PLoS ONE: MIR-132 Undertrykker Migration og Invasion af Lung Cancer Cells via Målretning EMT Regulator ZEB2

Abstrakt

MikroRNA’er (miRNA) er små, ikke-kodende RNA, som kan fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener i humane kræftformer. Ny dokumentation viser, at deregulering af miRNA bidrager til det humane ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). I den foreliggende undersøgelse, vi demonstreret, at ekspressionsniveauerne af MIR-132 dramatisk blev nedsat i undersøgte NSCLC cellelinier og prøver kliniske NSCLC væv. Derefter fandt vi, at indførelsen af ​​MIR-132 undertrykte signifikant migrering og invasion af lungekræft celler in vitro, hvilket antyder, at MIR-132 kan være en hidtil ukendt tumor suppressor. Yderligere undersøgelser indikerede, at EMT-relaterede transkriptionsfaktor ZEB2 var en direkte målgener af MIR-132, fastslås ved direkte binding af MIR-132 med den 3′-utranslaterede region (3’UTR) i ZEB2. Endvidere kunne MIR-132 formindske ekspressionen af ​​ZEB2 på niveauerne af mRNA og protein. Især EMT markør E-cadherin eller vimentin, en nedstrøms ZEB2, blev også nedreguleret eller opreguleret på miR-132 behandling. Derudover overudtrykker eller silencing ZEB2 kunne hæve eller inhibere migrering og invasion af lungecancerceller, parallelt med virkningen af ​​MIR-132 på lungecancerceller. I mellemtiden, knockdown af ZEB2 vendt forbedret migration og invasion medieret af anti-miR-132. Disse resultater indikerer, at MIR-132 undertrykker migration og invasion af NSCLC-celler ved at målrette ZEB2 involverer EMT-processen. Således er vores fund giver ny indsigt i den mekanisme af NSCLC progression. Terapeutisk kan MIR-132 tjene som et potentielt mål ved behandling af human lungecancer

Henvisning:. Du J., Li Y, Fang N, Liu B, Zu L, Chang R, et al. (2014) MIR-132 Undertrykker Migration og Invasion af Lung Cancer Cells

via

Målretning EMT Regulator ZEB2. PLoS ONE 9 (3): e91827. doi: 10,1371 /journal.pone.0091827

Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University, Taiwan

Modtaget: September 19, 2013; Accepteret: 15 Februar 2014; Udgivet: 13 marts 2014

Copyright: © 2014 Du et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af tilskud fra Key Project fra National Natural Science Foundation of China (No.81000950), National 863 Program (No.2012AA02A201, No.2012AA02A502), National 973 Program (No.2010CB529405), Tianjin videnskabelig innovation System Program (No.07SYSYSF05000, No.07SYSYJC27900), Kina-Sverige Cooperative Foundation (No.09ZCZDSF04100), og Major Project of Tianjin Sci-Tech Support Program (No.06YFSZSF05300). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er en af ​​de mest almindelige årsager til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, og størstedelen af ​​lungekræft er den ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som omfatter ca. 80% af alle lungekræfttilfælde [1 ]. Patienter huser NSCLC ofte diagnosticeret som et fremskredent stadium, der lider af metastatically eller lokalt fremskreden sygdom, hvilket gør næsten 90% af lungekræftpatienter dør af metastaser [2]. Selv om der er gjort en stor indsats og progressioner i studiet af lungekræft i de seneste årtier, den molekylære mekanisme for lungekræft metastaser stadig undvigende.

microRNA (miRNA) er en klasse af små, ikke-kodende RNA med cirka 19-25 nukleotider. Det regulerer negativt genekspression på post-transkription niveau ved at interagere med den 3′-utranslaterede regioner (3’UTR’er) af mål-mRNA’er [3], [4]. MiRNA er fylogenetisk bevaret og spiller afgørende roller i en række biologiske processer, herunder udvikling, differentiering, apoptose, metabolisme, immunitet og tumor fremskridt [5], [6]. Også stigende beviser indikerer microRNA kan modulere tumor initiering og progression og funktion i tumor celle invasion og metastase [7], [8], [9], [10]. Tidligere undersøgelser har dokumenteret rollerne for MIR-132 i regulering af differentieringen af ​​dopamin neuroner [11] og aktivering af endothel til at lette patologisk angiogenese [12]. I tumorgenese, er det rapporteret, at nedregulering af MIR-132 bidrager til pancreas cancerudvikling [13]. Men den potentielle rolle for miR-132 i lungekræft progression er endnu ikke dokumenteret,.

ZEB2 /SIP1 er medlem af deltaEF-1 familie på to-hånds zink-finger faktorer og spille afgørende roller i udvikling af en række forskellige cancere, såsom gastrisk, ovarie-, skællede og ikke-småcellede carcinomer [14], [15]. ZEB2 specifikt undertrykke ekspressionen af ​​E-cadherin gennem binding til CACCT (G) motiv i E-cadherin promotor under epithelial- mesenkymale overgang (EMT) [16], [17]. Udover E-cadherin, er andre gener som plakophilin 2 og ZO-3, som involverer epiteliale celle-celle kryds også undertrykkes af ZEB2 [18]. For nylig er ZEB2 rapporteret til transkriptionelt at opregulere vimentin

via

samarbejde med Sp1 under EMT [19].

I den foreliggende undersøgelse, søgte vi at undersøge den formodede rolle MIR-132 i metastase af NSCLC. Vi fandt, at MIR-132 nedreguleres i metastatisk lunge cancercellelinier og prøver kliniske væv, hvilket antyder, at MIR-132 kan virke som en tumorsuppressor. Vi identificerede, at EMT regulator ZEB2 er en af ​​de direkte målgener af miR-132. MIR-132 er i stand til at hæmme EMT og metastase af NSCLC celler gennem lammende funktion ZEB2.

Materialer og metoder

Etik Statement

Undersøgelsen blev godkendt af den etiske Udvalg af Tianjin Medical University, Kina, og skriftlige informerede samtykke blev opnået fra alle undersøgte patienter.

cellelinjer og kliniske prøver

De sub-cellelinjer, høj metastatisk L9981 og lav metastatisk NL9980, blev isoleret og etableret fra en human lunge storcellet carcinom-cellelinie [20]. Høj- metastatisk 95D og lav metastatisk 95C var underlinjer af human giant-lungecarcinom-cellelinje [21]. Den NSCLC cellelinie YTMLC-9 [22], [23] blev oprettet i vores institut. Disse cellelinier blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% kalveserum (Invitrogen, USA), 100 IU /ml penicillin og 100 IU /ml streptomycin. The NSCLC cellelinje A549, købt fra American Tissue Culture Collection (ATCC), dyrket i DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 U /ml streptomycin. Disse cellelinier blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. For transfektionerne blev celler dyrket til 70% konfluens og transficeret med plasmider ved anvendelse lipofectamin 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger.

I alt 90 tilfælde af NSCLC prøver blev opnået fra General Hospital i Tianjin Medical University. Alle 90 patienter havde ikke modtaget strålebehandling eller kemoterapi før operationen. Vævsprøver til anvendelse blev opbevaret i flydende nitrogen. Det TNM af UICC (1997) blev anvendt til at klassificere prøver og overlevelse tidspunkter, der blev beregnet fra driften dag til døden via evaluering af tilbagefald og metastaser indtil den sidste opfølgning date. Følgende-up af de overlevende patienter i gennemsnit 32.55 måned og varierede fra 1 til 96 måneder. Undersøgelsen er godkendt af hospitalet etisk komité. Klinisk-patologisk information af patienterne om alder, tumorstørrelse, histologisk type, differentiering, scene og lymfeknudemetastase blev opnået fra patientjournaler, som blev sammenfattet i tabel 1.

Reverse-transskription PCR (RT- PCR), kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (QRT-PCR) og werstern blot assay

Totalt RNA ekstraheret fra Mirvana Kit (Applied Biosystems, CA) blev omvendt transkriberet til cDNA med hårnåle-revers transkription primer til miRNA detektion. Revers transkription af MIR-132 og intern kontrol U6 blev udført under anvendelse revers transkriptase M-MLV (Takara, Japan). Den qRT- PCR blev udført ved anvendelse af SYBR Premix Ex Taq (Takara) ifølge protokollen ved anvendelse af en forvarmet realtid instrument (Invitrogen). Alle primere blev vist i tabel S1. blev udført tre uafhængige eksperimenter for at analysere de relative genekspressioner og hver prøve blev testet tredobbelt. Ct-værdier blev anvendt til beregning af ekspressionen af ​​RNA niveauer. Mængden af ​​mål-genekspression (2

-ΔΔCt) blev normaliseret ved anvendelse af U6 reference.

Plasmid Constructions

Genomisk sekvens af human MIR-132, herunder -200 bp flankerende sekvens, var amplificeret fra human genom, derefter indsat i BamHI /EcoRI-stedet i pcDNA3.1-vektoren (Invitrogen), navngivet som pcDNA3.1-mIR-132. Fuldlængde 3′-utranslaterede region (3’UTR), i ZEB2 blev amplificeret fra human genomisk DNA, og blev klonet ind i nedstrøms for ildflueluciferase-kodende region af pMIR-GLOTM Luciferase vektor (Promega, USA). Den rekombineret vektor blev navngivet som pMIR-ZEB2. Mutationer af MIR-132-bindingssteder blev indført ved site-directed mutagenese og den resulterende vektor blev navngivet pMIR-ZEB2-Mut. Primere anvendt til konstruktionerne blev anført i tabel S1. Alle konstruktioner blev bekræftet ved sekventering.

Antistoffer og siRNA’er

Primære antistoffer anvendt i Western blot var kanin-anti-ZEB2 (Santa Cruz, USA), anti-E-cadherin (Santa Cruz) , anti-vimentin (Santa Cruz) og muse-anti-β-actin (Sigma, Aldrich, St. Louis, MO). β-actin blev anvendt til normalisering. De små interfererende RNA’er (siRNA) målretning human ZEB2 mRNA, negativ kontrol siRNA (siControl), MIR-132-inhibitor (anti-MIR-132), og inhibitor negativ kontrol (anti-MIR-NC) blev indkøbt fra Ruibobio (Guangzhou, Kina ). Alle oligonucleotidsekvenser er anført i tabel S1.

Cell Migration og invasion assays Salg

sårheling assay blev udført for at analysere cellemigrering som tidligere beskrevet [24]. Boyden kammer assays blev anvendt til at undersøge celleinvasion kapacitet. Celler blev transficeret med 1 ug pcDNA3.1 eller pcDNA3.1-MIR-132 vektor. Seksten timer senere blev transficerede celler trypsiniseret og resuspenderet. 1,0 x 10

5 celler i 300 pi kulturmedium blev anbragt i de øvre kamre (Millipore). De nedre kamre blev fyldt med 500 pi komplet medium med 10% FBS. Efter inkubation i 12 timer ved 37 ° C blev ikke-invaderende celler fjernes fra toppen af ​​kammeret med en vatpind. De migrerende celler på den nedre overflade af indsatserne blev fikseret og farvet med 0,1% krystalviolet, og fem tilfældige felter for hver indsats blev talt på 100 × forstørrelser.

luciferasereportergen Assay

adhærerende celler blev podet i 24-brønds plader og co-transficeret med 200 ng pMIR-ZEB2 eller pMIR-ZEB2-Mut vektor og 80 ng pcDNA3.1-mIR-132 vektor eller pcDNA 3.1 tomme vektorer, og pRL-TK plasmid (Promega, Madison, WI), som anvendes som intern normalisering. Celler blev høstet efter 36 timer og lyseret under anvendelse af lysepuffer (Promega). Luciferasereportergen assay blev gennemført ved anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) ifølge producentens instruktioner. Alle forsøg blev udført mindst tre gange.

Statistical Analysis

Hvert forsøg blev gentaget mindst tre gange. Statistisk signifikans blev vurderet ved at sammenligne middelværdier (± SD) ved hjælp af en Students

t-

test for uafhængige grupper og blev antaget for

s

0,05 (*) og

p

. 0,01 (**)

Resultater

MIR-132 er ofte nedreguleret i stærkt metastatisk Lung Cancer Cells og vævsprøver

Vi evaluerede udtrykket af miR-132 ved QRT-PCR i flere NSCLC cellelinjer med forskellige metastatiske kapacitet. Vi fandt, at MIR-132-niveauer udviste en varierende mønster i disse cellelinier. Især blev ekspressionen af ​​miR-132 i stærkt metastatisk L9981 og 95D celler dramatisk formindsket i forhold til, at der i de tilsvarende dårligt metastatisk NL9980 eller 95C cellelinjer, (figur 1A). Endvidere påvises vi MIR-132-ekspression i 45 parrede klinisk primær lungecancer væv og metastatiske lymfeknude vævsprøver. I forhold til deres primære kolleger, lymfeknuder metastatiske vævsprøver nærede en betydelig lavere miR-132 niveauer (figur 1B,

P

0,001, studerendes

t

-test). Også analysen på klinisk-patologiske træk af patienter med NSCLC viste, at ekspressionen af ​​miR-132 havde en signifikant sammenhæng med lymfeknude status (tabel 1,

P

= 0,011). Disse data indikerer, at den reducerede ekspression af MIR-132 er en hyppig begivenhed i stærkt metastatisk NSCLC celler og væv, der kan være involveret i metastasen af ​​humane lungecancerceller. Salg

(A) De relative mRNA-niveauer af mIR-132 blev påvist ved QRT-PCR og normaliseret mod en endogen kontrol (U6 RNA) i flere lungekræft cellelinier med forskellig metastatisk evne. Data er rapporteret som middelværdi ± SD for tre uafhængige forsøg (**

P

0,01, Students

t

– test). (B) QRT-PCR-analyse af miR-132-ekspression i 45 par af primære NSCLC væv og deres tilsvarende lymfeknudemetastaser. MIR-132 til udtryk i disse to typer af væv blev sammenlignet ved hjælp af Wilcoxon-test (***

P

0,001, Students

t

– test).

mIR-132 er stand til at hæmme Migration og invasion af NSCLC-celler in vitro

Dernæst testede vi den funktionelle betydning af miR-132 i NSCLC celler. Sårheling assay viste, at ektopisk ekspression af MIR-132 i L9981 eller A549 lungecancerceller signifikant inhiberede cellemigration, sammenlignet med kontrolgruppen (figur 2A). Desuden har vi udført Boyden kammer assay at undersøge virkningen af ​​MIR-132 på celleinvasion. Som vist i figur 2B og 2C, når transficeret med pcDNA3.1-MIR-132 plasmider, invasionen evne A549-celler udviste en over-3 gange fald sammenlignet med kontrolgruppen. Imidlertid viste cellerne, en forøget invasion ved behandlingen af ​​MIR-132 inhibitor (figur 2B, 2C). Derudover blev parallelle resultater observeret i 95D og L9981-cellelinier (figur 2C). Taget sammen dataene antyder kraftigt, at MIR-132 er i stand til at undertrykke migration og invasion af NSCLC-celler

in vitro

.

(A) sårheling eller blev anvendt til detekteret migrationen evne L9981 og A549-celler, hhv. (B, C) blev Boyden kammer assay anvendes til at undersøge invasionen evne 95D, L9981, og A549-celler, hhv. Resultaterne var fra tre uafhængige forsøg (*

P

0,05, **

P

0,01, Students

t

– test). Den vandrende celleantal i hver gruppe blev normaliseret til kontrollen. Celler blev transficeret med pcDNA3.1 (NC) eller pcDNA3.1-MIR-132 (MIR-132) konstruktioner, og MIR-132-inhibitor (anti-MIR-132) eller inhibitor-kontrol (anti-MIR-NC). De migrerende A549 celler i nedre kamre fra et eksperiment blev vist i B.

MIR-132 Direkte Hæmmer Angivelse af ZEB2 gennem sin 3’UTR og regulerer EMT af NSCLC Celler

for at opdage den molekylære mekanisme, hvormed miR-132 undertrykker metastaser af lungekræft celler, vi forudsagde de formodede målgener af miR-132 i humane celler hjælp af

Miranda

,

PicTar

og

TargetScans

. Blandt de forudsagte kandidater, ZEB2 var af interesse i denne undersøgelse, overvejer de afgørende roller ZEB2 i udviklingen af ​​de menneskelige kræftformer [14], [15]. For at teste om MIR-132 direkte målrettet ZEB2 (figur 3A), vildtype eller mutant 3’UTR-sekvensen af ​​ZEB2 blev klonet ind pMIR reporter vektor, henholdsvis som vist i figur 3B. Luciferaseaktiviteten af ​​pMIR- ZEB2 3’UTR-wt-konstruktionen var faldet betydeligt ved overekspression af MIR-132 i NL9980 celler, hvorimod dens mutant modstykke ikke var (figur 3C). Af note, blev mRNA eller proteinniveauer af ZEB2 i L9981 eller 95D-celler dramatisk reduceret med MIR-132, (figur 3D, 3E og 3F). Det forlyder, at ZEB2 er en vital EMT inducer gennem undertrykke E-cadherin eller overtale vimentin udtryk i human cancer [16], [19]. For yderligere at bekræfte, at ZEB2 virker som et mål på miR-132, vi undersøge effekten af ​​miR-132 på de to nedstrøms effektorer af ZEB2 ved Western blot. Som vist i figur 3E og 3F, EMT maker E-cadherin eller vimentin var dramatisk opreguleret eller nedreguleret ved overekspression af MIR-132 i både L9981 og 95D-celler. Tilsammen indikerer disse data, at miR-132 direkte hæmmer ZEB2 udtryk

via

målrette sin 3’UTR og inducerer EMT af NSCLC celler.

(A) miR-132 bindingssted forudsagt i 3’UTR af ZEB2 mRNA. (B) Mutant blev genereret ved frø region ZEB2 3’UTR som angivet ved understregningen. En 3’UTR-fragment af ZEB2 mRNA indeholdende vildtype eller mutant af MIR-132 bindende sekvens blev klonet ind i nedstrøms luciferasegenet i pMIR vektor. (C) L9981-celler blev transficeret med pMIR reporter vektorer indeholdende enten vildtype eller mutant ZEB2 3’UTR (angivet som pMIR-ZEB2-3 ‘UTR-wt og pMIR-ZEB2-3’ UTR-mut) med enten pcDNA3.1 (angivet som NC) eller pcDNA3.1-miR-132 vektor (indikeret som miR-132). Luciferaseaktivitet blev bestemt 48 timer efter transfektion. (D) ZEB2 mRNA blev påvist ved QRT-PCR i cellelinier transficeret med pcDNA3.1 (angivet som NC) eller pcDNA3.1-MIR-132 vektor (indikeret som MIR-132). (E, F) De proteinniveauer af ZEB2, E-cadherin eller vimentin blev undersøgt ved Western blot i celler transficeret med forskellige plasmider. Figur F viser de relative grå værdier af hvert bånd (normaliseret til p-actin). Proteinbånd fra tre uafhængige Western blot assays blev kvantificeret under anvendelse Mængde One software (Bio-Rad, USA). Data er rapporteret som middelværdi ± SD (**

P

0,01, Students

t

– test).

ZEB2 Bidrager til miR-132- Undertrykt Migration og invasion af NSCLC celler

så undersøgte vi mRNA eller protein udtryk for ZEB2 i flere NSCLC celler, samt 45 tilfælde af primær lungekræft væv og metastatisk lymfeknude væv. Dataene viste, at proteinniveauet af ZEB2 i meget metastatiske L9981 eller 95D-celler var markant opreguleret, sammenlignet med den dårligt metastatisk NL9980 eller 95 ° C celler, henholdsvis (figur 4A). Desuden blev det samme resultat om mRNA-niveauer af ZEB2 observeret i metastatiske lymfeknudevæv, i forhold til de primære lungekræft væv (figur 4B). Notatet udtryk for ZEB2 viste en omvendt korrelation med miR-132-niveau i NSCLC væv (Figur 4C). Dernæst undersøgte vi, om ZEB2 er medvirkende til migration og invasion af NSCLC celler. Ektopisk ekspression af ZEB2 i NL9980 eller 95 ° C celler signifikant forøget celleinvasion (figur 4D), dog silencing ZEB2 af siRNA’er i L9981-celler resulterede i nedsat migration og invasion cellernes evne (figur 4E, 4F), afslører dens positive roller i bidrag NSCLC cellemigration og invasion. I mellemtiden blev det transficerende eller silencing effektivitet ZEB2 i cellerne påvises ved Western blot (figur 4D og 4F,

lavere

). Derefter, vi tilgås, om den funktionelle virkning af MIR-132 på NSCLC-celler var afhængig af ZEB2. Som vist i figur 4G og 4H, indførelse af anti-miR-132 ind i NL9980 celler førte til en stigning i celle migration og invasion, mens stilhed ZEB2 af siRNA’er delvist afskaffet ekstraudstyr. Samtidig blev det protein niveauet ZEB2 bekræftet ved Western blot (Figur 4H,

lavere

). Kollektivt, foreslog disse resultater, at ZEB2 fungerer som et mål på MIR-132, der er ansvarlig for MIR-132-medieret regulering af migration og invasion af NSCLC-celler.

(A) Ekspressionen af ​​ZEB2 blev undersøgt ved Western skamplet i NSCLC celler. (B) De relative mRNA-niveauer af ZEB2 blev påvist i 45 parrede NSCLC primære tumorvæv og deres lymfeknudemetastase modstykker. ZEB2 udtryk i de væv blev sammenlignet ved hjælp af Wilcoxon-test (***

P

0,001, Students t-test). (C) Inverse korrelation mellem miR-132 og ZEB2 udtryk i NSCLC væv. ZEB2 ekspression blev analyseret ved QRT-PCR og normaliseret til GAPDH. MIR-132-ekspression blev påvist ved QRT-PCR-analyse og normaliseret til U6 ekspression. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Pearsons korrelationskoefficient (r = -0,68, ***

P

0,001). (D) invasion Cellen blev detekteret ved Boyden kammer assay i NL9980 eller 95 ° C celler transficeret med pCMV eller pCMV-ZEB2 vektorer, henholdsvis. (E, F) Effekten af ​​ZEB2 knockdown på cellen migration eller invasion blev vurderet ved sårheling eller Boyden kammer assay henholdsvis (**

P

0,01, Students

t

– prøve). Desuden blev silencing effektivitet ZEB2 af siRNA undersøgt ved Western blot. (G, H) The sårheling eller Boyden kammer assay blev anvendt til at detektere migration eller invasion evne NL9980 celler med forskellige behandlinger henholdsvis (*

P

0,05, **

P

0,01, Students

t

– test). Desuden blev lyddæmpende effektivitet ZEB2 af siRNA undersøgt af Western blot.

Diskussion

Vores gruppe har været fokus på den molekylære mekanisme af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) udvikling i de seneste år, især afsætter til undersøgelse af NSCLC metastaser. MiRNA er involveret i NSCLC patogenese og ekspressionsprodukterne profiler er blevet anvendt til at klassificere cancere [25], [26], [27]. Derfor forventede vi, at dyregulation af metastase-relaterede microRNA’er kan lette den avancerede udvikling af NSCLC. Miao LJ,

et

,

al. Hej, fundet, at miR-449c kunne hæmme invasion af NSCLC celler ved at målrette c-myc mRNA [28]. , Udbening Liu,

et al.

Rapporterede også, at miR-26a kan fremme metastase af lungekræft celler gennem aktivering AKT ved at målrette PTEN [29]. MIR-132, som følge af miR-212/132 klynge [30], har dokumenteret roller i fremme af bugspytkirtlen udvikling kræft

via

aktiverende AKT signalvejen [31]. Men den potentielle funktion af denne microRNA i humant NSCLC progression har få rapporter. I den foreliggende undersøgelse, er vi interesseret i den potentielle rolle for miR-132 i metastase af NSCLC celler.

I denne undersøgelse fandt vi, at miR-132 var ofte nedreguleret i højt metastatiske NSCLC cellelinjer og vævsprøver. , Formodede vi, at miR-132 kan være en roman tumor suppressor miRNA og dens dyregulation kan involvere den avancerede udvikling af human cancer. Desuden i den indledende tumorgenese, Shuyu Zhang og hans kollega fandt, at miR-132 udøvede de lave ekspressionsniveauer i primære pancreas tumorer og kan være forbundet med den tidlige udvikling af menneskelig bugspytkirtelkræft [13]. Men stadig brug potentielle rolle miR-132 i begyndelsen af ​​progression af NSCLC, som skal undersøges nærmere. For mekanisme, der involverer miR-132 nedregulering, Shuyu Zhang,

et al.

Rapporterede, at hyper-methylering i promotor-regionen var ansvarlig for reduceret ekspression af miR-132 [13]. Følgelig vi spekuleret på, at dette DNA modifikation kan forårsage ændringen af ​​MIR-132-ekspression i humant NSCLC.

Dernæst undersøgte vi funktionen af ​​MIR-132 i NSCLC. Vores data viser, at genindførelsen af ​​132 dramatisk undertrykt cellen migration og invasion af NSCLC celler

in vitro

. Derfor vores data antydede, at nedsat ekspression af MIR-132 kan bidrage til metastase af kræftceller og dermed lette den avancerede udvikling af humane cancere som NSCLC. Vi karakteriseres yderligere ZEB2 som et funktionelt mål for MIR-132 af luciferase reportergenassays, RT-PCR og Western blot-analyse, henholdsvis. ZEB2 /SIP1, som et medlem af deltaEF-1 familie af to-hånds zink-finger faktorer, ofte til udtryk i en række humane kræftformer, herunder pancreas [31], bryst [32], gastrisk [33], [34 ], renal [35], hoved og hals [36], gliom [37], hepatocellulært [38], æggestokkene [39], skællede og ikke-småcellet karcinom [14], [15]. Den vigtige rolle, som transkriptionsfaktor ZEB2 er blevet kraftigt fremhævet i mange papirer, på grund af sin funktion i inducere epithelial- mesenchymale overgang (EMT) og lette metastase af cancerceller [37], [40], [41]. For eksempel Nam EH,

et al

. rapporterede, at ZEB2 kunne fremkalde EMT og invasion af humane cancerceller

via

specifikt undertrykke ekspression af E-cateherin og opregulering vimentin udtryk [42]. Desuden Cong N og hans kollega fandt, at nedreguleret microRNA-200 familie var i stand til at fremme EMT gennem wnt /β-catenin vej ved at målrette E-cadherin repressorer ZEB1 /ZEB2 gastrisk adenocarcinom [33]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at ZEB2 havde en ofte høj ekspression i metastatiske NSCLC-celler og kliniske lymfeknudevæv. Og ZEB2 var ansvarlig for miR-132-moduleret migration og invasion af NSCLC celler. Især vi observeret, at E-cadherin eller vimentin, downstream effektor af ZEB2, blev også nedreguleret eller opreguleret af miR-132, hvilket indikerer, at miR-132 kan udøve funktioner i migration og invasion af NSCLC celler gennem modulerende EMT. Disse

in vitro

data underforståede det nødvendige bidrag af svækket miR-132 at fremme celle metastaser i kræft. Nylige undersøgelser afslørede en mesenchymal- epitelial overgang (MET) i metastaser, der tillod etablering af kræftceller i et fjerntliggende sted [43]. Men stadig brug potentielle rolle miR-132 i denne proces, at blive yderligere belyst.

Sammenfattende vi undersøgte rolle miR-132 i NSCLC udvikling. Vores fund tyder på, MIR-132 kan være en hidtil ukendt tumor suppressor miRNA. MIR-132 blokerer migration og invasion af NSCLC celler gennem målrettet EMT regulator ZEB2. Vores data giver ny indsigt i den mekanisme, der er ansvarlig for udviklingen af ​​menneskelig NSCLC. Derudover kan miR-132 fungere som en potentiel terapeutisk kandidat i behandlingen af ​​NSCLC.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Primere anvendt i papiret var opført

doi:. 10,1371 /journal.pone.0091827.s001

(DOC)