PLoS ONE: parathyroideahormonbeslægtet-Protein Fremmer Epithelial-til-Mesenchymale Transition i prostata Cancer

Abstrakt

Parathyreoideahormon-relateret protein (PTHrP) besidder en række fysiologiske og udviklingsmæssige funktioner og er også kendt for at lette progression af mange almindelige kræftformer, især deres skelet invasion, primært ved at øge knogleresorption. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme, om PTHrP kunne fremme epitel-til-mesenchymal overgang (EMT), en proces impliceret i cancer stamceller, der er kritisk involveret i cancer invasion og metastase. EMT blev observeret i DU 145 prostatacancerceller stabilt overudtrykker enten 1-141 eller 1-173 isoform af PTHrP, hvor der var opregulering af Sneglen og vimentin og nedregulering af E-cadherin i forhold til parentale DU 145. Derimod den modsatte virkning blev observeret i PC-3 prostatacancerceller hvor høje niveauer af PTHrP blev slået ned via lentiviral siRNA transduktion. Øget tumorprogression blev observeret i PTHrP-overudtrykkende DU 145-celler, mens nedsat progression blev observeret i PTHrP-knockdown PC-3-celler. PTHrP-overudtrykkende DU 145 dannet større tumorer når de implanteres orthoptopically i nøgne mus og i et tilfælde har resulteret i spinal metastase, en effekt ikke observeret blandt mus injiceret med parentale DU 145-celler. PTHrP-overudtrykkende DU 145-celler forårsagede også signifikant knogleødelæggelse når det injiceres i skinnebenene af nøgne mus, mens parentale DU 145-celler forårsaget lidt til ingen destruktion af knogle. Tilsammen tyder disse resultater, at PTHrP kan arbejde gennem EMT at fremme en aggressiv og metastatisk fænotype i prostatacancer, en vej af betydning i cancer stamceller. Således fortsatte bestræbelser på at belyse de involverede veje i PTHrP-induceret EMT samt at udvikle metoder til specifikt retter sig mod PTHrP signalering kan føre til mere effektive behandlinger for prostatakræft

Henvisning:. Ongkeko WM, Burton D, Kiang A, Abhold E, Kuo SZ, Rahimy E, et al. (2014) parathyroideahormonbeslægtet-Protein Fremmer Epithelial-til-Mesenchymale Transition i prostatakræft. PLoS ONE 9 (1): e85803. doi: 10,1371 /journal.pone.0085803

Redaktør: Seema Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA

Modtaget: Juni 21, 2013; Accepteret: December 2, 2013; Udgivet 22. januar 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Veterans Administration Merit Award (LJ Deftos) støttede projektet (https://www.research.va.gov/services/csrd/merit_review.cfm # .UcI2KPY-UCG). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne vil gerne erklære, at selv om Robert M. Hoffman er tilknyttet AntiCancer, Inc., der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsført produkter og alle forfattere erklærer nogen interessekonflikt.

Introduktion

Parathyreoideahormon-relateret protein (PTHrP) besidder en række fysiologiske og udviklingsmæssige funktioner, men er også kendt for at lette udviklingen af ​​mange cancere, herunder prostatacancer. Vi og andre har tidligere vist, at PTHrP stimulerer prostatakræft cellevækst, invasion og metastase, der opererer via begge parakrine /autokrine og intracrine pathways [1] – [3]. PTHrP er kendt for at aktivere forskellige mitogene pathways herunder MAPK og PI3K /Akt samt veje, der stimulerer skeletale metastaser, en af ​​de mest almindelige livstruende lidelser associeret med cancer [4] – [6] .Secreted PTHrP er kendt for at medierer sine cellulære virkninger via interaktion med G-protein-koblet PTH /PTHrP receptor [7]. Co-ekspression af PTHrP og dens receptor er tidligere blevet identificeret i prostatacancer primære tumorer og deres tilsvarende knoglemetastaser [8]. Derudover har Freemont et al tidligere rapporteret en stigning i ekspression af PTHrP receptor i prostata cancer knoglemetastaser sammenlignet med primære tumorer, hvilket antyder en potentiel rolle af receptoren-medieret vej i dannelsen af ​​knoglemetastaser [9].

epiteliale-til-mesenchymal overgang (EMT) er en proces, hvor epitelceller undergår cytoskeletale og morfologiske ændringer at erhverve en mesenchymal fænotype og er vigtig i normale processer, såsom fibrose [10]. På grund af dens virkninger på celleadhæsion og mobilitet EMT er også kritisk involveret i kræft metastase og invasion [11], [12]. EMT kan karakteriseres ved tab af epitel markører, såsom E-cadherin og forøget ekspression af mesenchymale proteiner herunder vimentin og N-cadherin [13]. Transskriptionsfaktorerne sneglen, Slug and Twist vides at undertrykke E-cadherin ekspression og inducerer EMT [14] – [16]. Andre onkogene pathways herunder Src, Ras, Wnt /β-catenin, PI3K /Akt, MAPK, og TGF-β er alle blevet forbundet med EMT [17]. Flere undersøgelser har vist, at cancerceller bliver mere invasive og metastatiske efter undergår EMT. Desuden har EMT blevet vist at bibringe stamcelle egenskaber til brystcancerceller [18].

Da PTHrP har en rolle i at fremme invasion og metastase i prostatacancer og at EMT er en af ​​de vigtigste regulatorer af disse egenskaber i kræft, det afgørende spørgsmål præsenteres, om PTHrP er i stand til at fremme EMT i kræftceller. PTHrP er blevet vist at inducere EMT i et par sammenhænge, ​​herunder under parietal endoderm dannelse og renal fibrogenese [19], [20], selv om evnen hos PTHrP til at regulere EMT i cancer er forblevet efterforsket. I brystcancer, de pro-metastatiske virkninger af TGF-β, en potent inducer af EMT, har vist sig at være medieret af PTHrP [21]. Tilsammen den eksisterende litteratur tyder på, at reguleringen af ​​EMT af PTHrP i kræft er meget sandsynligt. I denne undersøgelse søgte vi at fastlægge den rolle PTHrP i regulering EMT i prostatacancerceller sammen med invasion og metastase. Etablering af en rolle PTHrP i regulering knoglemetastaser kræft og EMT giver både grundlæggende og kliniske rationaler til at belyse den molekylære mekanisme PTHrP handlinger i mange almindelige kræftformer som prostatakræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

VA IACUC godkendte denne undersøgelse. Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr (NIH publikation nr 85-23) under sikkerhed nummer A3873-01. Dyrene blev holdt under isofluran anæstesi under operationen, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Disse dyr blev nøje observeret, kontrolleres dagligt og aflivet ved de første tegn på ubehag. Tegn på ubehag omfatter eventuelle unormale bevægelser, unormale fodring eller drikke adfærd, manglende selvtillid grooming eller andre unormale adfærd.

Cells

DU 145 og PC-3 humane prostata cancer cellelinjer og blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i monolag i RPMI 1640-medier (MediaTech, Herndon, VA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gemini Bio Products, Woodland, CA) ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 95% luft, 5% CO

2. DU 145-cellelinien blev valgt, fordi det har en lav konstitutiv PTHrP ekspression og ikke vokser eller metastaserer godt i musetumormodeller, i modsætning til PC-3-celler [22] – [24]. PC-3-cellelinjen, som oprindeligt blev isoleret fra en prostata-adenocarcinom, som havde metastaseret til knoglen, har en osteolytisk fænotype i immunkompromitterede musemodeller [22], [25].

Plasmidkonstruktion

PTHrP ekspressionsplasmider anvendt i denne undersøgelse var menneskelige præpro PTHrP1-87, PTHrP1-141, og PTHrP1-173; prepro former blev anvendt til at lette PTHrP sekretion. Konstruktionerne blev retningsbestemt subklonet i PCI-neo ekspressionsvektor (Promega, Madison, WI) og nøjagtigheder alle plasmider blev bekræftet ved DNA-sekventering og stedspecifikke PTHrP immunoassays [23], [26].

PTHrP transfektion og lentiviral-medieret silencing

DU 145 prostataceller blev podet ved en densitet på 2 x 10

4 celler /cm

2 i 12-brønds celledyrkningsskåle og transficeret med 1 ug plasmid per brønd. Individuelle G418-resistente kolonier (800 ug G418 /ml) blev isoleret 21-30 dage senere. De konditionerede medier fra de plukkede cellekolonier blev bedømt for PTHrP ekspression ved stedspecifikke immunassays og PTHrP udtrykkende stabile DU145 celler blev ekspanderet [23], [26]. Det er tidligere blevet vist, at vildtype og vektor-transficerede DU 145 udviser en lignende fænotype [27], [28]. Vildtype parentale DU 145-celler blev således anvendt som en kontrol for RT-qPCR og matrigel invasion eksperimenter, men parallelle forsøg blev udført med en tom vektor-transficerede kontrol derivat. De PC-3 prostata celler undergik en stabil knockdown af PTHrP via lentiviral siRNA. Kontrolceller blev udsat for lentiviral siRNA transduktion med en ikke-targeting sekvens konstrukt.

Kvantitativ bagside-Transskription PCR

Celler blev høstet to dage efter at være passeret ved ca. 70-80% konfluens. Totalt cellelysat blev opsamlet og RNA blev ekstraheret under anvendelse af et RNeasy kit (Qiagen). cDNA blev syntetiseret under anvendelse af Superscript III revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Real-time PCR reaktionsblandinger blev fremstillet under anvendelse Power SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA), og kørt på de 7300 real-time PCR System (Applied Biosystems) under anvendelse af følgende program: 95 ° C i 10 min, 95 ° C i 30 s, og 60 ° C i 1 min, i 40 cykler. Resultater blev analyseret ved anvendelse af sammenligningseksempel ddCt fremgangsmåde og smeltekurver blev udført for at sikre produktets specificitet. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer tekniske og blev gentaget mindst to gange uafhængigt af hinanden. GAPDH genekspression blev målt som endogen kontrol. Primere blev skik bestilt (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL) ved hjælp af følgende sekvenser:

Snail Forward 5′-TCTGAGTGGGTCTGGAGGTG-3 ‘, Snail Reverse 5’CTCTAGGCCCTGGCTGCTAC-3′, GAPDH Forward 5’-CTTCGCTCTCTGCTCCTCC 3 ‘, GAPDH bagside 5′-CAATACGACCAAATCCGTTG 3′, E-cadherin fremadrettet 5’-GGCGGAGAAGAGGACCAGGACT-3 ‘, E-cadherin bagside 5′-TGGCAGGGCGGGGAAGATACC-3′, vimentin Forward 5’- GGAAATGGCTCGTCACCTTCGT-3 ‘, vimentin bagside 5’-AGAAATCCTGCTCTCCTCGCCT-3 ‘.

Immunofluorescens

Cellerne blev trypsiniseret og dyrket på dækglas. Cellerne blev fikseret med 4% paraformaldehyd og blokeret i gedeserum i Dulbeccos phosphatbufret saltopløsning ved stuetemperatur før inkubation med muse-monoklonalt anti-humant vimentin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Celler blev derefter inkuberet med et gede-anti-muse FITC konjugeret sekundært antistof (Chemicon, Temecula, CA) og modfarvet med DAPI. Endelig blev SlowFade Gold antifade reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) anvendes til at montere dækglas på objektglas. Fluorescerende billeder blev opnået ved 40X hjælp Leica DMIRE2 inverteret fluorescens mikroskop og computerprogram Simple PCI blev brugt til billedoptagelse.

Matrigel Invasion Assay

Invasion af PC3 og DU 145 celler blev målt ved hjælp af en Matrigel invasion assay (Becton Dickinson, Bedford, MA). Transwell inserts på 8 um porestørrelse blev coatet med en slutkoncentration på 1 mg /ml Matrigel i koldt serum-frit DMEM. Celler blev trypsinbehandlet, og 500 ml cellesuspension (1 x 10

5 celler /ml) blev tilsat i tre brønde. Den nedre kammer i Transwell blev fyldt med 750 pi dyrkningsmedier indeholdende 0,5% serum som en kemoattraktant og fik lov til at inkubere ved 37 ° C i 48 timer. Invaderende celler på den nedre overflade, der passerede gennem filteret blev fikseret og farvet under anvendelse af krystalviolet i gluteraldehyd og fotograferet. Antallet af de farvede kerner blev talt i en forudbestemt og ensartet afsnit af hver brønd.

Dyr

Seks måneder gammel mand, svær kombineret immundefekt (SCID) mus blev opstaldet i en barriere filter værelse og fodres Purina gnaverfoder ad libitum. Dyrene blev tappet for blod ved afslutningen af ​​forsøget, med en retro-orbital metode.

ortotopisk tumorimplantation

Subkonfluente DU145 og stabilt transficerede DU145-PTHrP (1-173) -GFP-celler var frisk trypsiniseret, talt og anbragt på is umiddelbart før injektion. Musene blev injiceret med 10

6 celler subkutane rum i flanken af ​​dyret i et samlet volumen på 0,25 ml serumfrit RPMI 1640-medier. Musene blev aflivet til høst tumorvæv 4 uger efter tumorcelle-injektioner. Tumorfragmenter (1 mm

3) var frisk fremstillet ud fra de subkutane tumorer og implanteret i prostata laterale lap af en anden SCID mus (22-24). De 1 mm

3 tumor fragmenter blev dissekeret, målt med skydelære, og vejet for at sikre det nøjagtige beløb for at starte tumor blev anvendt for hvert dyr. Prostata Kapslen blev eksponeret efter en lavere midterlinje abdominal incision og en tumor fragment blev indsat i kapslen. Prostata kapsel blev derefter lukket med en 8-0 kirurgisk sutur og snittet i bugvæggen blev lukket med en 6-0 kirurgisk sutur i ét lag [29].

Dyrene blev holdt under isofluran anæstesi under kirurgi. Alle procedurer af den ovenfor beskrevne operation blev udført med en 7 x forstørrelse mikroskop. Musene blev evalueret 60 dage efter tumorimplantation for tumorudvikling og metastase ved fluorometri og for skeletabnormiteter med røntgen. Høj forstørrelse billeddannelse af GFP-udtrykkende tumorer blev udført med et Leica fluorescerende stereomikroskop, model LZ12, udstyret med en 50 W kviksølvlampe og hele kroppen billeddannelse blev udført i en lyskasse belyst af blåt lys fiberoptik (Lightools Research , Encinitas, CA) og filmede med en termoelektrisk kølet CCD kamera (Hamamatsu Photonics, Bridgewater, NJ).

Intraossøs injektioner

for at vurdere effekten af ​​PTHrP på prostatakræft vækst i knogler, vi anvendte en intra-tibial model for prostatacancer knoglemetastaser (1, 24). Vi studerede fem typer stabilt transficeret GFP udtrykkende DU145-celler: (1) vildtype, (2) vektor (pCI-neo), (3) PTHrP (1-87), (4) PTHrP (1-141) og ( 5) PTHrP (1-173) transformerede celler. Musene blev injiceret med 10

6 celler i 15 pi sterilt PBS i knoglemarven af ​​retten proksimale tibia under anvendelse af en 26-gauge nål og en Hamilton-glassprøjte. Den venstre tibia tjente som negativ kontrol. Musene blev evalueret 60 dage efter de intraossøse injektioner til skeletabnormiteter ved røntgen [24]. Skeletal røntgenstråler blev udsat med 40 keV i 20 sekunder i en Faxitron 5000-serien X-ray kabinet og Kodak X-Omat TL film blev behandlet i en Kodak film processor. For højere opløsning billeddannelse af knogleabnormiteter, vi brugte en GE Udforsk Micro CT (GE Healthcare).

PTHrP Immunoassay

Celleekstrakter og medier PTHrP blev målt ved RIA baseret på PTHrP (1- 34), PTHrP (38-64), og PTHrP (109-141), som tidligere beskrevet [30]. Alle prøverne blev analyseret i flere fortyndinger og tredobbelt.

Statistisk analyse

Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer og fejl søjler repræsenterer standardafvigelsen. Statistisk signifikans blev testet ved hjælp af en to prøve uafhængig t-test (2-halet test) med den tærskel på

P

. 0,05

Resultater

PTHrP Overekspression Fremmer udtryk af Mesenchymale Markers

at studere reguleringen af ​​EMT, PTHrP blev stabilt overudtrykt i DU 145, en prostata cancer cellelinje med lav basal PTHrP udtryk, som bestemt ved immunoassay (figur 1A). To kloner blev skabt, med én overudtrykker 1-141 isoformen af ​​PTHrP og den anden overudtrykker 1-173 isoform (figur 1B). Begge kloner viste markører for EMT, udtrykker især højere niveauer af de mesenkymale proteiner Sneglen og vimentin og lavere niveauer af E-cadherin i forhold til forældrenes DU 145, bestemt ved QRT-PCR (figur 1B). Ved stabil overekspression af fuld-længde PTHrP- (1-173) i DU 145, blev vimentin og sneglen mRNA-ekspression forhøjet med 115 og 6,82 gange, henholdsvis, mens E-cadherin ekspression faldt påviseligt i 2080 fold. Tilsvarende stabil overekspression af PTHrP- (1-141) øgede vimentin og sneglen mRNA-ekspression med 23,5 og 3,88 gange, henholdsvis, og faldt E-cadherin ekspression ved 12,3 gange. Data er vist med vildtype-parental derivat som en kontrol. I et parallelt eksperiment, PTHrP-overudtrykkende DU 145-celler viste en 6,06 ganges induktion af sneglen og 9,68 nedgang i E-cadherin ekspression sammenlignet med tom vektor-transficerede DU 145-derivat (data ikke vist). Induktion af EMT er verificeret af en immunofluorescens assay. Overexpressions af begge isoformer af PTHrP påvise faldet i E-cadherin med en stigning i vimentin-proteinekspression (fig 1C).

A) Kvantificering af PTHrP proteinniveauer i kontrol- og PTHrP-overudtrykkende DU 145-celler ved immunoassay. B) mRNA-ekspression af PTHrP og EMT markører i kontrol- og PTHrP-overudtrykkende DU 145-celler. C) Immunofluorescens billeder bekræfter overekspression af PTHrP, opregulering af vimentin, og nedregulering af E-cadherin i PTHrP-overekspression DU 145 celler.

PTHrP Knockdown Reducerer Angivelse af Mesenchymale Markers

for yderligere at demonstrere reguleringen af ​​EMT af PTHrP i prostatacancer, blev permanent PTHrP knockdown via retroviral transduktion udføres i PC-3, en prostatacancer-cellelinie med høj basal PTHrP ekspression som bestemt ved immunassay (figur 2A). I PC-3-KD-celler, blev ekspression af PTHrP nedsat til 15% af kontrollen PC-3 (figur 2B), mens niveauer af Sneglen og vimentin blev nedreguleret ved 3,03 og 3,73 gange, henholdsvis, og E-cadherin ekspression var forhøjet ved 2,30 gange (figur 2B). Ændringen i EMT-proteinekspression påvises med en immunofluorescensanalyse. Vælte PTHrP nedregulerer vimentin og opregulerer E-cadherin, hvilket bekræfter qPCR data (Figur 2C). Sammen med figur 1, antyder disse data, at PTHrP aktivitet eller ekspression fremmer EMT i prostatacancer.

A) Kvantificering af PTHrP proteinniveauer i kontrol- og PTHrP-knockdown PC-3-celler ved immunoassay. B) mRNA-ekspression af PTHrP og EMT markører i kontrol- og PTHrP-knockdown PC-3-celler. C) Immunofluorescens billeder bekræfter overekspression af PTHrP opregulering af vimentin, og nedregulering af E-cadherin i kontrol- og PTHrP-knockdown PC-3 celler.

PTHrP Regulerer invasion og opregulering af MMP-9

for at fastslå, at aktivering af PTHrP eller EMT resulterer i forøget invasivitet i vores eksperimentelle system, et matrigel invasion assay blev udført for at bestemme den relative invasivitet af DU 145-PTHrP (1-141), DU 145-PTHrP (1-173), og PC-3-KD-celler sammenlignet med deres respektive kontroller. DU 145-PTHrP (1-141) og DU 145-PTHrP (1-173) -celler blev fundet at være 3,0 (p .01) og 2,9 (p .05) gange mere invasiv end parentale DU 145-celler, henholdsvis ( Figur 3A). I mellemtiden blev PC-3-KD-celler sig at være kun 0,5 gange (p .01) som invasiv som parentale PC-3-celler (figur 3B). I et parallelt eksperiment, PTHrP- (1-141) og – (1-173) DU 145-celler viste en 2,0 (p 0,5) og 2,1 fold (p 0,05) stigning i matrigel invasion i sammenligning med den tomme vektor- transficeret DU 145-derivat, henholdsvis (data ikke vist). Endelig blev PTHrP overekspression i DU 145 observeret at opregulere ekspressionen af ​​MMP-9 med 17,1 og 7,10 gange i PTHrP- (1-141) og PTHrP- (1-173), der udtrykker derivater, hvorimod knockdown i PC-3 nedreguleres MMP-9 ved 25,1 gange (figur 3C).

A) Matrigel invasion assay viser stigning i invasion af DU145 celler ved overekspression af enten PTHrP 1-141 eller 1-173. B) Matrigel invasion assay viser fald i invasionen af ​​PC3 celler efter knockdown af PTHrP. C) mRNA niveauer af MMP-9 i PTHrP-overudtrykkende DU145-celler og PTHrP-knockdown PC3 celler i forhold til deres respektive kontroller. * Angiver p 0,05, ** angiver p. 0,01

PTHrP Fremmer tumorvækst og knoglenedbrydning i en ortotopisk /Intraossøs Mouse Model

DU 145 og DU 145- PTHrP (1-173) celler blev stabilt transficeret med en GFP-ekspressionsplasmid og implanteres orthotopisk i prostata lejet af nøgne mus eller direkte i knoglen, som tidligere beskrevet (1). Selv om alle mus dannede tumorer, der er implanteret med DU 145-PTHrP (1-173) celler dannet signifikant større tumorer sammenlignet med dem injiceret med normale DU 145-celler. Repræsentative billeder viser omfattende tumormasse i mus injiceret med DU 145-PTHrP (1-173) celler i sammenligning med mus injiceret med parental DU 145 (figur 4A). Desuden blev metastase til rygraden hos en af ​​mus injiceret med DU 145-PTHrP (1-173), medens ingen mus injiceret med DU 145 dannet metastaser (figur 4B). DU 145 eller DU 145-vektor-celler dannede nogen tumor ved injektion i mus skinnebenene mens DU 145-PTHrP (1-141) eller DU 145-PTHrP (1-173) celler injiceret i mus skinneben resulterede i dannelse af tumorer, invasion og destruktion af knogle (figur 5), hvilket bekræfter det veletablerede rolle PTHrP i knogleresorption. Endelig blev ekspression af PTHrP i tumorer bekræftet ved immunhistokemi (figur 5B).

A) ortotopisk musemodel viser en mus injiceret med DU145-GFP-celler. B) Mus injiceret med DU 145-PTHrP (1-173) celler. C) Bevis for knoglenedbrydning i mus injiceret med DU 145-PTHrP (1-173) celler. D) Spine metastase i en mus injiceret med DU 145-PTHrP (1-173) celler.

A) X-ray og UCT billeder, der viser effekten af ​​PTHrP overekspression på knoglenedbrydning i en Intraossøs mus model. Tibia af mus, der modtager PTHrP-overekspression DU 145 viste signifikant ødelæggelse af knogle sammenlignet med kontrol. B) Den DU 145-GFP-PTHrP1-173 prostata tumor blev fjernet fra mus, fikseret og farvet immunhistokemisk for PTHrP anvendelse af et biotin-streptavidin- peberrodsperoxidase-system (brun reaktionsprodukt indikerer PTHrP ekspression).

diskussion

Vi har identificeret PTHrP ikke kun som en kritisk mediator af tumor progression i prostatakræft, men også som en promotor af EMT. Mens PTHrP er blevet vist at inducere EMT i udvikling [10], [31], vores observation, at den fremmer EMT i cancer samt forbliver en hidtil ukendt konstatering. Dette resultat indebærer, at PTHrP kan have en endnu større rolle i cancer progression end tidligere antaget, eftersom evnen til at regulere EMT indebærer potentiale til at regulere en lang række egenskaber relateret til cancer progression herunder invasion, metastase, celle-motilitet, celle-adhæsion , angiogenese, og stemness /tumorgenicitet [11], [18], [32] – [34]. Prognose for fremskreden prostatacancer forbliver fattige på grund af hyppig knogle metastaser og invasion [35], [36]. Således målretning af PTHrP kan føre til mere effektive terapier for prostatacancer.

Vores data viser, at PTHrP overekspression i DU 145-celler induceret EMT og fremmet invasion, tumorigenicitet og metastase, mens PTHrP knockdown i PC-3-celler inducerede strid effekter. Endvidere observerede vi, at PC-3-cellelinjen har høj basal ekspression af PTHrP som bestemt ved PTHrP immunoassay og er i sagens natur mere metastatisk og invasiv sammenlignet med DU 145, som har lav basal PTHrP ekspression. Disse observationer postulere, at PTHrP ikke kun kan lette metastase ved at fremme knogleresorption, men kan også være en vigtig regulator af aggressiv fænotype i prostatacancer. Både 1-141 og 1-173 isoformer af PTHrP blev fundet at fremme EMT, stemmer overens med, at den klassiske aktive sted ligger i nærheden af ​​amino-terminus som vist ved tidligere undersøgelser [37]; dog kan yderligere forarbejdede peptider af PTHrP også være vigtige formidlere af denne handling. Målretning alle isoformer af PTHrP for anti-cancer terapi kan nødvendigt, selv om målretning af den 1-141 isoform kan være af primær betydning, da den tegner sig for størstedelen af ​​PTHrP udtryk i mennesker.

Downstream mål, der aktiveres ved PTHrP omfatter Snail, AP-1, CREB, ERK1 /2, VEGF, PI3K /Akt og cyclin D1 [20], [38] – [45]. Snail fremmer EMT gennem direkte transkriptionel repression af E-cadherin [15]. CREB opregulerer VEGF, som igen fremmer EMT, invasion og angiogenese [46], [47]. PI3K /Akt pathway er en central regulator af celleproliferation og har også vist sig at inducere EMT i en række forskellige cancere [48]. AP-1 blev vist at være involveret i TGF-β-induceret EMT [49]. Overekspression af cyclin D1 er blevet vist at inducere gliom invasion ved at øge metalloproteinaseaktivitet og cellemotilitet [50]. Fremherskende undersøgelser viser, at PTHrP, TGF-β, EGF, og VEGF samarbejder gennem aktivering af ERK1 /2 til at inducere EMT under renal fibrogenese [19], og at sneglen er et umiddelbart tidligt mål for PTHrP i murine parietal endoderm formation [20]. En eller en kombination af disse veje vil kunne forklare induktionen af ​​EMT og invasion, som blev observeret i vore eksperimenter, hvor vi bekræftede induktion af sneglen ved PTHrP. Selv om det er blevet vist tidligere, at PTHrP er i stand til at opregulere Snail transkription i fravær af de novo-proteinsyntese [20], er det stadig uklart, om denne virkning er gennem direkte binding til sneglen promotor eller ved aktivering af signalveje såsom Akt at er kendt for at regulere sneglen. Uanset hvad, ville yderligere undersøgelser være nødvendige for at bekræfte den mekanisme af PTHrP-induceret EMT i prostatacancer.

Det er muligt, at forskellige andre veje afhængige af PTHrP til at fremme EMT, invasion og metastase. TGF-β, en potent inducer af EMT, er blevet vist i brystcancer at fremme PTHrP ekspression resulterer i knoglenedbrydning [21]. Forskellige oncoproteiner herunder Ras, Tpr-Met, Src har alle vist sig at målrette PTHrP og har også vist sig roller i EMT, invasion og metastase [51] – [53]. Af særlig interesse ville være indisk pindsvin, som vides at regulere PTHrP under tidlig knogle og brusk vækst [54], [55]. Medlemmer af hedgehog familien er aberrerende aktiveret i en række forskellige cancere, herunder prostatacancer, er blevet vist at indirekte fremmer EMT, og er teoretiseret til at have en rolle i omdannelsen af ​​voksne stamceller i cancer stamceller [56] – [59] . Det ville være interessant at undersøge, om Ihh afhængig PTHrP til induktion af EMT og andre ondartede egenskaber i kræft.

Igangværende forskning fortsætter med at forstærke den teori, at cancer stamceller er de vigtigste drivkræfter for kræft progression og centrale determinanter for terapeutisk respons [60]. Således et vigtigt spørgsmål at overveje, er, om PTHrP kan regulere prostatakræft stamceller gennem en EMT-medieret vej. Som EMT er blevet vist tidligere at fremkalde kræft stamceller egenskaber [18], følger det, at PTHrP potentielt skal kunne regulere stamceller ejendomme i prostatakræft og dermed kan være et værdifuldt terapeutisk mål for forebyggelse af tilbagefald og metastaser. Prostata cancer stamceller er tidligere blevet isoleret og karakteriseret ved en CD44

+ /CD133

+ /α2β1

hi fænotype [61]. Fremtidige arbejde skal fokusere på evnen hos PTHrP at regulere dette rum i prostatacancer.

Konstateringen af, at PTHrP inducerer EMT samtidig fremme invasion og tumorvækst antyder, at behandlinger, der er målrettet PTHrP kan anvendes sammen med konventionelle behandlinger for inhibering invasion og metastase i prostatacancer, især for tilbagevendende tumorer. Vi har tidligere screenet et bibliotek af forbindelser og identificeret flere, der kan inhibere PTHrP ekspression og cellevækst i lungecancer [62]. Det ville være af stor klinisk interesse at udvide disse resultater til prostatakræft og at afgøre, om sådanne lægemidler er også i stand til at blokere PTHrP-induceret EMT og invasion. I mellemtiden kan yderligere indsats for at karakterisere de involverede veje i PTHrP-induceret EMT føre til opklaringen af ​​en rolle for PTHrP i cancer stamceller udvikling og nye behandlingsformer, der i væsentlig grad kan forbedre prognosen for metastatisk prostatacancer (1, 57).