PLoS ONE: Afvigende DNA skade responset Pathways Kan forudsige resultatet af Platinum Kemoterapi i kræft i æggestokkene

Abstrakt

Ovariekarcinom (OC) er den mest dødbringende gynækologisk malignitet. På trods af de fremskridt i behandlingen af ​​OC med kombinatoriske regimer, herunder kirurgi og platinbaseret kemoterapi, patienter udviser generelt dårlig prognose på grund af høj kemoterapi modstand. Heri testede vi den hypotese, at DNA beskadigelse respons (DDR) veje er involveret i resistens af OC patienter til platinbaseret kemoterapi. Udvalgte DDR signaler blev evalueret i to humane ovarie carcinom-cellelinier, én følsom (A2780) og en resistent (A2780 /C30) til platin behandling samt i perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) fra OC patienter, følsomme (

n

= 7) eller resistente (

n

= 4) til efterfølgende kemoterapi. PBMC’er fra raske frivillige (

n

= 9) blev undersøgt parallelt. DNA-beskadigelse blev vurderet ved immunofluorescens γH2AX farvning og komet assay. Højere niveauer af iboende DNA-skader blev fundet i A2780 end i A2780 /C30 celler. Desuden er de iboende DNA skader niveauer signifikant højere i OC patienter i forhold til raske forsøgspersoner, samt i platin-sensitive patienter i forhold til platin-resistente dem (alle

P

0,05). Efter carboplatin behandling, viste A2780 celler lavere DNA-reparation effektivitet end A2780 /C30-celler. Også efter carboplatin behandling af PBMC’er

ex vivo

, DNA reparation effektivitet var signifikant højere hos raske frivillige end i platin-resistente patienter og lavest i platin-sensitive dem (t

1/2 for tab af γH2AX foci: 2,7 ± 0,5 timer, 8,8 ± 1,9H og 15,4 ± 3,2H henholdsvis; hjælp komet assay, t

1/2 af platin-induceret skade reparation: 4,8 ± 1,4H, 12,9 ± 1,9H og 21,4 ± 2,6H henholdsvis; alle

P

0,03). Derudover carboplatin-induceret apoptose var højere i A2780 end i A2780 /C30 celler. I PBMC’er blev apoptose satser omvendt korreleret med DNA reparation effektivitetsgevinster af disse celler, er væsentligt højere i platinsensitiv end i platin-resistente patienter og lavest i raske frivillige (alle

P

0,05). Vi konkluderer, at forstyrrelser af DNA reparation veje som målt i PBMC’er fra OC patienter korrelerer med narkotika følsomhed af disse celler, og afspejle den individualiserede svar på platinbaseret kemoterapi

Henvisning:. Stefanou DT, Bamias A, Episkopou H , Kyrtopoulos SA, Likka M, Kalampokas T, et al. (2015) Afvigende DNA skade responset Pathways Kan forudsige resultatet af Platinum Kemoterapi i kræft i æggestokkene. PLoS ONE 10 (2): e0117654. doi: 10,1371 /journal.pone.0117654

Academic Redaktør: Goli Samimi, Garvan Institute of Medical Research, AUSTRALIEN

Modtaget: 16. juli 2014 Accepteret: November 12, 2014; Publiceret: 6 feb 2015

Copyright: © 2015 Stefanou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Data er tilgængelige fra Helios Digital Repository:. https://helios-eie.ekt.gr/EIE/handle/10442/14421

Finansiering: Dette arbejde blev støttet delvist af Athens University Medical School tilskud ELKE 097, og af ECNIS (Environmental Cancer, Ernæring og individuel følsomhed) Network of Excellence for den Europæiske Union (kontrakt nr. 513.943). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene (OC) er den femte mest almindelige form for kræft hos kvinder og den hyppigste årsag til dødelighed for gynækologiske maligniteter, med epitelcarcinoma er den hyppigste sort [1,2]. OC som typisk diagnosticeres i fremskredne stadier og ofte bærer en trist prognose, selvom de nuværende behandlingsstrategier inklusive aggressiv kirurgisk cytoreduktion og platin-paclitaxel kemoterapi synes at have væsentligt forbedret den relative overlevelse for patienter til en 5-års overlevelse på over 40% [3]. Etablerede prognostiske faktorer for OC omfatter trin, histologisk subtype, tumorklassificering og volumen af ​​tilbageværende sygdom efter cytoreduktive kirurgi [4,5].

Tre forskellige platinforbindelser, nemlig cisplatin, carboplatin og oxaliplatin, der for tiden anvendes i klinisk praksis, med talrige indikationer, som dækker et bredt spektrum af faste tumorer [6]. Deres cytotoksiske virkning udøves ved reaktion med DNA og udvikling af DNA-skade ved dannelse af tværbindinger, Pt-d [GpG] (1,2-intrastrand tværbindinger, 65%), Pt-d [APG] ( 1,2-intrastrand tværbindinger, 25%) og i mindre omfang Pt-d [GpNgG] (1,3-intrastrand tværbindinger), interstreng tværbindinger (ICLs, de mest cytotoksiske) og enkeltstrenget nukleotid beskadigelse af guanin [7]. Nucleotid excision reparation (NER) er den vigtigste proces, hvor platin intrastrand tværbindinger og enkelt nukleotid beskadigelse af guanin repareres [8,9]. På den anden side, ICL reparation er kompleks og kræver en kombination af NER, Fanconi anæmi reparationsvej, translesion syntese og homolog rekombination [10-12]. Interessant ICLs reparation forløber via dannelsen af ​​DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs), der repræsenterer den mest dødelige form af DNA beskadigelse [13]. Dannelsen af ​​DSBs altid efterfulgt af phosphoryleringen af ​​histon H2AX, en variant af H2A proteinfamilie, som er en komponent af histon octamer i nukleosomer. Histon H2AX phosphoryleres af kinaser såsom ataksi telangiectasia muteret (ATM) og ATM-Rad3-relateret (ATR) i PI3K pathway [14]. Dette nyligt phosphoryleret protein, γH2AX, er det første skridt i at rekruttere og lokalisere DNA reparation proteiner.

pattedyr genom er beskyttet mod genotoksiske fornærmelser af et netværk af DNA-skader respons (DDR) veje, der er udløst af påvisning af DNA-læsioner gennem specifikke sensorer [15]. Den efterfølgende trin er indledningen af ​​en signaltransduktion kaskade, som aktiverer forskellige genom-beskyttelse veje. Da DDR er en omfattende signaleringsproces som bestemmer celleskæbne enten ved at reparere DNA-beskadigelse eller undergår apoptose, er dens rolle blevet impliceret i sygdomsprocessen og i succes kemoterapi. Faktisk er det blevet vist, at abnormiteter i DNA reparation baner spiller en vigtig rolle i den maligne transformation af OC [16]. Også ekspressionen af ​​DNA reparation proteiner, såsom brystkræft 1 (BRCA1) og excision reparation cross komplementering gruppe 1 (ERCC1) har korreleret med dårlig overlevelse i avanceret OC og viste sig at være markører for resistens over for platin-baserede lægemidler [17- 19]. Derudover vores tidligere undersøgelser fokuseret på niveauet af DNA-skader i mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) fra patienter med myelomatose har vist, at DNA-skader fremadrettet kunne skelne mellem patienter med forskellige grader af terapeutisk respons, giver grundlag for pre-screening og udvælgelse af de patienter mere tilbøjelige til at drage fordel af denne behandling [20-24].

Heri vi foretaget en undersøgelse for at teste hypotesen om, at DDR, en afgørende mekanisme til celle overlevelse, er involveret i resistens mod platin kemoterapi . Vi fandt, at OC patienter er kendetegnet ved højere iboende DNA-skader sammenlignet med raske frivillige, og at effektiviteten af ​​DNA-reparation som målt i PBMC’er fra OC patienter korrelerer med narkotika følsomhed af disse celler og afspejler den individualiserede svar på platinbaseret kemoterapi.

Materialer og Metoder

patienter

Alle patienter inkluderet i denne analyse blev forvaltet i en enkelt institution (Alexandra Hospital, Athen, Grækenland). Blodprøver blev opnået fra atten (

n

= 18) patienter, der gennemgår kirurgi for mistanke ovariecancer (gennemsnitsalder 62 år, interval 34 til 77) (tabel 1) forud for enhver terapeutisk behandling. Ni (

n

= 9) raske personer, alders- og køn-matchede til patienter (alle kvinder, gennemsnitsalder 60 år, interval 29-73) blev serveret som kontroller. Alle patienter blev iscenesat ifølge FIGO staging system. Kemoterapi blev påbegyndt inden for en måned fra kirurgi. Paclitaxel på 175 mg /m

2 over 3 timer umiddelbart efterfulgt af carboplatin 5-6 AUC over 60 minutter blev administreret hver 3. uge. Seks cykler af kemoterapi blev administreret. Syv patienter fik ikke postoperativt kemoterapi: 3 havde borderline tumorer, en patient døde i den postoperative periode, mens 3 patienter afviste enhver behandling efter operationen. Platinum følsomhed for de 11 patienter, som fik første linje kemoterapi blev vurderet i henhold til Gynækologisk Cancer Intergroup Udvalg (GCIC) kriterier [25]. Ifølge kriterierne, der var 4 platinresistent og 7 platin-sensitive patienter. Overlevende patienter bør have et minimum opfølgning på 2 år. Alle deltagere gav skriftligt informeret samtykke i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen principper, og undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board of Alexandra Hospital.

Cell behandling

platinsensitiv A2780 og platin-resistente A2780 /C30-cellelinjer [26] blev venligst stillet til rådighed af Dr. George Koukos (æggestokkene Cancer Research center, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, USA). Celler blev dyrket i monolag ved anvendelse af RPMI 1640 indeholdende 10% føtalt kalveserum, 100 ug /ml streptomycin, 100 enheder /ml penicillin, 0,3 mg /ml glutamin og 0.3unit /ml insulin i en 37 ° C inkubator kontinuerligt gasset med 5% CO

2. Celler blev behandlet med cisplatin (0-100μg /ml for 0-24h), efterfulgt af inkubation i medikamentfrit medium for 0-24h eller carboplatin (0-300μg /ml for 0-24h), efterfulgt af post-inkubation i lægemiddel -fri medium for 0-24h.

PBMCer blev isoleret fra frisk udtaget perifert blod under anvendelse af standardmetoder [23]. Derefter blev celler stimuleret i proliferation under anvendelse 10 ug /ml phytohæmagglutinin (PHA) i 48 timer ved 37 ° C i RPMI 1640 suppleret med 10% FCS, 50 mg /l penicillin, 50.000lU /l streptomycin og efterfølgende behandlet med cisplatin (0-300μg /ml i op til 3h), efterfulgt af inkubation i medikamentfrit medium for 0-24h eller carboplatin (0-1800μg /ml i op til 24 timer), efterfulgt af post-inkubation i stoffri medium for 0-24h.

Cytotoksicitetsassay

efter lægemiddelbehandling levedygtige celler blev talt ved trypanblåt-farvestof-udelukkelse [27]. Kort fortalt, efter inkubation med lægemidlet, cellerne blev vasket og resuspenderet i komplet medium. Et tilsvarende volumen 0,4% trypanblåt reagens blev tilsat til cellesuspensionen, og procentdelen af ​​levedygtige celler blev vurderet. Analyser blev udført tre gange.

Single-celle-gelelektroforese (Comet assay)

encellede gelelektroforese blev udført under alkaliske betingelser som tidligere beskrevet [28]. Kort fortalt portioner af 5×10

4 ubehandlede eller platin lægemiddelbehandlede celler blev suspenderet i agarose med lavt smeltepunkt (1%) i PBS (135mmol /l NaCl, 2,5 mmol /l KCI, pH 10) ved 37 ° C, og spredning på fuldt matteret objektglas belagt med et tyndt lag af 1% normalt smeltende agarose (Biozyme, Hameln, Tyskland). Cellesuspensionen blev straks dækket med et dækglas og objektglassene blev holdt ved 4 ° C i 1 time for at tillade størkning af agarosen. Efter fjernelse af dækglas, blev celler udsat for lysis buffer (2,5M NaCI, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 10, 1% Triton X-100) ved 4 ° C i 1 time. Derefter blev objektglassene anbringes vandret gelelektroforese kammer. Kammeret blev fyldt med kold elektroforese buffer (1 mM EDTA, 300 mM NaOH, pH 13) og objektglas blev holdt ved 4 ° C i 40 min for at tillade DNA at slappe af. Elektroforese blev udført i 40 min (1V /cm, 255mA). Efter elektroforese blev objektglassene vasket med neutralisering buffer (0,4M Tris-HCl, pH 7,5) i 10 min og derefter med H

2O for 10min. Alle præparative trin blev udført i mørke for at forhindre yderligere DNA beskadigelse. Objektglassene blev farvet med 20 pi af 1 ug /ml DAPI og analyseret med et fluorescensmikroskop (NIKON Eclipse 400) udstyret med en CCD-4230A videokamera. Digitale billeder blev erhvervet ved anvendelse af et billedanalysesystem (Kinetic Analysis, Wirral, UK). Olive Tail Moments [OTM = (Tail Mean-Head Mean) x (% af DNA) /100] af 100 celler /behandling tilstand blev vurderet.

Immunofluorescens antigenfarvning og konfokal laser scanning mikroskop analyse

Portioner på 2×10

4 ubehandlede eller platin lægemiddelbehandlede celler blev overholdt dækglasset overtrukket med 1M HCl og 50 mg /ml poly-D-lysin før anvendelse, fastsat ved tilsætning af en 4% paraformaldehyd opløsning 6min ved stuetemperatur og opbevaret ved -70 ° C indtil analysen af ​​Patm (serin-1981 Santa Cruz), Patr (serin-428, Cell Signaling), pChk1 (serin-345, Santa Cruz), pChk2 (threonin-68, Abcam) og γH2AX (serin-139, Cell Signaling) [29]. Celler blev vasket med koldt PBS og blokeret med 0,5 ml per brønd blokeringsbuffer (0,1% Triton X-100, 0,2% skummetmælk tørmælk i PBS) i 1 time ved stuetemperatur i en fugtig boks. Blokerede celler blev inkuberet med antistoffer mod Patm, Patr, pChk1, pChk2 eller γH2AX i blokerende buffer ved 4 ° C natten over. Efter vask med blokeringsbuffer blev celler inkuberet med gede-anti-muse-antistof, FITC-mærket, parret med gede-anti-kanin, TRITC mærket, for dobbelt mærkning (Invitrogen) i en fortynding på 1: 4000 i blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur i mørket. Dækglas blev påført, og kanterne blev forseglet med klar neglelak. Billeder blev visualiseret med en Leica TCS SP-1 konfokal laser scanning mikroskop. Foci blev manuelt talt i 200 celler /behandling tilstand og resultaterne er udtrykt som% af γH2AX positive celler (gennemsnit ± SD) fra tre uafhængige forsøg; positive celler defineres som celler med mere end 5 foci per celle.

Apoptose assay

Apoptose blev vurderet ved anvendelse af celledød Detection ELISA-PLUS-kit (Roche Applied Sciences), ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt blev celler behandlet med forskellige doser af carboplatin (cellelinjer, 0-300μg /ml; PBMC’er, 0-1800μg /ml) i 24 timer efterfulgt af inkubation i medikamentfrit medium i 24 timer. Derefter blev cellerne opsamlet for at fremstille de cytosoliske fraktioner, der indeholdt fragmenter af DNA. Lige volumener af disse cytosoliske fraktioner blev inkuberet i anti-histon antistofcoatede brønde (96-brønds plader), og histonerne af DNA-fragmenterne fik lov at binde til anti-histon-antistoffer. Peroxidase-mærkede monoklonale muse-DNA-antistoffer blev anvendt til at lokalisere og detektere det bundne fragmenteret DNA ved fotometrisk detektion med 2,29-azino-di- (3-ethylbenzthiazolin-sulfonat) som substrat. Testen kvantificerer apoptose som fold forøgelse (udtrykt som berigelsesfaktor, EF) i niveauet af apoptose i behandlede prøver til ubehandlede prøver. Vi beregnede specifikke berigelse af mono- og oligo-nukleosomer frigives til cytoplasmaet ved hjælp af følgende formel: (ES) = [(absorbans af de behandlede celler) /(absorbans af cellerne uden lægemiddelbehandling)]. Endelig er det individuelle apoptose sats udtrykt som carboplatin dosis tilstrækkelig til at udløse induktionen af ​​en vis berigelsesfaktor (EF = 3).

Statistisk analyse

Effektiviteten af ​​DNA-reparation og induktion af apoptose blev sammenlignet mellem grupper af personer, der bruger ikke-parametriske tests. Konkret blev Kruskal Wallis-analyse bruges til sammenligninger på tværs af alle tre grupper, og Wilcoxon rank sum test for de parvise sammenligninger. Korrelationer mellem værdierne af de forskellige DDR-relaterede parametre i cellelinier eller PBMCer fra forskellige OC patienter blev vurderet af Spearman korrelationskoefficienten (alle grupper tilsammen). For at vurdere den lineære sammenhæng mellem DNA-skader og platin lægemiddeldosis, apoptose og DNA-skader, samt apoptose og pan-nuklear farvning, blev lineær regression af disse parametre udføres. En

P

-værdi mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. For at tage højde for flere sammenligninger af Bonferonni korrektion blev anvendt.

Resultater

DNA-reparation af platin-induceret skade i ovariecancer cellelinjer korrelerer med narkotika følsomhed af disse celler

for at undersøge de molekylære mekanismer involveret i narkotika følsomhed platinbaseret kemoterapi, blev ændringer i de centrale molekyler af den cellulære DDR-vejen (Patm, Patr, pChk1, pChk2, γH2AX) evalueret i to ovariecancer cellelinjer: en platin-sensitiv (A2780) og en platin-resistente (A2780 /C30) [26]. Cellerne blev behandlet med forskellige doser af cisplatin (0-100μg /ml) for 0-24h efterfulgt af inkubation i stoffri medium for 0-24h. Begge cellelinier viste en dosisafhængig stigning i dannelsen af ​​alle vigtige molekyler, der undersøges (fig. 1A, D). Maksimale niveauer af disse molekyler blev observeret ved 6 timer efter behandling, forbliver stabile eller svagt faldende derefter (fig. 1B). Interessant nok viste γH2AX de højeste induktion satser blandt de vigtigste molekyler undersøges. Den laveste cisplatin koncentration, ved hvilken kunne detekteres γH2AX induktion var 2,5 ug /ml i 1 time (fig. 1C). Desuden blev cellerne behandlet med carboplatin (0-300μg /ml) for 0-24h efterfulgt af post-inkubation i stoffri medium for 0-24h. Lignende resultater som dem opnået fra cisplatin eksperimenter blev fundet. Det er i begge cellelinier en dosisafhængig stigning i dannelsen af ​​alle vigtige molekyler blev observeret (Fig. 1E, F). Også, blev maksimale niveauer af disse molekyler observeret ved afslutningen af ​​24h behandling, faldende derefter. Igen viste γH2AX de højeste induktion satser blandt de vigtigste molekyler undersøges. Tilsammen indikerer disse resultater, at immunfluorescens kvantificering af γH2AX foci er en kraftfuld metode til at måle DNA-skader fremkaldt af platin narkotika.

A2780 /C30-celler (repræsentative af de to OC cellelinjer) blev behandlet (A) med cisplatin (0-100μg /ml) i 3 timer, eller (B) med 100 pg /ml cisplatin, efterfølgende inkuberet i stoffri medium for forskellige tidsperioder (0-24h) eller (C) med relativt små doser (0- 15 pg /ml) af cisplatin i op til 3h, og analyseret ved afslutningen af ​​behandlingen ved anvendelse af konfokal mikroskopi. Positive celler: celler med mere end 5 foci per celle. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen. I (D) typiske billeder, der viser de vigtigste molekyler under undersøgelse under anvendelse mikroskop analyse af A2780 /C30-celler behandlet med 100 ug /ml cisplatin i 3 timer; øvre billeder, immunofluorescens antigenfarvning; nederste billeder, cellekerner mærket med DAPI. (E) A2780 /C30 celler blev behandlet med carboplatin (0-300μg /ml) til 24 timer eller (F) med 100 pg /ml carboplatin til forskellige tidsperioder (0-24h) og analyseret ved hjælp af konfokal mikroskopi. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen. Alle assays blev udført tre gange.

Niveauerne af platin-induceret DNA-skader i begge cellelinier blev også evalueret under anvendelse af alkalisk komet assay. Denne version af kometen assay detekterer DNA migration forårsaget af strengbrud, alkaliske labile steder, og forbigående reparation sites [30]. Efter behandling af celler med 0-150μg /ml cisplatin i 3 timer (Fig. 2A, C) eller 0-300μg /ml carboplatin i 24 timer (fig. 2B, C), en lineær dosisafhængig stigning af DNA-skader niveauer blev opnået i både cellelinier, hvilket viser, at fremgangsmåden har følsomheden og nøjagtigheden at detektere og kvantificere platin-induceret DNA-ødelæggelse.

A2780 /C30-celler (som er repræsentative for de to OC cellelinjer) blev behandlet med (A) cisplatin ( 0-150μg /ml) i 3 timer eller (B) carboplatin (0-300μg /ml) i 24 timer, og analyseret ved afslutningen af ​​behandlingen ved hjælp af comet assay. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen. I (C) typisk komet assay billeder af A2780 /C30 celler ikke-behandlet (NT), behandlet med 50 ug /ml cisplatin (cis-50), 100 pg /ml cisplatin (cis-100), 150 ug /ml carboplatin (carbo-150 ) eller 300 pg /ml carboplatin (carbo-300). Alle assays blev udført tre gange.

Endvidere ved anvendelse af de to stærke fremgangsmåder validerede ovenfor, niveauet af den iboende DNA-skader blev vurderet i ubehandlede cellelinier. Både immunofluorescens γH2AX farvning og alkalisk komet assay viste signifikante forskelle mellem de to cellelinier, med den iboende DNA-skader er højere i A2780 end i A2780 /C30-celler. Især ved anvendelse γH2AX immunfluorescensfarvning, A2780 celler udviste 28,8 ± 3,4% positive celler (dvs. celler med mere end 5 foci per celle) og A2780 /C30 17,4 ± 3,4% positive celler (

P

= 0,01; Tabel 2 ). Desuden ved hjælp af komet assay, viste, A2780 celler OTM værdier på 33,9 ± 5,5 arbitrære enheder, mens A2780 /C30 celler viste 14,4 ± 2,9 enheder (

P

0,001; tabel 2).

for at udstille den DNA-reparation effektivitet i disse to cellelinjer, celler blev behandlet med carboplatin (0-300μg /ml) til 24 timer efterfulgt af post-inkubation i stoffri medium for 0-24h og den inducerede DNA-skader ( dvs. total DNA beskadigelse normaliseret ved den iboende DNA-beskadigelse) blev analyseret ved udgangen af ​​lægemiddelbehandling. Både immunofluorescens γH2AX farvning og komet assay viste signifikante forskelle mellem de to cellelinjer. Det er i begge cellelinier DNA-skader nåede højeste niveau ved slutningen af ​​lægemiddelbehandlingen, med DNA-beskadigelse er væsentligt højere i A2780 end i A2780 /C30-celler (data ikke vist). Derefter blev carboplatin-induceret DNA-skader niveauer reduceres, og omfanget af reparationen var signifikant lavere i A2780 end i A2780 /C30-celler (

P

0,03). Specielt sås under anvendelse af konfokal mikroskopi de γH2AX foci fjernes med t

1/2 = 5.2 ± 0,7H i A2780 /C30-celler og 11,7 ± 2,6H i A2780-celler. Ved at bruge komet assay, t

1/2 værdier for carboplatin-induceret skade reparation i A2780 /C30 og A2780 celler var 9,9 ± 1,3H og 16,7 ± 3.4h henholdsvis.

Desuden området under kurven (AUC) for carboplatin-induceret DNA-skader, en parameter, der afspejler den samlede DNA-skader byrde som følge af oprindelige skade dannelse og DNA-reparation blev beregnet (tabel 2). Ved at bruge γH2AX immunfluorescensfarvning viste A2780 celler AUC værdier [udtrykt som (% af γH2AX positiv farvning celler) x (carboplatin dosis)] på 17200 ± 3650, og A2780 /C30 celler 12400 ± 2140 (

P

= 0,01). Desuden komet assay bekræftede ovenstående konklusioner med A2780 celler viser AUC værdier [udtrykt som (OTM x carboplatin dosis)] på 14900 ± 3280, mens A2780 /C30 celler viste AUC værdier på 9400 ± 1150 (

P

= 0,01 ).

Desuden blev begge celletyper behandlet med forskellige doser af carboplatin (0-300μg /ml) i 24 timer og induktion af apoptose blev målt 24 timer efter behandling. Vi fandt, at apoptose var højere i A2780 celler end i A2780 /C30-celler (

P

= 0,001; tabel 2). Især viste A2780 celler tegn på apoptose ved carboplatin så lave doser som 43,8 ± 5.6μg /ml, mens A2780 /C30-celler krævede en dosis på 78,5 ± 9.2μg /ml, hvilket indikerer, at lægemidlet følsomhed celler omvendt korreleret med deres DNA reparation kapacitet (tabel 2).

en bemærkelsesværdig fund blev der efter carboplatin behandling, en brøkdel af celler viste diffus, lyse γH2AX farvning pan-nuklear. Tidligere undersøgelser har vist, at γH2AX farvning pan-nuklear betegner en præ-apoptotisk signal forbundet med ATM- og JNK-afhængig apoptose under replikation [31]. I overensstemmelse med resultaterne fra forsøgene DNA-reparation effektivitet, vi observeret højere niveauer af pan-nukleare γH2AX farvning [udtrykt som AUC (% af farvning celler pan-nukleare) x (carboplatin dosis)] i A2780-celler (13400 ± 2850) end i A2780 /C30-celler (7500 ± 1760) (

P

= 0,001, tabel 2).

mangelfuld DNA reparation af platin-induceret skade i PBMC’er af OC patienter korrelerer med bedre kliniske udfald

Hvad angår PBMC’er efter aftale med tidligere undersøgelser [32], fandt vi, at efter behandling af ikke-dividere PBMC’er med platin narkotika, meget lave eller null induktion satser de centrale molekyler under undersøgelsen blev observeret. Derfor har vi først behandlet PBMC’er fra ni raske frivillige med forskellige doser af PHA i op til 72 timer for at inducere proliferation af cellerne. Optimale resultater blev opnået efter 48 timers inkubering af PBMC’er med 10 ug /ml PHA (data ikke vist). Derefter blev PBMC’er behandlet med cisplatin (0-300μg /ml i op til 3h) efterfulgt af inkubation i medikamentfrit medium for 0-24h eller med carboplatin (0-1800μg /ml i op til 24 timer) efterfulgt af post-inkubation i dopingfri medium for 0-24h. I overensstemmelse med resultaterne fra cellelinjerne eksperimenter, ved en af ​​platin narkotika, blev en dosisafhængig induktion af alle vigtige molekyler observeret (fig. 3A, C), med γH2AX igen viser de højeste induktion satser (Fig. 3B , D). Desuden blev niveauerne af platin-induceret DNA-skader i PBMC’er fra de samme ni raske frivillige målt ved anvendelse alkalisk komet assay. Vi fandt også, at

ex vivo

behandling af PBMC’er med cisplatin (fig. 3E) eller carboplatin (fig. 3F) viste en dosisafhængig forøgelse af DNA damage niveauer. Taget sammen viser resultaterne fra begge cellelinier og PBMC’er forsøg indikerer, at immunfluorescens kvantificering af γH2AX foci og alkalisk komet assay er to stærke metoder til kvantificering af platin-induceret DNA-skader i kliniske prøver. Salg

PBMC’er fra ni raske frivillige var

ex vivo

behandlet (A) med cisplatin (0-300μg /ml) i 3 timer eller (B) med 150 ug /ml cisplatin, efterfølgende inkuberet i stoffri medium for forskellige tidsperioder (0- 24h), og analyseret derefter under anvendelse af konfokal mikroskopi. Også PBMC’er fra de samme raske frivillige blev behandlet (C) med carboplatin (0-1800μg /ml) i 24 timer eller (D) med 1400μg /ml carboplatin i forskellige tidsrum (0-24h) og analyseret ved afslutningen af ​​behandlingen ved anvendelse af konfokal mikroskopi. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen. Endelig blev PBMC’er behandlet med (E) cisplatin (0-150μg /ml) i 3 timer eller (F) carboplatin (0-1800μg /ml) i 24 timer og analyseret derefter under anvendelse comet assay. Box plots viser statistiske fordeling af indholdet af DNA-skader. De vandrette linjer i kasserne repræsenterer median værdier og de lodrette linjer strækker sig over og under boksen indikerer maksimum og minimum værdier hhv. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer.

Derefter bruge disse analyser, vi undersøgte iboende niveauer af DNA-skader i ubehandlede PBMC’er fra de tre grupper af individer (raske frivillige, patienter følsomme og patienter er resistente over for platin kemoterapi ). Både γH2AX immunfluorescensfarvning og komet assay viste signifikante forskelle mellem de tre grupper af individer (alle

P

0,05; Tabel 3), med den iboende DNA-skader er højere i OC patienter end hos raske frivillige. Interessant nok i overensstemmelse med resultaterne fra de ovariekarcinom-cellelinier eksperimenter, højere niveauer af intrinsisk DNA-skader blev observeret i PBMC’er fra patienter følsomme i forhold til dem resistente over for efterfølgende platin kemoterapi (γH2AX,

P

= 0,05; komet assay,

P

= 0,003; tabel 3, fig 4A-D).. Især ved hjælp γH2AX immunfluorescensfarvning, platin-sensitive patienter udviste 16,8 ± 2,3% positive celler, platin-resistente patienter 8,9 ± 2,4%, mens raske frivillige viste 3,9 ± 1,2% positive celler (tabel 3;. Figur 4A). Ved at bruge komet assay, patienter følsomme overfor platinbaseret kemoterapi viste OTM værdier på 20,1 ± 5,5 arbitrære enheder, platinresistent 7,8 ± 2,5, mens raske frivillige viste 2,4 ± 1,1 enheder (tabel 3;. Figur 4C). Interessant, at bekræfte, at forskellene i DDR signaler er virkelig reflekterende af platin følsomhed stedet tumortype blev patienter med samme histotype opdelt i følsomme og resistente over for platin terapi og de iboende DNA damage niveauer blev sammenlignet. Selvom hver undergruppe indeholder en lille antal prøver, resultaterne viste, at forskelle i de iboende DNA damage niveauer er reflekterende af platin følsomhed. For eksempel i kun serøse tumorer, ved hjælp γH2AX farvning, følsomme patienter (

n

= 6) viste højere niveauer af intrinsisk DNA-skade (middelværdi, 16,6% positive celler; range, 13,1-23,2%) end resistent patient (

n

= 1; 7,5%). Derudover i klar celle ovariecancer kun, følsomme patient (

n

= 1) udviste 18,5% positive celler, medens resistente patienter (

n

= 3) kun 9,4% (interval, 6,3 -13,7%). Lignende resultater blev opnået under anvendelse af komet assay.

(A) Kassegrafer udviser statistisk fordeling af indholdet af den iboende DNA-skader i ubehandlede PBMC’er under anvendelse immunfluorescens kvantificering af γH2AX. HV, raske frivillige; Sens: OC patienter er følsomme over for efterfølgende platin terapi; Res: OC patienter resistente over for efterfølgende platin terapi. (B) Typiske billeder fra konfokalt laserscanningsmikroskop analyse af PBMC’er fra de tre grupper; øvre billeder, γH2AX farvning; nederste billeder, cellekerner mærket med DAPI. (C) Kassegrafer viser statistiske fordeling af indholdet af den iboende DNA-skader i ubehandlede PBMC’er bruger alkaliske komet assay. (D) Typiske komet billeder fra ubehandlede PBMC’er for de tre grupper af individer. Box plots viser statistiske fordeling af indholdet af DNA-skader i PBMC’er stimuleret til proliferation ved hjælp PHA og behandles med carboplatin (0-1800μg /ml) i 24 timer, ved anvendelse af (E) immunfluorescens kvantificering af γH2AX og (F) alkalisk komet assay. De vandrette linjer i kasserne repræsenterer median værdier og de lodrette linjer strækker sig over og under boksen indikerer maksimum og minimum værdier hhv. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer.

For at undersøge DNA-reparation effektiviteten i de tre grupper af individer, efter 48 timers inkubation af PBMC’er med 10 ug /ml PHA, blev cellerne behandlet med carboplatin (0 -1800μg /ml) i 24 timer, post-inkuberet i medikamentfrit medium for 0-24h og den inducerede DNA-skader blev analyseret. Både γH2AX immunfluorescensfarvning og komet assay viste lignende resultater. Det er i alle personer analyserede DNA-skader nået højeste niveau i slutningen af ​​lægemiddelbehandlingen, med DNA-skader er højere i OC patienter end hos raske frivillige; platin-sensitive patienter viste højere niveauer af DNA-skader end platin-resistente dem (data ikke vist). Derefter blev DNA-beskadigelse niveauer elimineres, og omfanget af reparationen var højere hos raske frivillige end hos patienter. Interessant, i overensstemmelse med resultaterne fra de cellelinjer eksperimenter viste platin-sensitive patienter betydeligt lavere reparation effektivitet end platin-resistente dem (

P

0,03). Især brugte konfokal mikroskopi de γH2AX foci fjernes med t

1/2 = 2,7 ± 0,5 time hos raske kontroller, 8,8 ± 1,9H i platin-resistente og 15,4 ± 3,2H i platin-følsomme patienter.