β-catenin derefter frigives til at translokere til kernen, hvor det interagerer med andre transskriptionelle aktivatorer, såsom T-celle faktor /lymfoid enhancer bindende faktor (TCF /LEF) til at aktivere transkription. Binding af β-catenin efterfølgende fortrænger transkriptionelle co-repressorer bundet til TCF /LEF og rekrutterer transkriptionelle co-aktivatorer som p300 og cAMP responselementet-bindende protein [p300 /CBP]) [4]. Wnt signalering stramt reguleret. Et niveau af kontrol opnås gennem interaktionen af ​​udskilte inhibitorer med ligander eller receptorer til forebyggelse ligand-receptor interaktion. Ligand-blokerende proteiner indbefatter Wnt inhibitorisk faktor 1 (WIF1) og udskilte Frizzled-relaterede proteiner (SFRP). I mellemtiden er receptor hæmning opnås af medlemmer af sclerostin (Søst) og Dickkopf (DKK) familier [4, 5], primært gennem binding til LRP5 /6 co-receptorer.

Wnt funktionsfejl har været impliceret i forskellige skeletal dysplasi og degenerative sygdomme. For eksempel underskudsgivende og få-funktions-mutationer i LRP5 årsag enten lav eller høj knoglemasse [6, 7], og inaktivering af Søst forårsager to hyperosteoses lidelser: sklerosteose [8, 9] og van Buchem sygdom [10, 11]. Et tab af funktion mutation i LRP6 er forbundet med en arvelig sygdom karakteriseret ved osteoporose, koronararteriesygdom, og metabolisk syndrom [12]. Endvidere mutationer i en intracellulær regulator af β-catenin stabilitet, WTX, forårsage osteopathia striata med kraniel sklerose [13, 14], og mutationer i et Wnt coreceptor, FZD9, forårsage Williams-Beuren, et syndrom delvist karakteriseret ved lav knogletæthed [15]. Desuden har flere genom forbindelsesundersøgelser identificeret polymorfismer i Wnt-signalering beslægtede gener forbundet med ændringer i knoglemineraltæthed [16-18]. Således kan selv subtile ændringer i intensiteten, amplitude og varighed af Wnt signalering forstyrre skelet udvikling, knogle remodellering, og knogle regeneration.

Aberrant Wnt signalering er også almindeligt observeret i kræft og betydningen af ​​denne vej stammer fra en første iagttagelse, at tumor suppressor adenomatøs polypose coli (APC) nedregulerer β-catenin. Mens tab af funktion mutationer i Wnt signalering pathway-gener er fælles for flere kræftformer [19], har aktiveringen af ​​Wnt signalering gennem akkumulering af nukleare β-catenin også blevet dokumenteret til PC [5, 20]. Desuden aktivatorer af Wnt signalering er blevet stærkt impliceret i den invasive potentiale af metastatisk cancer: Wnt5a [21], Wnt3a [22] og Wnt11 [23] har alle vist sig at ændre cancer invasion og migration. Inhibitorer af Wnt signalering også blevet omfattende undersøgt. Frzb (PC [24], fibrosarkom [25]) og WIF1 (PC [26] og urinblære kræft [27]), der modulerer Wnt signalering ved at binde direkte til Wnt-ligander, er både kendte hæmmere af kræft invasion og migration. Den mest undersøgte (og omstridt) effekt af en Wnt signalering inhibitor på kræft invasion /metastatisk potentiale er ved receptor-bindende protein, DKK1. DKK1 har vist sig at øge den invasive potentiale af esophageal cancer [28] og DKK1 antistoffer er blevet anvendt klinisk som et mål for passiv immunterapi [29]. Men DKK1 har også vist, at hæmme invasion og migration i tyktarmskræft [30], brystkræft [31], og PC3 celler [32], hvilket indikerer kompleksiteten i at studere dette system

in vitro

. Interessant nok har den virkning, Sost på cancer invasion /metastase aldrig blevet undersøgt. Derfor, i den nuværende papir, vi fokuserede på den rolle, Søst i pc-invasion. Især undersøgte vi effekten af ​​osteoblast-afledte Wnt signalering på PC for at afgøre, om der kræves en direkte virkning af osteoblaster for modulerende PC adfærd.

Materialer og metoder

Dyr

Alt animalsk arbejde blev godkendt af Lawrence Livermore National Laboratory (LLNL) IACUC udvalg. LLNL er en AAALAC akkrediteret institution.

Sost

KO

Lrp5

KO

tidligere beskrevet [33, 34]. KO og C57BL /6J (WT) mus blev opstaldet i standardbetingelser og blev foretaget alle dyreforsøg i henhold til NIH retningslinier for anvendelsen af ​​dyr under godkendte IACUC protokoller fra Lawrence Livermore National Laboratory.

cellelinjer og transfektionsbetingelser

PC3, DU145, C4-2Bm, LNCaP celler opnået fra ATCC blev dyrket i DMEM; HPrEC blev opnået fra Lifeline Cell Technology og dyrket i Lifeline s ProstaLife Medium. Ekspressionsplasmider (pCMV-DKK1, pCMV-Søst, pCMV-CRIM1) blev genereret ved at erstatte reporter genet af pmKate2-N (Evrogen, Moskva, Rusland) med fuld længde cDNA (billede Clones 3508222, 40009485, 8322423). Stabile PC3 transfektioner af pCMV-DKK1, pCMV-Søst, pmKate2-vektor blev udført ved hjælp af Fugene 6 (Promega Corp., Madison, Wi.) I henhold til fabrikantens anvisninger; positive kloner blev bekræftet ved qPCR eller fluorescens. Mouse primære osteoblaster (OB) blev opsamlet enzymatisk fra calvaria af 4-5 dage gamle hvalpe ligner Bellows et al. 1986 [35]. Dissekerede calvaria fri for periosteum blev sekventielt spaltet 5x ved 37 ° C i 4 ml collagenase opløsning (Collagenase 1, 0,625 mg /ml; Collagenase B, 1,875 mg /ml; CaCl

2, 25 mM; i ddH

20 på is) blandet med 1: 2,5 media opløsning (DMEM /F-12, 0,1% BSA, 25 mM Hepes, 37 ° C), og fraktionerne 2-5 blev opsamlet. Isolerede obs blev dyrket i DMEM /F-12 indeholdende 10% FBS og 1% pen /strep.

Canonical Wnt signalering assay

TOPFlash (0,9 ug) Wnt reporter plasmid (M50 Super 8x TOPFlash ) og Renilla luciferase kontrol plasmid (0,1 ug) (RLTK) blev transficeret under anvendelse af 3 pi Fugene HD (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN) ifølge producentens protokol. Efter 24 timer blev mediet i kulturerne skiftet til frisk medium eller medier suppleret med rekombinant protein. Co-kulturer af isolerede mus osteoblaster dyrket på 3 um pore indsatser (BD Falcon, kat # 3181) blev også introduceret til de PC3 celler på dette tidspunkt. Luciferaseaktiviteter både Super 8x TOPFlash og RLTK reportere blev målt under anvendelse af et dobbelt luciferase (Promega Corp.).

Co-kultur invasion assay

Invasion assays blev udført ved anvendelse af et modificeret Boyden kammer (BD Bioscience). Matrigel (BD Bioscience) blev fortyndet 1: 2.5 i iskold DMEM (serum-frit) og 100 pi blev overført til det øvre kammer af en 8 um pore insert (BD Falcon, kat # 3182) og fik lov til at størkne i en inkubator i 2 timer ved 37 ° C. PC-celler blev udpladet på inserter på 2.5X10

4, og obs i 12-brønds plader ved 5×10

4; celler fik lov til frø ON. Efter en 4h inkubation i serumfrie medier blev inserter overført til 12-brønds plade indeholdende obs. Celler blev talt ved 20X på et Zeiss mikroskop efter 48 timer. DU145, C4-2Bm, LNCaP, og HPrEC celler blev talt følgende farvning i 1% krystalviolet (Sigma) (30 min) efterfulgt af gange vask med PBS. Invasion undersøgelser blev udført ved hjælp af vækstfaktorer [rhSOST (R rhDKK1 (R TGF (R PTH (R AGCATAACCCTCGATCAGAACA (rev) Crim 1 primere].

Microarrays Salg

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af et RNeasy Mini Kit ifølge producentens anvisninger (Qiagen). Prøver blev biotin-mærket og hybridiseret på Human Genome U133 Plus 2.0 oligonukleotid arrays (PC3), i henhold til producentens anbefalinger (Affymetrix, Santa Clara, Californien USA). Dataanalyse blev udført som tidligere beskrevet [36].

Immunfarvning og actin-farvning

Immunfluorescerende og phalloidin-TRITC-farvning blev udført på celler fikseret i 4% paraformaldehyd i 15 minutter og permeabiliseret med 0,1 % Triton X-100 i 5 min [anti-CRIM1 (HPA000556, Sigma) ved 1: 100; anti-Active-β-Catenin (05-665, Millipore) ved 1: 1000]. Til farvning for F-actin blev celler inkuberet med 50 pg /ml phalloidin-TRITC (Sigma) i 40 min. Imaging blev udført på Leica DM50000B og Zeiss LSM 510 Meta konfokale mikroskoper. Maksimum fremskrivninger intensitet blev kompileret med ImageJ (NCBI).

Scanning elektron-mikroskopi

PC3 celler (1X10

5) blev podet på 13 mm dækglas, derefter dyrket i 48 timer i serum frie medier med eller uden rekombinant protein. Cellerne blev derefter fikseret i 4% paraformaldehyd og behandles som beskrevet tidligere [37].

xenotransplantat

PC3,

PC3

DKK1

PC3

Sost

celler blev injiceret i halevenen (IV) eller intrafemorally (IF) som tidligere beskrevet [38]. NSG (NOD.Cg-

Prkdc

scid

Il2rg

tm1Wjl

/SzJ) mus, der fik PC celler IV (1X10

6) blev aflivet 10 uger efter injektion og væv (lunge, knogle, hjerte, lever, nyre, milt og hjerne) blev opsamlet og undersøgt for tilstedeværelsen af ​​mikro-tumorer. Mus, der modtog PC celler IF (1×10

5) blev aflivet 4 uger efter injektion lårben blev dissekeret (N = 6), røntgenfotograferet, og knogle volumen af ​​den proximale halvdel af hver femur blev kvantificeret ved mikro-beregnet tomografi (μCT 35, SCANCO, Brüttisellen, Schweiz: energi 55 kVp, intensitet 114 mA, integration tid 900 ms, 10 um nominelt voxel størrelse).

Statistisk analyse

signifikante forskelle blev undersøgt ved hjælp af ANOVA og parret t-test.

post hoc

sammenligninger blev foretaget ved hjælp af Tukey s [39]. Sandsynlighedsværdier 0,05 blev taget som væsentlig. Sandsynlighedsværdier vist i tal svarer til *

s

0,05; **

s

0,01; ***

s

. 0,001

Resultater og Diskussion

Søst hæmmer prostatakræft invasiv

For at undersøge virkningerne af Wnt-hæmmer Sclerostin (Sost ) på den invasive potentiale PC celler, dyrkede vi PC3-celler med rekombinant Sost (rhSOST) og målt deres invasivitet i en matrigel (fig 1A) i forhold til Wnt3a [32], parathyroid-relateret protein (PTHrP) [40], og transformering vækstfaktor beta (TGFp) [41, 42] behandlede PC3s. Vi undersøgte også den Wnt-antagonisten DKK1, som er kendt for enten at fremme eller hæmme cancer invasion [28, 32, 43] i en kontekst-afhængig måde. Wnt3a, PTHrP og TGFp øget PC3 invasive potentiale ved ~ 3 gange (fig 1B) og DKK1 øget invasion med 7 gange i forhold til PC3 alene og 3,5 gange i forhold til Wnt3a (Fig 1B og 1I). I modsætning hertil rhSOST inhiberede PC3 celleinvasion ved ~ 8-fold (Fig 1B og 1J). Den øgede invasionsevne følgende Wnt3a og DKK1 inkubation var konsistent i alle tre PC cellelinier undersøgt [(1) den meget invasive osteolytisk læsion-inducerende PC3; (2) den meget invasive osteoblastiske læsion-inducerende DU-145; (3) de invasive blandede fænotype C4-2Bm prostata cancer cellelinjer]. Desuden rhSOST inhiberede signifikant invasive potentiale PC3 celler og sløvet den Wnt3a-medierede invasivitet af DU145 og C4-2Bm celler (Fig 1C).

A, skematisk fremstilling af invasionen assay. B, invasive potentiale PC3 celler efter 48 timers co-kultur med rekombinante proteiner. C, virkningen af ​​rWNT3a, rDKK1, og rSOST om invasionen af ​​PC3, DU145, og C4-2Bm. D-E, dosisresponskurve af PC3 celler til rSOST eller rDKK1. F-G, Dosisresponskurver af PC3 celleinvasion når enten rDKK1 eller rSOST blev holdt konstant, og den anden blev trinvist forøget. H-K, repræsentative billeder af PC3-mKate celler efter co-dyrkningsbetingelser. Resultater udtrykkes som fold ændring ± SEM. * P 0,5, ** P 0,1, *** P. 0,01

For at bestemme rhSOST dosis respons og serier af konkurrencedygtige hæmning vi udsat PC3 celler til stigende koncentrationer af rhSOST og rhDKK1 og måles invasion. Stigende koncentrationer af rhSOST resulterede i en dosis-afhængigt fald i invasion, med signifikant inhibering forekommende så lavt som 2,5 ng /ml og mætning ved 25 ng /ml (Fig 1D). Tilsvarende rhDKK1 ændres også invasion på en dosis-afhængig måde; maksimal invasionsevne blev observeret ved 50 ng /ml (Fig 1E). For at undersøge, om rhSOST kunne modulere rhDKK1-induceret invasionsevne samdyrket vi PC3-celler med 100 ng /ml rhDKK1 i kombination med stigende mængder af rhSOST. Disse data viste, at rhSOST blunts rhDKK1-induceret invasion selv ved de laveste doser (Fig 1F). Low-end rhSOST anvendte koncentrationer var inden for det forventede fysiologiske område af serum Sost niveauer [44]. I modsætning hertil øger rhDKK1 koncentrationen var kun i stand til at overvinde rhSOST-medieret inhibering ved koncentrationer 200 ng /ml (fig 1G), hvilket antyder, at Sost er en meget kraftig inhibitor af PC3 invasion. Disse rhSOST hæmmende effekter blev også visualiseret i kulturer af PC3 celler, der udtrykker den røde fluorescerende protein, pmKate2 (fig 1J og 1K), hvor rhSOST dramatisk hæmmet DKK1-medieret PC3 invasion (Fig 1I og 1K).

PC3 celler co-dyrket med

Sost

KO

osteoblaster viser øget invasionsevne

Næste vi undersøgt, om de primære osteoblaster (OB) med varierende niveauer af Wnt aktivitet kunne modulere PC3 invasion . Til disse eksperimenter, osteoblaster isoleret fra calvaria af

Sost

knockout (KO) (OB

SostKO

),

Lrp5

KO (OB

Lrp5KO

) eller C57BL /6 N kontrol mus (OB

WT

) blev co-dyrket uden fysisk kontakt med PC3-celler (fig 2A) og invasion blev vurderet både kvantitativt og visuelt. I overensstemmelse med tidligere resultater, OB

WT

co-kultur inducerede en 2-fold stigning i PC3 invasion. OBS mangler

Sost

øget PC3 invasion af 6-fold, mens OBS mangler

Lrp5

receptor ophævet denne effekt, faldende invasion til niveauet for PC3 mono-kulturer. Disse data indikerer, at lav OB-afledte Wnt signalering alene er tilstrækkeligt til at sløve evne OB

WT

at fremme PC3 invasion,

in vitro

(Fig 2B-2F). Svarende til PC3 celler, DU145 og C4-2Bm celler begunstiget også OB

WT

mikromiljø og lettere invaderet i matrigel ved samtidig dyrket med OB

SostKO

( fig 2G og 2H). Desuden OB

Lrp5KO

inhiberede invasivitet af C4-2Bm, men kun lidt sløvet invasivitet af DU145 celler, hvilket antyder, at i forbindelse med denne co-kultur den invasive potentiale DU145 celler kan ikke helt afhængige af Wnt signalering og kan anvende andre molekylære veje (fig 2G og 2H). Hverken relativt ikke-invasiv LNCaP-cellelinie af lymfatisk metastase oprindelse eller de prostata epitelceller (HPrEC) blev påvirket af co-dyrkning med obs (Fig 2I og 2J). Disse data indikerer, at osteophilic PC cellelinjer let moduleres af knoglen mikromiljø og at små ændringer i mængden af ​​OB-afledt Wnt signalering kan ændre deres invasive potentiale,

in vitro

. I modsætning hertil er LNCaP-celler, som ikke let metastaserer til knoglen ikke påvirket af modulerede niveauer af Wnt-signalering i tilstødende osteoblaster, hvilket antyder, at prostatakræft metastase til knogle kræver en gensidig reaktion fremmes af knogle-cancer interaktion.

A, skematisk fremstilling, der viser obs dyrket på bunden af ​​kammeret. B, invasive potentiale PC3 celler mod kontrol obs, obs med forhøjet Wnt signalering og OBS mangler Wnt signalering. C-F, repræsentative billeder af PC3-mKate celler efter co-dyrkningsbetingelser. G-J, invasive potentiale PCA celler med forskellige osteolytisk potentiale mod hinanden OB. Resultater udtrykkes som fold ændring ± SEM. * P 0,5, ** P 0,1, *** P. 0,01

rhDKK1 aktiverer Wnt signalering i PC3 celler

DKK1 og Søst er kendte hæmmere af Wnt signalering i knogle [45], men de har modsatrettede effekter på PC invasion (figur 1B). Vi næste undersøgte staten Wnt signalering i denne co-kultur invasion model. TopFlash reporter udtrykker udskilles Luciferase transficeredes i PC3 celler (PC3

CLucTF

). Wnt3a øget relativ luminescens i en dosis og tid afhængig måde (S1 Fig). Co-kultur af PC3

CLucTF

med OB

WT

eller OB

SostKO

markant øget reporter aktivitet, en effekt blokeres af rhSOST ( fig 3A). Co-kultur med OB

LRP5KO

havde ingen signifikant effekt på Wnt signalering. Disse data tyder på, at pc-celler kan stole på Wnt signalering aktivitet af den omgivende knogle miljø og tab eller gevinst på Wnt signalering i knoglen kan få dybtgående virkninger på Wnt signalering aktivitet i nabolandet /invaderende cancerceller. Selvom initial rhDKK1 behandling undertrykt Wnt reporter aktivitet, er det væsentligt forøget PC3

CLucTF

luciferaseaktivitet 24 timer efter rhDKK1 administration og senere tidspunkter (Fig 3B).

A, TopFlash reporter luciferase assay i PC3-celler co-dyrket med obs. B, TopFlash reporter assay PC3-celler co-dyrket med DKK1. C-J, aktiveret β-catenin (ABC) immunhistokemi i PC3-celler under flere betingelser; grøn (ABC), blå (DAPI). Resultater udtrykkes som fold ændring ± SEM. * P 0,5, ** P 0,1, *** P. 0,01

For at bekræfte de mekanismer, der er involveret i rhDKK1 Wnt agonist aktivitet på TopFlash reporter transgen, vi næste undersøgt niveauer af aktiverede β catenin (ABC) i PC3-celler efter en 48 timers co-kultur, via immuncytokemi. PC3 celler alene udtrykte ubetydelige mængder af ABC (Fig 3C). Administration af rhWnt3a forbedret ABC signal inden både cytoplasmaet og i kernen af ​​PC3-celler (Fig 3D), og denne effekt blev mærkbart hæmmet af rhSOST co-administration (fig 3E). I overensstemmelse med PC3

CLucTF

data, rhDKK1 øget ABC i PC3-celler (Fig 3F). PC3 celler co-dyrket med OB

WT

også øget ABC niveauer (Fig 3G), en effekt kraftigt forbedret i OB

SostKO

co-kulturer (Fig 3H) og formindsket i OB

LrpKO

co-kulturer (fig 3i). Endvidere co-administration af både Wnt3a og DKK1 til PC3-celler resulterede i hyper aktivering af ABC i en undergruppe af PC3-celler, hvilket antyder en synergistisk og additiv virkning på aktiveringen af ​​kanoniske Wnt-signalering i disse celler. Disse resultater understreger betydningen af ​​knoglen mikromiljø på invaderende prostatacancerceller, og evnen af ​​knogle-afledt Wnt signalering at aktivere Wnt-signalering i disse celler. Sammenhængen mellem høje DKK1 niveauer og øget β-catenin-niveauer er i overensstemmelse med tidligere rapporterede data, hvor patient-afledte tumorer med forhøjet DKK1, β-catenin, eller havde var mere tilbøjelige til at have en dårlig hepatocellulært carcinom prognose [46] begge.

filopodia dannelse er steget i DKK1 og CRIM1 behandlede celler

Efter at have fastslået, at Sost-mangelfulde obs eller oBS behandlet med rhDKK1 øge PC3 invasiv vi nærmere de delte molekylære ændringer i disse co-dyrkede PC3 celler gennem transskription analyse. Vi sammenlignede genekspression ændringer i PC3 celler co-dyrket med (1) OB

SostKO

, (2) OB

WT

+ rhDKK1, og (3) OB

WT

+ rhSOST (fig 4A). Vi fandt 132 opreguleres gener og 30 nedreguleret gener i både OB

SostKO

og OB

WT

+ rhDKK1 co-dyrket med PC3 celler (S1 tabel). Blandt disse udskrifter 21 blev opreguleret og 25 blev nedreguleret i OB

WT

+ rhSOST PC3 co-kulturer (S2 tabel). De opreguleres udskrifter i de meget invasive PC3 celler blev beriget for molekyler, der har vist sig at være involveret i regulering af celle form, cellemigration /motilitet, og celleadhæsion. Opreguleres gener inkluderet:

sept7

[47],

myo10

[48],

pKP4

[49],

cnn3

[50],

FGFR2

[51], og

crim1

[52] (figur 4B). Af særlig interesse, den cysteinrige motor neuron protein 1 eller Crim1 er en enkelt-pass (type 1) transmembrane protein, der for nylig er blevet vist at danne kompleks med β-catenin og cadheriner. Crim1 tab af funktion eksperimenter i

Xenopus

afsløret Crim1 at være kritisk for celle-celle adhæsion under neural udvikling [52]. Forhøjede niveauer af β-catenin (fig 3H) ledsaget af forhøjede niveauer af Crim1 (S1 Table) i co-dyrkede PC3 celler førte os til hypotesen, at Crim1 kan opreguleres ved knogle-afledt Wnt signalering og kan være involveret i at fremme celle invasion og eller celleadhæsion.

A, microarray analyser af PC3 celler co-dyrket med OB

SostKO

, OB

WT

+ rhDKK1, og OB

WT

+ rhSOST i forhold til monokulturer; overlay repræsentation af opreguleret (grøn) og nedreguleret (rød) gener. B, repræsentativ liste over opregulerede udskrifter. C, repræsentative billeder af CRIM1 proteinekspression modulation ved rhDKK1 og rhSOST; grøn (CRIM1), blå (DAPI). Resultater udtrykkes som fold ændring ± SEM. * P 0,5, ** P 0,1, *** P 0,01. D, PC3 transficeret med et CMV-Crim1 ekspressionsvektoren var signifikant mere invasive derefter PC3 celler (

s

-værdi 0,006).

For at afgøre, om CRIM1 proteinekspression moduleres af rhDKK1 og rhSOST, i overensstemmelse med de genekspression data, vi kvantificeret den relative fluorescensintensitet af CRIM1 i PC3 celle behandlet med rhDKK1 og rhSOST. Vi fandt rhDKK1 behandlede celler til at være 20% lysere [0,345 (PC3 + ​​hrDKK1) vs 0,285 (PC3) betyder fluorescens /celle], mens rhSOST behandlede PC3 celler 85% lysdæmper [0,038 (PC3 + ​​hrSOST) vs 0,285 (PC3) betyde fluorescens /celle] end ubehandlede PC3-celler (fig 4C). Endvidere overekspression af CRIM1 protein [ 12 fold overekspression som bestemt ved qPCR], i PC3 transficeret med en CMV-Crim1 konstrueret viste en betydelig stigning i invasion (

s

-værdi = 0,006), i transwell assay (fig 4D).

for at undersøge, om virkningerne af DKK1 og CRIM1 om kræft celle invasion og metastase er forbundet med actinfilamenter, undersøgte vi morfologiske ændringer i PC3 celler behandlet med rhDKK1 og rhSOST.

PC3

celler behandlet med DKK1 var aflang, viser fibroblastlignende morfologi med mange flere filopodia fremspring i forhold til enten ubehandlede eller rhSOST behandlede PC3-celler (Fig 5A-5C), som var mere afrundet og havde færre filopodia. Desuden levet både ubehandlede og rhSOST behandlet PC3 celler mindre stærkt til plastoverfladen og tendens til at blive mere klumpet sammen danner aggregater. Morfologisk udseende var i overensstemmelse med den underliggende cytoskeletorganisation; phalloidin-farvning viste forøget actin organisation i rhDKK1 og rhWNT3A behandlet PC3-celler, i forhold til PC3 og rhSOST behandlede celler (Fig 5D-5h). Tilsvarende exogen tilsætning af en secerneret form af CRIM1 fremmes også dannelsen af ​​lamellipodia og filopodia, som visualiseret ved phalloidin-farvede actin i PC3-celler behandlet med CRIM1. Kollektivt, disse resultater viser, at både DKK1 og CRIM1 fremme filopodia dannelse i særdeles invasive PC3 celler, og at denne proces er forbundet med reorganiseringen af ​​actinfilamenter.

AC, repræsentant SEM billeder (1500X) af PC3 celler behandlet med rhDKK1 (b, b), eller rhSOST (C, c). D-H, Immunfluorescensfarvning af PC3-celler behandlet med rhDKK1 (E), rhSOST (F), rhCRIM1 (G) og rhWNT3A (H); anti-CRIM1 (grøn) og rhodamin-konjugeret phalloidin (blå).

Søst overekspression hæmmer metastase og blunts osteolyse

For at bestemme om Søst påvirkninger metastase, NSG mus vi injiceret intravenøst ​​med PC3, PC3

DKK1

eller PC3

Søst

og væv blev undersøgt for tilstedeværelsen af ​​tumorer 10 uger efter injektion. Intravenøs levering af PC3-celler resulterede i en tumor på 80% (8/10 mus) med lunge og nyre er de hyppigste lokaliteter af metastase. PC3

DKK1

celler opførte sig meget ligner PC3 celler, mens PC3

Søst

-injiceret mus havde signifikant lavere metastaser, med kun 1/9 mus (milt) viser synlige makroskopisk metastase ved 10-ugers efter injektion (tabel 1). Disse data antydede, at Sost-induceret hæmning af Wnt signalering reducerer PC3 invasion og metastase,

in vivo

betydeligt. Næste vi undersøgt, om overekspression af

Søst

i PC3 celler reducerer osteolytisk tumordannelse. Ti NSG mus per gruppe fik 5×10

5 PC3, PC3

DKK1

eller PC3

Søst

celler intrafemorally. Fire uger efter injektioner knogle volumen blev kvantificeret ved anvendelse af mikro-CT. Mens alle tre grupper viste knogletab og skader ved den distale sted, hvor nålen blev indsat til at levere de kræftceller, viste scanninger dramatisk tab af knogle i den proksimale femur af PC3 og PC3

DKK1

, men betydeligt mindre knogletab i PC3

Søst

injicerede lårben (fig 6A-6C). For at vurdere knogletab forskelle på grund af osteolyse vi trækkes knoglen volumen af ​​PC injicerede lårben fra den kontralaterale ikke-injicerede lårben og fundet PC3

Søst celler til at fremkalde betydeligt mindre knogletab end PC3 eller PC3

DKK1

. Disse resultater tyder på, at overekspression af Søst i PC3 celler blunts osteolyse og reducerer tumordannelse sats.

Repræsentant femur mikro-CT-scanninger fra

PC3 Hotel (A),

PC3

DKK1

(B) og

PC3

Søst

(C) injiceret NSG mus (N = 6 /gruppe). Knoglevolumen blev kvantificeret til både PC injiceres og ikke-injicerede kontralaterale lårben, og relativ knogletab på grund af osteolyse blev beregnet for hver gruppe ved subtraktion af injiceret (L) fra de ikke-injicerede (R) værdier (D).

PC

Søst

injicerede lårben oplevet betydeligt mindre knogletab på grund af avancerede osteolytiske læsioner (* p 0,05)

Diskussion

i denne rapport undersøgte vi de molekylære mekanismer moduleret af Wnt-signalering, der kan bidrage til den veldokumenterede høj tropisme for prostatakræft til knogle under metastaser. Vi antager, at knoglen afledt Wnt signalering udløser genekspression ændringer i kræftceller, der forbedrer deres tilknytning og homing til knogle samt fremmer knogle maligniteter. For at teste denne hypotese, vi udsat PC celler til Wnt-antagonister DKK1 og Sost, og fundet DKK1 at fremme, og Sost at inhibere PC invasion. Desuden osteoblaster isoleret fra

Sost

knockout mus havde en potent positiv effekt på PC invasion; en virkning, som blev dramatisk sløvet ved tilsætning af rekombinant Sost protein.