PLoS ONE: Anvendelse af menneskelige kræftceller Mitokondrier at udforske de mekanismer BH3 Peptider og ABT-737-induceret mitokondriemembranen Permeabilisering

Abstrakte

Nuværende begrænsninger af kemoterapi omfatter toksicitet på sunde væv og multiresistens af maligne celler. En række nylige strategier anti-cancer sigte på at målrette den mitokondrie apoptotiske maskiner til at fremkalde tumor celledød. I denne undersøgelse, vi oprettet protokoller til at rense funktionel mitokondrier fra forskellige humane cellelinjer at analysere effekten af ​​peptid og miljøfremmede forbindelser beskrevet på havnen enten Bcl-2 hæmning egenskaber eller toksiske virkninger relateret til mitokondrier. Mitokondrie indre og ydre membran permeabilisering blev systematisk undersøgt i kræft celle mitokondrier

versus

ikke-kræft mitokondrier. Den trunkerede (t) Bid protein, syntetiske BH3 peptider fra Bim og Bak, og den lille molekyle ABT-737 inducerede et tumorspecifikt og OMP-begrænset mitochondrio-toksicitet, mens forbindelser som HA-14,1, YC-137, Chelerythrin, gossypol, TW-37 eller EM20-25 ikke. Vi fandt, at ABT-737 kan inducere Bax-afhængig frigivelse af apoptotiske proteiner (cytochrom c, Smac /Diablo og Omi /HtrA2 men ikke AIF) fra forskellige, men ikke alle kræft celle mitokondrier. Endvidere ABT-737 Foruden isolerede cancercellelinier mitokondrier induceret oligomerisering af Bax og /eller Bak monomerer allerede placeret i den mitokondriske membran. Endelig immunoprecipatations indikerede, at ABT-737 inducerer Bax, Bak og Bim desequestration fra Bcl-2 og Bcl-XL, men ikke fra Mcl-1L. Denne undersøgelse undersøger for første gang virkningsmekanismen af ​​ABT-737 som et enkelt middel på isolerede cancercellelinier mitokondrier. Derfor er denne metode er baseret på MOMP (mitokondrier ydre membran permeabilisering) er en interessant screeningsværktøj, skræddersyet til at identificere bcl-2-antagonister med selektiv toksicitet profil mod kræft celle mitokondrier, men blottet for toksicitet mod sunde mitokondrier

Henvisning.: Buron N, Porceddu M, Brabant M, Desgué D, Racoeur C, Lassalle M, et al. (2010) Anvendelse af menneskelige kræftceller Mitokondrier at udforske de mekanismer BH3 Peptider og ABT-737-induceret mitokondriemembranen Permeabilisering. PLoS ONE 5 (3): e9924. doi: 10,1371 /journal.pone.0009924

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: Januar 15, 2010; Accepteret: 1 mar 2010; Udgivet: Marts 31, 2010

Copyright: © 2010 Buron et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Agence Nationale pour la Værdiforøgelse de la Recherche (https://www.agence-nationale-recherche.fr) til Theraptosis SA (https://www.theraptosis.com) ved Theraptosis SA og Mitologics SAS (http: //www.mitologics.com). Den Agence Nationale pour la Værdiforøgelse de la Recherche havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

modstridende interesser:. Forfattere ABS, NB og MP erklærer konkurrerende økonomiske interesser på grund af ejerandel i Mitologics SAS. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Apoptose dysregulering har vist sig at ligger til grund flere patologier herunder kræft [1], [2 ]. Det er velkendt, at forskellige signalsystemer begivenheder inden apoptose konvergere på mitokondrier, der gennemgår ydre membran permeabilisering (OMP) udløser frigivelse af opløselige apoptogenic faktorer fra intermembrane rum såsom cytochrom c og en efterfølgende serie af aktivering af et sæt af proteolytiske enzymer, den caspaser ledende til apoptotisk demontering af cellestruktur [3].

MOMP er under kontrol af medlemmer af Bcl-2-protein familie, som omfatter (1) anti-apoptotiske proteiner, såsom Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1 og A1 /Bfl-1 indeholdende alle fire Bcl-2-homologi-domæner (BH1-4), (2) pro-apoptotiske proteiner, såsom Bax, Bak, Bok mangler BH4-domæne og (3) pro- apoptotiske BH3-only proteiner som Bid, Bim, Bad, BMF, Noxa og Puma [4] – [8]. I den direkte aktivering model er induktion af Bim eller Bid kræves til Bax eller Bak at oligomerisere og danne porer i den ydre mitokondriske membran (MOM) [9], [10]. De anti-apoptotiske proteiner kan blokere denne proces ved MOM ved primært at udskille Bax /Bak-proteiner [11] – [13]. I den indirekte aktivering model [14], [15], BH3-only proteiner kan antagonisere anti-apoptotisk virkning og befri Bax /Bak-proteiner. Det er stadig et spørgsmål om forhandling om Bax og Bak kan interagere med proteiner, såsom VDAC (spændingsafhængig anion kanal) og /eller ANT (adeninnukleotid translokatoren) for at regulere permeabiliteten overgangen pore (PTP) [16]. På mitokondrie plan er cytochrom c fordelt i to forskellige puljer: 15-20% i intermembrane rum og den større fraktion (80%) i intracristae rummet [17]. , BH3 mimetisk peptid skal således matrix remodeling at frigive den anden pulje af cytochrom c [18]. Andre apoptotiske faktorer som Omi /HtrA2 og Smac /DIABLO (caspase-afhængig død effektorer) eller apoptose-inducerende faktor AIF og EndoG (caspase-uafhængig død effektorer) er frigivet efter MOMP.

mitokondriemembranen permeabilisering ( MMP) proces er ofte ændres i cancerceller muligvis som et resultat af PTP komponent overekspression [19], opregulering af anti-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien og /eller nedregulering af Bax [20]. Disse ligger til grund talrige anticancerstrategier målretning komponenter af kernen celledød maskiner til at fremme tumorcelledød [21], [22]. Disse strategier er baseret på anvendelsen af ​​BH3-efterlignende peptider [14], [23], antisense [24] eller RNA-interferens [25] mod Bcl-2, og naturlige eller syntetiske små molekyler, der binder specifikt til familien Bcl-2-proteiner . For eksempel screening fremgangsmåder under anvendelse af kernemagnetisk resonans, struktur-baseret design og kombinatoriske kemisk syntese, førte til identifikation af ABT-737, en lille-molekyle hæmmer af anti-apoptotiske proteiner bcl-2, Bcl-xL og Bcl-w, men ikke Mcl-1 og A1 /Bfl1 [26]. ABT-737 anses for at være en Bad-lignende BH3 mimetisk fordi både ABT-737 og Bad BH3-peptid binder den samme delmængde af Bcl-2 pro-overlevelse proteiner [27] og inducerer cytochrom c-frigivelse i mitochondrier opnået fra “primet for død “tumorceller [28]. Men den svage affinitet ABT-737 til de pro-overlevelse proteiner MCL-1 og A1 /Bfl1 [26] kan være en afgørende faktor for tumor celle modstand mod dette stof [29].

Vi har sat en multiparametric skærm på oprensede mitokondrier at identificere forbindelser som inducerer OMP af mitokondrier isoleret fra cancercellelinjer, men ikke af mitokondrier isoleret fra ikke-cancerceller. Blandt forskellige forbindelser (fra kemiske, peptide lignende eller protein oprindelse) beskrev at målrette mitokondrier, fandt vi, at kun rekombinante t-Bid, Bak BH3 og Bim BH3 peptider og ABT-737 frembyder en direkte tumor-specifikke mitochondrio-toksicitet og fremkalde relativt stor OMP grund Bax og Bak oligomerisering. Ved yderligere udforskning af ABT-737-induceret OMP ved cellefri mitokondrie niveau, fandt vi, at (1) cancercelle mitokondrier fra forskellige kilder afveg i deres følsomhed over for ABT-737 korrelere med forskellige mønstre af (ydre) membranassocieret Bcl -2 familiemedlemmer og deres samspil, (2) ABT-737 inducerer Bax, Bak, og Bim desequestration fra Bd-xL og Bcl-2, men ikke fra Bcl-w eller Mcl-1.

Resultater

Isolering og funktionel karakterisering af sunde og tumor mitokondrier

mitokondrier fra både sundt væv (mus lever) og human tumor (PC-3, prostata) cellelinje blev renset ved isopyknisk centrifugering i densitetsgradienter af Percoll. De isolerede mitokondrier blev fundet stærkt intakt som vist ved cytochrom c-oxidase tilgængelighed assay og flowcytometri FSC /SSC analyse [30]. Ultrastrukturelle sammenlignende undersøgelser af isolerede mitokondrier fra lever eller PC-3 tumorcellelinie afsløre en forholdsvis ens matrix /cristae organisation på trods af en lille forskel i densitet mellem tumor (lav densitet) og lever (high density) mitokondrier (Fig. 1A). Calcium (50 uM) inducerer en omfattende ydre membran forstyrrelser hos både raske væv og tumorcellelinie mitokondrier efterfulgt af en hævelse, der inhiberes af cyclosporin A (CsA), hvilket indikerer en intakt og funktionel permeabilitetsovergang pore i begge mitokondrie typer. Polarografisk undersøgelser blev næste udført på lever og PC-3 mitokondrier (fig. 1B). Succinat oxidation var hovedsagelig på ADP addition og en respiratorisk kontrol indeks (RCI) 3 forbundet med succinat oxidation indikerede funktionelle integritet mitokondrier, herunder dem isoleret fra tumor dyrkede celler. Tilsvarende mitokondrier isoleret fra HT-29, HCT-116 og Jurkat cancercellelinjer og HME-1 ikke-kræft cellelinie præsenteret høj grad af integritet og funktionalitet (ikke vist).

A. Ultrastrukturelle analyse af isolerede mitokondrier og deres evne til at kvælde. Elektronmikrografier blev opnået efter inkubation af mitokondrier isoleret fra sunde muselever, eller PC-3-tumorcellelinjer ubehandlede (NT) eller behandlet med Ca

2+ (50 uM) eller med en 5 min-præinkubation med cyclosporin A (CsA ; 10 uM) eller ruthenium-rød (RR; 1 uM), før calcium tilsætning. Procentdelen af ​​opsvulmede mitokondrier var 10% i kontrolgruppen og 80% 30 minutter efter Ca

2+ tilsætning (n = 3). Scale barer 1 um. B. Oxidative egenskaber af isolerede lever og PC-3 mitokondrier. Spor viser iltforbrug ved isolerede mitokondrier (100 ug) efter tilsætning af de angivne reagenser. Numre langs spor er nmol O

2 forbruges pr minut pr milligram protein. Det respiratoriske kontrol index (RCI) beregnes for hver type af mitochondrier som angivet i Materialer og Metoder. C. Til bedømmelse mitokondriel opsvulmen og ΔΨ

m tab, mitokondrier isoleret fra raske mus lever eller PC-3-cellelinjen blev fordelt i mikroplader med 96 brønde og inkuberet i 30 minutter med enten Ca

2+ (100 uM) i tilstedeværelse (gul) eller fravær (lyserød) af CsA (10 uM), med

m

ClCCP (turkis, 50 uM) eller med t-Bud (lilla, 1 nM). Til kvantificering af cytochrom c-frigivelse, blev isoleret mitokondrier behandlet med stigende koncentrationer af t-Bud rekombinant protein og mitokondriesupernatant blev underkastet ELISA-assays, angivet i procent af frigivelse sammenlignet med 20 ug /ml alamethicin (Ala; 100% af cytochrom c release) (n = 3 uafhængige forsøg).

Multiparametric screeningsmetode på isolerede sunde og tumor mitokondrier

isolerede mitokondrier blev analyseret på en screening platform, som tillod kvantificering af mitokondriemembranen permeabilisering (hævelse,. figur 1C, venstre panel) plus mitokondrie transmembrane potentiale (A ^ m;. figur 1C, midterste panel) ved hjælp af real-time spektrofluorimetri og cytochrom c-frigivelse ved ELISA som et indeks for MOMP (figur 1C;. højre panel). Real-time Aijjm afsløring afspejlede indre membran og respiratoriske kæde ombygninger, men gjorde det ikke muligt at observere forsinket A ^ m reaktion på pro-apoptotiske forbindelser. Når de inkuberes i hypotonisk buffere, både normale og tumorale celle mitokondrier gjorde swell (tab af O.D. ved 550 nm) i nærværelse af calcium i en CsA-afhængig måde. Imidlertid blev hævelse amplitude reduceres i tilfælde af tumor mitokondrier i forståelse med deres laveste tæthed i forhold til leveren mitokondrier. Calcium og

m

ClCCP inducerede en hurtigt tab A ^ m kendetegnet ved en forøget fluorescens svarende til Rhodamin-123 dequenching grund af et fald af farvestoffet koncentration i depolariserede mitochondrier. Vi således observeret, at det rekombinante protein t-Bid havde ingen virkning på hævelse og ATm men inducerede cytochrom c-frigivelse specifikt i PC-3 (fig. 1C), HT-29, HCT-116 og Jurkat (ikke vist) celle mitokondrier i en koncentrationsafhængig måde som vist ved ELISA-analyse af supernatanterne.

Screening af formodede Bcl-2-familien hæmmere

Vi næste evaluerede virkningen af ​​Bcl-2-inhibitorer på mitokondrier isoleret fra muselever, human non-kræft (HME-1) og kræft (PC-3) celler ved anvendelse 3 parametre: hævelse, A ^ m og cytochrom

c

frigivelse (figur 2A.). Det rekombinante t-Bid protein induceret cytochrom c-frigivelse (uden hævelse og A ^ m underskud) fra PC-3 mitokondrier men havde ingen virkning på lever og HME-1 mitokondrier ved 100 nM. Nogle BH3 peptider (afledt af Bak, Bim, Bax, Bad, Bid, Noxa og Puma) fra mennesker eller mus kilder blev også testet. Blandt disse er det kun human Bak BH3 og Bim BH3 (fig. 2A) induceret mitochondrio-toksicitet for tumorcelle (PC-3) mitokondrier, og samtidig være inaktiv ved 100 uM på lever og HME-1 mitokondrier. Bemærkelsesværdige, selv den tilsvarende muse BH3 sekvenser er inaktiv på muselever mitokondrier, eksklusive en fejlfortolkning af artsspecificitet (ikke vist). I modsætning til de andre små molekyler inhibitorer evalueret i denne undersøgelse, kun ABT-737 viste tumor mitokondrier specificitet, inducere cytochrom c-frigivelse fra PC-3 mitokondrier men ikke fra lever og HME-1 mitokondrier. Den cytochrom c-frigivelse fra PC-3-mitochondrier behandlet med t-Bid og ABT-737 opstod uden nogen hævelse (fig. 2A og elektronisk mikroskopi, ikke vist) eller A ^ m tab (fig. 2A) under en 45 min behandling, hvilket indikerer, at disse betingelser forekommer en specifik OMP. Vi udvidede derpå studiet af ABT-737 effekter til mitokondrier isoleret fra HCT-116, HT-29 og Jurkat cancercellelinier (fig. 2B) og observeret forskellige følsomhed over for ABT-737. Faktisk HT-29 mitokondrier var meget mindre følsomme over for ABT-737 end PC-3, HCT-116 og Jurkat, disse tre laters frembyder et lignende niveau af følsomhed over for ABT-737. Disse data antydede, at ABT-737 inducerer cytochrom c-frigivelse fra forskellige, men ikke alle mitokondrier isoleret fra kræftceller.

A. Mitokondrier isoleret fra mus lever, humane ikke-kræft (HME-1) og kræft (PC-3) celler blev behandlet med stigende koncentrationer af t-Bid, Bak BH3, HA-14.1, YC-137, Chelerythrin, gossypol, TW- 37, EM20-25 og ABT-737 inden vurderingen af ​​mitokondrie hævelse og ΔΨ

m tab. Alternativt blev mitokondriesupernatant underkastet ELISA-assays til kvantificering af cytochrom c-frigivelse. Effektiv koncentration inducerer 50% af den maksimale effekt (EF

50) er givet for hævelse (100% af effekt med 50 pM Ca

2+), ΔΨ

m tab (100% af effekt med 50 pM

m

ClCCP) og cytochrom c-frigivelse (100% af effekt med 20 mg /ml alamethicin) (n = 3 uafhængige forsøg). B. Mitokondrier isoleret fra muselever eller HME-1, PC-3, HCT-116, HT-29 og Jurkat cellelinier blev inkuberet i 45 minutter ved 30 ° C med stigende koncentrationer af ABT-737, og supernatanterne blev underkastet cytochrom c immunoblot (NT: ubehandlet; Ala: alamethicin 20 ug /ml).

ABT-737-induceret MOMP i cancercelle mitokondrier er forbundet med Bak og /eller Bak oligomerisering

Vi efterfølgende undersøgt, om ABT-737-induceret OMP var selektiv til cytochrom c eller måske tillade frigivelsen af ​​andre apoptogenic mitokondrie faktorer (fig. 3). Isoleret muselever, PC-3 og Jurkat mitokondrier blev behandlet med Bak BH3, ABT-737 eller t-Bid og supernatanterne underkastet immunblotting. Smac /DIABLO (23 kDa) og Omi /HtrA2 (37 kDa) blev frigivet fra PC-3 og Jurkat mitokondrier mens AIF (56 kDa) ikke var (fig. 3), hvilket tyder på, at disse forbindelser inducerede en mitokondrier remodeling ikke tilstrækkeligt til AIF frigøre. Dernæst anvendes isolerede mitokondrier fra Bax og /eller Bak knock-out HCT-116-cellelinjer, hvor fravær af Bax og /eller Bak blev kontrolleret ved immunoblot (fig. 4A). Vi fandt, at ABT-737 inducerede cytochrom c-frigivelse fra Bax +/- og Bak – /- mitochondrierne men ikke fra Bax – /- eller Bax /Bak double knock-out mitokondrier (Fig 4B.). Disse data påpegede kritiske rolle Bax i virkningsmekanismen for ABT-737. Endvidere blev t-Bid og ABT-737-induceret MOMP styret af et overskud af Bd-XL (Fig. 4C) eller Bcl-2 (ikke vist) rekombinante proteiner, understøtter hypotesen om en dannelse af en bestemt kanal på den ydre membran [31]

Isoleret mitokondrier fra muselever, PC-3 og Jurkat-celler var ubehandlede (NT) eller inkuberet enten med alamethicin (Ala; 20 ug /ml; positiv kontrol)., Bak BH3-peptid (10 uM), ABT-737 (1 uM) eller rekombinant t-Bid (1 nM) i 45 min. Mitokondrielle supernatanter blev underkastet immunodetektion af cytochrom c, Smac /DIABLO, Omi /Htra2 og AIF (Western blots er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter). Bemærk, at cytochrom c (15 kDa), Smac /DIABLO (23 kDa), og Omi /Htra2 (37 kDa), men ikke AIF (56 kDa) frigives fra kræft celle mitokondrier.

A. Total celleekstrakter fra HCT-116 Bax +/-, Bax – /-, Bak – /- og Bax /Bak – /- (DKO) cellelinier blev underkastet Bax og Bak immunoblot at kontrollere deres Bax og Bak indhold. B. Mitokondrier isoleret fra HCT-116 Bax +/-, Bax – /-, Bak – /- og Bax /Bak – /- (DKO) cellelinier blev inkuberet med stigende koncentrationer af ABT-737, og supernatanten blev underkastet immunoblot påvisning af cytochrom c (NT: ubehandlet; Ala: alamethicin 20 ug /ml). C. Cytochrom c-frigivelse induceret af t-Bid og ABT-737 inhiberes af et overskud af rekombinant Bd-XL. PC-3 mitokondrier blev inkuberet med ABT-737 (1 uM) eller t-Bid (1 nM) i 45 minutter efter en 5 min-forbehandling med rekombinant Bd-XL (100 til 400 nM), og supernatanten blev underkastet anti- cytochrom c-immunoblot (NT: ubehandlet; Ala: alamethicin 20 ug /ml). Bemærk, at Bd-XL reducerer kraftigt både t-Bid og ABT-737-induceret cytochrom c-frigivelse (n = 2 uafhængige forsøg).

Efter at have konstateret, at Bax forblev bundet til mitokondrielle OM selv efter en vask med en alkalisk homogeniseringsbuffer (pH 11,6) (ikke vist), hvilket antyder en insertion af Bax i membranen [32], vi yderligere ønskede at undersøge, om ABT-737 kunne foranledige oligomerisering af Bax og Bak pools allerede er knyttet til tumorcellelinier mitokondrier . Svarende til t-Bid og Bim eller Bak BH3 peptider, ABT-737, induceret Bax og /eller Bak oligomerisering i PC-3 og Jurkat mitochondrier, som objectived anvendelse af tværbindingsmiddel 1,6-bismaleimidohexan (BMH;. Fig 5 ). Muteret [L78A; D83A] Bak BH3 peptid var ineffektiv til at fremkalde cytochrom c-frigivelse og Bax /Bak oligomerisering når tilføjet til PC-3 mitokondrier (Fig. 5A). I PC-3 mitokondrier, som indeholder både Bax og Bak, en svag Bak oligomerisering opstod med BH3 peptider eller ABT-737 antyder en stor rolle for Bax udløse kanaler dannelse i denne cellelinje (figur 5A;. Midterste paneler). Dernæst anvendes (±) -1- (3,6-dibromocarbazol-9-yl) -3-piperazin-1-yl-propan-2-ol identificeret ved Bombrun og medarbejdere [33] som en Bax-blokker ( BCB) i stand til at inhibere t-Bid-induceret cytochrom c-frigivelse [33], [34] (fig. 5A). Forbehandling af kræftcellen mitokondrier med denne BCB forhindrede cytochrom c-frigivelse udløst af Bak BH3, Bim BH3, t-Bid eller ABT-737 behandling (fig. 5A). Desuden fandt vi, at BCB forhindret Bax /Bak oligomerisering i respons på behandlinger med ABT-737, samt t-Bid og Bak eller Bim BH3 peptider (fig. 5A og 5B).

Mitokondrier isoleret fra PC-3 (a) og Jurkat (B) cellelinjer blev inkuberet eller ikke med BCB, en Bax Channel Blocker (2 uM (±) -1- (3,6-dibromocarbazol-9-yl) -3-piperazin 1-yl-propan-2-ol) før behandling med 1 uM Bim BH3, 10 uM Bak BH3, 10 uM muteret Bak BH3, 1 nM t-Bid eller angivne koncentrationer af ABT-737. Supernatanter blev analyseret for cytochrom c-frigivelse (underpanel; NT: ubehandlet; Ala: alamethicin 20 ug /ml) og mitokondrielle pellets blev behandlet med den irreversible tværbinder BMH (1 mM). Fyrre mikrogram protein fra hver reaktion blev kørt på SDS-PAGE og immunblottet med anti-Bax (A) eller anti-Bak (A, B) antistoffer. Bax /Bak oligomerisering ledsager ABT-737-induceret cytochrom c-frigivelse, som hæmmes af BCB.

Alt i alt, foreslog disse data, at ABT-737 udløste frigivelse af apoptogenic proteiner fra kræft celle mitokondrier ved dannelse af multimere Bax /Bak-kanaler som vist ved korrelation mellem Bax og Bak oligomerisering og cytochrom c-frigivelse (fig. 5).

ABT-737-induceret MOMP i cancercelle mitokondrier er forbundet med bestemte komplekse afbrydelser, afhængigt af mitokondrie typen

Som forskelle i følsomhed blev observeret mellem de forskellige mitochondriale-typer anvendt i denne undersøgelse, analyserede vi pro- og anti-apoptotiske Bcl-2-familiemedlemmer tilknyttet de mitochondriske membraner (fig. 6). Blandt de anti-apoptotiske proteiner, Bcl-2 kun var til stede i PC-3, Jurkat og HCT-116 mitochondrier, mens Bcl-w, Bd-XL og A1 blev påvist i alle mitochondriale typer (fig. 6A). Interessant, Bd-XL blev kvantitativt vigtigere i cancercelle mitokondrier end i deres sunde modstykke. Anti-apoptotiske Mcl-1L var til stede i store mængder i PC-3 og Jurkat mitokondrier og i mindre mængde i HT-29 mitokondrier. Med hensyn til de pro-apoptotiske proteiner, mens Bak var til stede i alle mitochondriale typer, Bax var til stede i PC-3, HT-29, HCT-116 og HME-1 mitochondrier, men ikke i Jurkat og lever mitokondrier. Blandt de BH3-only aktivatorer, blev Bim fundet i cancer-celle mitokondrier, men ikke i dem fra HME-1 og lever (fig. 6B), mens der ikke kan påvises Bud i nogen af ​​disse mitochondriale typer (ikke vist). Blandt de eneste BH3 sensibilisatorer, blev Bad detekteret ved PC-3, HT-29 og Jurkat mitochondriemembraner (fig. 6B), mens Puma, Noxa, HRK, Bik, Bok og BMF ikke var (ikke vist). Bcl-2, Bd-XL og BH3 kun sensibiliserende (ex Bim) kan meget vel være nøgleaktører selv om det er svært fra en sådan proteomiske analyse til at forklare forskellene i følsomhed over for ABT-737. Faktisk er det bemærkelsesværdigt, at HME-1 mitokondrier har hverken Bim, eller Bcl-2, og kun lavt niveau af Bd-XL, som kan skelne dem fra følsomme cancercellelinier mitokondrier.

Total celleekstrakter (TE) og mitokondriel ekstrakter (M) fra PC-3, HT-29, Jurkat og HCT-116 cancercellelinier eller fra sunde HME-1-cellelinien og muselever blev analyseret ved Western blot til påvisning af anti-apoptotiske (A) Bd-2 , Bd-XL, Bcl-w, Mcl-1L og A1 proteiner og den pro-apoptotiske (B) Bak, Bax, Bim, Bad og MCL-1S proteiner.

Som ABT-737 er træffer afgørelse med komplekse forstyrrelser mellem pro- og anti-apoptotiske proteiner, vi næste undersøgt nogle komplekse forstyrrelser ved co-immunoudfældning i PC-3, HT-29 og Jurkat mitokondrier behandlet med ABT-737 (fig. 7). Uanset cellelinie vi har registreret lignende bindinger: Bd-XL til Bax og Bak, Bcl-2 til Bax og svagt til Bak, Mcl-1, for Bak (fig. 7) og Bcl-w til Bax (ikke vist). Vi observerede, ABT-737-induceret cytochrom c-frigivelse er korreleret med Bax, Bak (fig. 7) og Bim (ikke vist) frigørelse fra Bd-XL og Bcl-2. Imidlertid ABT-737 havde ingen virkning på Bak og Bim sekvestrering af Mcl-1 (fig. 7), eller Bax sekvestrering af Bcl-w (ikke vist), disse komplekser er tilbage efter behandling. Disse resultater antydede, at Bax, Bak og Bim befrielse fra Bcl-2 og Bcl-xL som reaktion på ABT-737 var ansvarlig for kanaler dannelse og cytochrom c-frigivelse i PC-3 (fig. 8) og Jurkat mitokondrier. I modsætning hertil HT-29 mitokondrier indeholder mindre Bim og fratages Bcl-2 blev mindre følsom over for ABT-737 behandling, hvilket tyder på en stor rolle for Bcl-2 og Bim i ABT-737 følsomhed.

Mitokondrier isoleret fra PC-3 (A), HT-29 (B) og Jurkat (C) celler var ubehandlede (NT) eller behandlet med t-Bud (Bud; 2 nM) eller ABT-737 (ABT; 1 uM), før at være immunfældet af antistoffer rettet mod Bcl-2, Bcl-xL og Mcl-1 anti-apoptotiske proteiner. Mitochondriale totale ekstrakter (TE; positiv kontrol af immunoblot; 25 ug) blev anvendt som kontrol, mens en mitokondrie lysat blev underkastet immunpræcipitering proces uden antistof (C; negativ kontrol af immunpræcipitation). Således udførtes Western blot-analyse for at bestemme bindinger mellem anti-apoptotiske proteiner og pro-apoptotiske Bax og Bak proteiner (repræsentative Western blots af 3 uafhængige forsøg).

A. Bax, Bak og Bim er sequestred af Bcl-2, Bcl-xL og Mcl-1 ved den ydre mitokondrielle membran. B. Som svar på ABT-737, er Bax, Bak og Bim proteiner frigjort fra Bcl-2 og Bcl-XL, men ikke fra Mcl-1L. Således Bim kan direkte forbedre Bax og Bak oligomerisering udløser MOMP dannelse (C) og frigivelse af pro-apoptotiske proteiner såsom cytochrom c i cytosolen.

Diskussion

I denne undersøgelse, vi anvendte høj kvalitet kontrollerede isolerede mitokondrier at sammenligne virkningerne af formodede Bcl-2-inhibitorer og forsøge at udforske virkningsmekanismen for ABT-737. Vi anvendte fem forskellige parametre til at evaluere deres integritet og functionnality: cytochrom c oxidase adgang til eksogent cytochrom c (ikke vist), respiratoriske kontrolværdier, kapacitet til matrix hævelse, transmembranpotentialeændringer værdier og frigivelse af apoptogenic faktorer som cytochrom c (OMP) (Fig . 1). Sammenligning af forbindelser-effekt på hver mitokondrie type kræver tilsvarende høje niveauer af renhed og intakte mitokondrie præparater uanset deres kilder (dyrkede celler eller sundt væv). Dette blev løst ved store cellekulturer og rensning af mitokondrier ved differentierede centrifugeringer plus Percoll densitetsgradient. Ved hjælp af denne metode, både isolerede mus lever og kræft celle mitokondrier til stede lignende kvalitet og respons på calcium (fig. 1).

Overraskende nok de fleste forbindelser identificeret som Bcl-2-hæmmere blev fundet til at handle på en sund mitokondrier mindst på én integritet parameter. For eksempel har vi observeret, at HA-14,1, Chelerythrin, gossypol og EM20-25 induceret MMP i muselever mitokondrier, mens andre Bcl-2-familien inhibitorer blev fundet at være inaktiv (YC-137 og TW-37). Appart fra t-Bid, Bak BH3, Bim BH3 som er fra protein-oprindelse, viste kun ABT-737 selektiv tumor mitochondrio-målretning angivet med OMP og frigivelse af pro-apoptotiske faktorer (fig. 2). Tidligere observationer har vist, at ABT-737 kan fremkalde OMP enten når mitokondrier stammer fra celler “primet” af død signaler (for eksempel i IL-3-belastede lymfocytter [28], eller i TNF-pulserede HeLa-celler [35]), eller når isoleret mitokondrier co-behandlet med BH3-peptid (for eksempel med Noxa BH3 på MEF mitokondrier [13]). For første gang, demonstrerede vi, at ABT-737 selv kan inducere OMP på mitokondrier isoleret fra ikke-primede tumorcellelinier. Med hensyn t-Bid, vores isolerede lever og HME-1 sunde mitokondrier var ikke følsom over for det rekombinante protein t-Bud. Denne manglende effekt på leveren mitokondrier kunne forklares ved den høje renhed og stabilitet i vores mitokondrie præparater. Bcl-2-familien proteiner detekteret på både normale celler og cancerceller mitokondrier (fig. 6) minde stede efter alkaliske vaske (ikke vist), hvilket indikerer, at de ikke er forbundet ved elektrostatisk interaktion med mitochondriale membraner og ikke kommer fra residual cytosol eller endoplasmatisk reticulum .

Det rekombinante t-Bid protein, Bak BH3, Bim BH3 og ABT-737 udløste en frigivelse af apoptogenic proteiner fra PC-3 og Jurkat mitokondrier ved dannelse af kanaler er store nok til at frigive proteiner såsom Omi /HtrA2 (37 kDa) (fig. 3). OMP tilsyneladende uafhængig af PTP da den ikke inhiberes ved kendte PTP inhibitorer såsom ADP, cyclosporin A og bongkreksyre (ikke vist). Fraværet af mitokondrie membran ændringer (ingen hævelse og A ^ m tab) (fig. 2A) og frigivelse af de mindste apoptotiske faktorer under behandling (fig. 3), foreslog, at ABT-737 inducerede dannelsen af ​​en bestemt kanal og ikke en mitokondriemembranen brud, i lighed med Bax [53-86] BH3-peptid i Polster

et al.

[36]. Som følge heraf har diskriminerende frigivelse af apoptogenic faktorer allerede vist i isolerede HeLa mitokondrier behandlet med t-Bud [37]. Dette fund er kompatibel med den tidligere beskrivelse af en apoptosome-afhængige loop hvor downstream caspaser skal aktiveres for at udløse mitokondrie frigivelse af AIF og EndoG, sekundært til frigivelse af cytochrom c, Omi /HtrA2 og Smac /DIABLO [37]. I cellulær model blev Aijjm tab og cytochrom c-frigivelse samtidig detekteret som respons på ABT-737 [38], [39] i modsætning til hvad der blev observeret med vores forhold i cellefrit system. Vores screeningsmetode synes at være et tidstro proces, der tillader detektering af direkte og tidlige virkninger af forbindelser på mitokondrier, uden interferenser induceret af cytosolisk rum.

Vi har også vist, at (1) HCT-116 Bakkes /-, men ikke Bax – /-, mitokondrier er følsomme for ABT-737, (2) ABT-737-induceret cytochrom c-frigivelse på PC-3 mitochondrier styres af et overskud af Bd-xL (fig (figur 4A.). 4C) og (3) inhibering af Bax og Bak oligomerisering af BCB er tilstrækkelig til at blokere cytochrom c-frigivelse (fig. 5A og B). Disse fund indikerer, at ligevægt mellem pro-apoptotiske og anti-apoptotiske medlemmer af Bcl-2-familien spiller en væsentlig rolle i ABT-737 virkningsmekanisme.

Vi har således vist, at Bax og Bak oligomerisering ved PC-3 mitokondriske membran induceres af Bak og Bim BH3 peptider, t-Bid eller ABT-737 behandlinger (fig. 5A), idet Bax og Bak begge indsat som et monomer form i ubehandlet normal (HME-1) og tumoral (PC -3) celle mitokondrier. Imidlertid har talrige undersøgelser udført viser Bax oligomerisering og efterfølgende membraninsertion anvendelse af rekombinante Bax og isolerede mitochondrier eller liposomer [40] – [42]. Disse undersøgelser har ført til modsatte konklusioner om den kinetiske af Bax porer aktivering. Men mere nyligt er det blevet vist, at oligomerisering af Bax forekommer ved mitokondrie plan snarere end i cytosolen [43] – [45]. Således bruger c-myc nul-celler, Annis og medarbejdere viste, at Bax-induceret mitokondrie permeabilisering resultater fra oligomerisering af transmembrane monomerer i stedet indsættelse som forud dannede oligomerer [43].

Nogle Bcl-2 familie proteiner, såsom BH3 eneste aktivator Bim eller anti-apoptotiske proteiner bcl-2 og Mcl-1L er særligt stede på cancercellelinjer mitokondrier. I modsætning til tidligere observationer [28], [29], [46], Mcl-1L ekspression på mitokondrier ikke var tilstrækkelig i vores hænder til forebyggelse MOMP-dannelse i respons på ABT-737. For eksempel PC-3 og Jurkat mitokondrier er følsomme over for lave koncentrationer af ABT-737 trods en høj Mcl-1L indhold (fig 2 og 6), mens HT-29 mitochondrier med lavt niveau af Mcl-1L er relativt resistent over for ABT 737. Vi viser her, at på det molekylære niveau, ABT-737 tillader pro-apoptotiske proteiner Bcl-2 og Bcl-XL, men hverken Mcl-1L eller Bcl-w til frigivelse Bax, Bak og Bim (figurerne 7 og 8).