PLoS ONE: IDO Nedregulering inducerer Følsomhed til Pemetrexed, Gemcitabin, FK866, og Methoxyamin i humane cancerceller

Abstrakt

indolamin 2,3-dioxygenase-1 (IDO) er en immun regulerende enzym udtrykt af de fleste humane tumorer. IDO niveauer i tumorceller korrelerer med øget metastase og dårlig patient resultat og IDO er knyttet til tumorcelleresistens imod immunterapi, strålebehandling og kemoterapi. Kendskab til tumor celle-autonom virkninger af IDO, uafhængigt af dets velkendte rolle i reguleringen og undertrykke anti-tumor immunrespons, er begrænset. Klonale populationer af A549 humane lunge adenocarcinomceller stabilt transficeret med anti-IDO shRNA eller krypteret kontrol shRNA blev anvendt til at undersøge IDO virkninger på lægemiddelfølsomhed og modstand. IFNy blev anvendt til at inducere IDO i disse celler. Vi viser for første gang, at IDO medierer human tumor celle modstand mod kandidat anticancer narkotika FK866 (en NAD

+ inhibitor), methoxyamin (MX, en base excision reparation [BER] inhibitor) og godkendt anticancer narkotika pemetrexed ( et folat anti-metabolit) og gemcitabin (en nukleosidanalog), og kombineret behandling med pemetrexed og MX i mangel af immunceller. Samtidig knockdown af IDO og thymidylatsynthase (TS, en nøgle hastighedsbegrænsende enzym i DNA-syntese og reparation) sensibiliserer humane lungecancerceller for pemetrexed og 5FUdR i højere grad end knockdown af en target alene. Vi konkluderer, at BER i IDO-udtrykkende A549 celler spiller en vigtig rolle i at mediere resistens mod en række godkendte og kandidat anticancer narkotika. IDO inhibitorer er underkastet kliniske forsøg primært at forbedre antitumor immunresponser. Vi viser, at målrette IDO alene eller i kombination med TS er en potentielt værdifuld terapeutisk strategi til behandling af cancer, uafhængig af immun aktivitet og i kombination med konventionel kemoterapi

Henvisning:. Maleki Vareki S, Chen D, Di Cresce C Ferguson PJ, Figueredo R, Pampillo M, et al. (2015) IDO Nedregulering inducerer Følsomhed til Pemetrexed, Gemcitabin, FK866, og Methoxyamin i humane cancerceller. PLoS ONE 10 (11): e0143435. doi: 10,1371 /journal.pone.0143435

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Juni 24, 2015; Accepteret: November 4, 2015; Udgivet: November 18, 2015

Copyright: © 2015 Maleki Vareki et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information fil

Finansiering:. arbejdet blev finansieret af den canadiske Institutes of Health Research (https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html) (MOP-827.270 og MOP-123.454). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

immunregulerende molekyle IDO er en 45 kDa hæmoprotein afgørende for oxidativ katabolisme af tryptophan i kynurenin pathway [1]. IDO katalyserer oxidativ spaltning af 2,3-dobbeltbindingen i indoldelen af ​​L-tryptophan, hvilket resulterer i produktionen af ​​den første kynurenin pathway metabolit, N-formyl kynurenin [2]. Slutproduktet af kynurenin pathway er quinolinsyre (QA), som kan omdannes til NAD

+ i pattedyrceller. Vi og andre har vist, at IDO tilvejebringer en kilde til NAD

+ til celler fra tryptophankatabolisme [3,4]. IDO kan induceres i de fleste humane celler, især antigenpræsenterende celler (APC’er), ved inflammatoriske cytokiner såsom interferon-gamma (IFNy), tumornekrosefaktor (TNF) -α, og infektion [5,6]. Men de fleste humane tumorer udtrykker IDO [7], som bidrager til tumorinduceret tolerance og undertrykkelse af immunsystemet. IDO inducerer en tolerogenisk stat i tumoren mikromiljø og tumor-drænende lymfeknuder [8].

I de fleste patientens undersøgelser, IDO udtryk er blevet korreleret med nedsat samlet overlevelse og nedsat progressionsfri overlevelse [9] . Desuden har IDO været forbundet med forøget metastase i forskellige humane cancere, herunder ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), brystkræft, og tarmkræft [10-12]. Derudover patienter med fremskreden ovariecancer, nasopharyngeal carcinom og endometriecancer havde høje IDO niveauer i deres tumorer [13].

IDO er også vigtigt at udvikle resistens over for immunterapi. Det er blevet foreslået, at IDO spiller en stor rolle i resistens over for Ipilimumab [14]. I en mus transgen model af brystcancer, hvor tumorer blev induceret ved ekspression af onkogenet Neu under kontrol af muse-brysttumorvirus (MMTV) promotor, blev IDO inhibering med 1-methyl tryptophan (1-MT) kombineret med paclitaxel, et kemoterapeutisk middel almindeligvis anvendes til behandling af brystkræft [15]. Kombinationen resulterede i tumorregression i tumor-bærende dyr [15]. Slående, udtømning af CD4

+ T-celler eller anvendelse af T-celle-deficiente athymiske mus i stedet for immunkompetente mus afskaffet effekten af ​​kombineret behandling, hvilket indikerer en immun-medieret virkning til blokering IDO i forbindelse med paclitaxel behandling [15] .

Adskillige kliniske undersøgelser har antydet, at høje IDO niveauer under behandling kunne relateres til dårligt resultat til kemoterapi og /eller strålebehandling, og måske bidrage til resistens over for terapi [16-18]. I en enkelt arm fase II studie med patienter med stadium III NSCLC blev patienterne behandlet med induktion gemcitabin efterfulgt af sideløbende carboplatin, paclitaxel, og 74 Gray (Gy) thorax stråling [16]. Kræftpatienter udviste høj IDO aktivitet som det fremgår af målt højere serum kynurenin /tryptophan nøgletal sammenlignet med raske kontroller. Denne høje IDO aktivitet efter kemoterapi blev forbundet med dårlig patient resultat, selvom den statistiske effekt af undersøgelsen var begrænset af den relativt lave antal patienter [16].

I en anden undersøgelse blev IDO positivt forbundet med kemoresistens i en genekspression profilering undersøgelse med henblik på at identificere molekyler, der er forbundet med resistens over for paclitaxel kemoterapi i æggestokkene kræft cellelinjer og ildfaste kirurgiske ovariecancer prøver [17]. IDO blev stærkt udtrykt i både paclitaxel-resistente cellelinjer og ildfaste ovarietumorer men var fraværende i paclitaxel-følsomme cellelinjer og tumorer [17].

I en klinisk undersøgelse, der analyserede NSCLC patient respons på platinbaseret kemoterapi i en lille gruppe af patienter blev IDO ekspression i monocytter og granulocytter analyseret før og efter behandling. Det patientpopulation, der nød godt af behandlingen viste lavere IDO udtryk i blodmonocytter efterbehandling [18].

Vi har vist, at IDO giver resistens over for cisplatin, olaparib, og γ-stråling i A549, Hela, og H441-celler, der er uafhængige af direkte immun inddragelse [4]. IDO nedregulering faldt også intracellulære NAD

+ niveauer i cancerceller [4]. NAD

+ er nødvendig for poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) funktion [19]. Rekruttering af BER scaffold protein X-ray reparation cross-komplementerende protein 1 (XRCC1) til det beskadigede område af DNA er strengt afhængig af poly-ADP-ribosylering [20]. PARP funktion derfor direkte indvirkning BER, en kritisk mediator af cancercelle modstand mod genotoksiske virkninger af γ-stråling og en række kemoterapimidler herunder cisplatin, pemetrexed, og gemcitabin [21,22]. Derfor kunne IDO udtryk i kræftceller potentielt øge BER i disse celler og fremkalde resistens over for disse stoffer.

Vi viser for første gang, at IDO udtryk i kræftceller, uafhængigt af immunsystemet, giver resistens til NAD

+ hæmmer FK866 og BER inhibitor MX. Desuden IDO nedregulering sensibiliserede cancerceller for pemetrexed og gemcitabin, som begge er rettet mod thymidylatsyntase (TS), men ikke TS-targeting narkotika 5FUdR. IDO nedregulering også sensibiliserede A549-celler til kombineret pemetrexed og MX behandling. Endelig samtidig nedregulering af IDO og TS forbedret kapacitet IDO nedregulering og TS nedregulering at bevidstgøre A549 celler til pemetrexed og 5FUdR henholdsvis.

Materialer og metoder

Cell Culture

Menneskelig lungeadenocarcinom A549-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, CCL-185), og holdes i minimalt essentielt medium α (MEMα). A549 celler blev STR fingeraftryk og valideret af Radil test for at være mycoplasma gratis. Dyrkede medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, Californien, USA, katalog # 325-043-EL), 100 enheder /ml penicillin og 100 ug streptomycin (pen /strep) (Gibco , Life Technologies, Carlsbad, Californien, USA, katalog # 15140-122) i 70 cm

2 kolber Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Celler blev holdt ved 37 ° C i 5% CO2. For de fleste eksperimenter blev cellerne lov til at formere sig til ikke mere end 70-80% af maksimal belægning på vævskultur plast (

jeg

.

e

., 70-80% sammenflydende).

proliferation Assay (Cell Counting)

tumorcelleproliferation efter siRNA transfektion og /eller lægemiddelbehandling er tidligere beskrevet [23]. Kort fortalt blev A549-celler vasket med PBS, trypsinbehandlet og talt ved anvendelse af en Beckman Coulter Z1 Particle Counter (Beckman, Mississauga, Ontario) 72 timer efter behandling. Den gange ændring i celleantal efter 3 dages vækst (i forhold til udgangs antal udpladede celler) blev beregnet som:

Forskelle i proliferation induceret af behandling blev udtrykt som “spredning (% kontrol)” og blev beregnet efter følgende formel:

cytotoksiske lægemidler Salg

5FUdR blev købt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA). Pemetrexed (Alimta, Eli Lilly and Co., Toronto, Ontario, Canada) blev opnået fra London Sundhedsvidenskabelige Fakultet Center apotek (London, Ontario, Canada). MX og FK866 blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA).

TS Protein Detection og måling

A549 celler blev dyrket i 75 cm

2 kolber. Cellerne blev inkuberet i 96 timer efter TS siRNA transfektion, vasket to gange med iskold PBS, høstet, og sonikeret. Lyserede celler blev centrifugeret ved 20000 x g i 15 minutter ved 4 ° C, og supernatanten opsamles og opbevares ved -80 ° C til senere brug. Proteinekstrakter (20 ug) blev kvantificeret ved BioRad-proteinassay, adskilt ved elektroforese gennem en 12% polyacrylamidgel, og derefter elektro-overført til en nitrocellulosemembran. TS monoklonalt antistof (Taiho Pharmaceutical, Hanno-City, Japan) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Masakazu Fukushima (Taiho lægemidler, Hanno Research Center, Hanno-City, Japan). Actin monoklonalt antistof (Sigma, St. Louis, MO) blev anvendt til at detektere og kvantificere actin. Sekundær anti-mus og anti-kanin IgG (peroxidase-linked hele antistoffer, GE Healthcare Life Sciences) var bundet til primære IDO og actin antistoffer hhv. De antistof-protein-komplekser blev visualiseret ved hjælp af en Storm scanner (GE Healthcare Life Sciences).

Pemetrexed, FK866, Methoxyamin, og 5FUdR behandling

A549 celler (5×10

4) blev udsået i 25 cm

2 kolber i 2 ml MEMα suppleret med 10% FBS plus pen /strep. Medium blev udskiftet med frisk vækstmedium med eller uden IFNy (25 ng /ml) 16-24 timer efter podning. Fireogtyve eller 48 timer efter tilsætning af IFNy, blev mediet erstattet med frisk medium indeholdende enten pemetrexed (200 nM), FK866 (5 nM), MX (3 mM) eller 5FUdR (40 nM). Tre dage efter tilsætning af lægemidler blev cellerne vasket for at fjerne døde celler og partikler. Adhærerende celler blev trypsiniseret og optalt ved anvendelse af en Coulter-tæller (Beckman, Mississauga, ON). Levedygtigheden af ​​de optalte celler blev bekræftet ved trypanblåteksklusion.

Kombineret Behandling med Pemetrexed og Methoxyamin

A549 celler (5×10

4) blev dyrket og co-behandlet med pemetrexed (30 nM ) og MX (3 mM) som beskrevet ovenfor. Cellerne fik lov til at proliferere i kultur i 72 timer. Celler blev derefter trypsiniseret og levende celler blev optalt under anvendelse af en Coulter-tæller.

IDO nedregulering

Humane A549-celler blev stabilt transficeret med korte hårnål RNA (shRNA) med en kodet kontrolsekvens ikke-komplementær til kendte humane RNA sekvenser eller antisense for menneskers IDO1 eller (SuperArray, Mississauga, ON, anvendelse Lipofectamine 2000 (LFA2K) (Invitrogen, Burlington, ON, Canada), og individuelle klonede populationer med scrambled kontrol (scr) shRNA eller anti-IDO shRNA isoleret som tidligere beskrevet [4]. Kort fortalt blev en million A549-celler blev podet natten over i 2 ml MEMα suppleret med 10% FBS. celler blev 70% konfluente på transfektion dag. Ti mikrogram anti-IDO shRNA plasmid eller krypterede kontrol shRNA plasmid blev blandet med 10 pi LFA2K og 125 pi serum-frit medium efter 20 minutters inkubation ved stuetemperatur blev shRNA:. LFA2K kompleks blev tilsat til cellerne Transfektion fortsat i 4 timer før tilsætning af 4 ml friske MEMα suppleret med 10%. FBS. Fireogtyve timer efter transfektion, cellerne blev overført til 14 cm plast vævskulturskåle indeholdende 20 ug puromycin (BioShop Canada, Inc., Burlington, ON). Enkelte kolonier blev selekteret og dyrket i plader med 48 brønde i nærværelse af 2 ug puromycin. IDO mRNA og protein blev målt i alle udvalgte kloner efter induktion med IFNy.

TS og BRCA2 siRNA transfektion and Drug Treatment

TS siRNA nummer 3 eller TS siRNA nummer 4 (tabel 1), rettet mod forskellige regioner af human TS mRNA [OnTarget Plus (Dharmacon RNAi Technologies, Lafayette, CO, USA)], og at reducerede mål-mRNA’er med ca. 70% i 24 timer efter transfektion blev anvendt til transient nedregulere TS mRNA i A549 cancerceller. Koncentrationer af siRNA’er rettet mod human brystcancer type 2 modtagelighed protein (BRCA2) [OnTarget Plus SMARTPool BRCA2 (Dharmacon RNAi Technologies)] (tabel 1), der transient reduceret target mRNA’er med ca. 70% i 24 timer efter transfektion blev bestemt (10 nM) . TS siRNA (5 nM), BRCA2 siRNA (10 nM), og kontrol-ikke-targeting siRNA (2,5 eller 5 nM) i serumfrit MEMα og LFA2K (2,5 ug /ml) blev inkuberet sammen i 20 minutter. SiRNA: LFA2K blanding blev derefter tilsat til A549-celler, som var blevet podet i tre eksemplarer ved 2 x10

5 celler pr 25 cm

2 kolbe 24 timer forinden. 4 timer efter tilsætning af siRNA: LFA2K blev mediet udskiftet med frisk vækstmedium indeholdende IFNy (25 ng /ml). Medium blev udskiftet 48 timer senere med frisk medium indeholdende pemetrexed eller 5FUdR. Tumorcelleproliferation blev optalt 72 timer senere ved hjælp af et elektronisk partikel tæller (Beckman-Coulter).

In vivo

Tumor Model

A549 kloner NC-3 og 2-18 blev beskrevet tidligere [4]. Tumorceller blev injiceret i 50 procent Matrigel (ECM gel, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i flankerne af Fox Chase SCID-mus (1 x 10

7 celler pr injektionsstedet) (n = 5 mus pr gruppe ). Once tumorer nået ~ 300 mm

3 mus blev behandlet (dag 0) med PBS-fortyndet rekombinant humant IFNy (100.000 IE, ip, to gange om ugen i fire uger) (R 0,05. Felt D:. Korrelation analyse af forholdet mellem IDO proteinindhold (i forhold til actin) og klonal population resistens mod FK866 (proliferation i forhold til ubehandlede kontrolceller)

IDO i humane tumorceller formidler Modstand mod den Base Excision Reparation Inhibitor Methoxyamin

NAD

+ er vigtig for PARP funktion og PARP er afgørende for rekruttering af BER stillads protein XRCC1 til beskadiget DNA [20]. I lyset af vores tidligere rapport, IDO spiller en rolle i at mediere resistens over PARP inhibitor olaparib [4], at kapaciteten af ​​IDO mægle modstand til BER inhibitor MX blev undersøgt. Antisense knockdown af IDO sensibiliseret IFNy-induceret A549 klonerne 2-6 og 2-18 (huser anti-IDO shRNA) til MX, mens A549 kloner NC-3, NC-10, og NC-30 (transfekteret med scrambled kontrol shRNA) var ikke sensibiliserede (fig 2A og 2B). Når data fra 3 klonale populationer med kontrol shRNA blev kombineret og sammenlignet med kombinerede data fra de 2 klonale populationer med anti-IDO shRNA, IFNy-induceret IDO medieret en 6-fold forøgelse af resistens over for de antiproliferative virkninger af MX og tilstedeværelsen af ​​anti-IDO shRNA afskaffet denne forhøjelse (fig 2C). Der var en moderat korrelation mellem IDO niveau og MX modstand blandt alle 5 IFNy-induceret klonpopulationer [R

2 = 0,83] (Fig 2D). Disse resultater antyder, at IDO i cancerceller forbedrer funktionen af ​​BER-proteiner, og antisense-medieret reduktion af IDO blokke, enhancement.

Proliferation af hver af 5 individuelle A549-celle klonpopulationer før (diagram A) og efter ( panel B) IDO induktion med IFNy. A549 klonale populationer blev dyrket med eller uden IFNy (25 ng /ml) i 48 timer. Dyrkningsmedium blev derefter erstattet med frisk vækstmedium indeholdende Methoxyamin (MX) (3 mM), og celler fik lov at proliferere i 72 timer. Celler blev derefter trypsiniseret og levende celler blev talt. Hvide søjler: A549 kloner transficeret med røræg, ikke-målrettet kontrol shRNA. Grå søjler: A549-celler transficeret med anti-IDO shRNA. Hver søjle repræsenterer middelværdien af ​​3 værdier (

n

= 3 til bestemmelse af hver værdi) ± SD. Resultater normaliseres til kontrolværdier celler ikke behandlet med methoxyamin, uden (panel A) eller med (panel B) IFNy behandling. Panel C: Induktion af IDO i A549 klonale cellepopulationer inducerer resistens mod MX (3 mM). Resultater blev opnået fra 3 eller 2 uafhængige klonal cellepopulationer med røræg, ikke-targeting kontrol shRNA eller anti-IDO shRNA hhv. Hver søjle repræsenterer et gennemsnit af 9 (hvide søjler) eller 6 (sorte søjler) værdier ± SEM, * Signifikant forskel, Students

t

-test,

s

0,05. Felt D: Relationer mellem IDO proteinniveau (i forhold til actin) og resistens over for methoxyamin (MX) (proliferation i forhold til ubehandlede kontrolceller). R

2 værdi på 0,83 repræsenterer en moderat positiv sammenhæng.

IDO i humane tumorceller formidler Modstand mod TS-targeting Drug Pemetrexed

TS er vigtig i DNA-reparation og DNA-syntese og overudtrykkes i de fleste humane cancere [25]. TS-targeting stof pemetrexed er almindeligt anvendt til behandling af flere typer af humane kræftformer, herunder NSCLC og pleura mesotheliom [26]. BER er rapporteret at være vigtig i cancercelle modstand mod dette stof. Vi har vist, før den IDO øget NAD

+ niveauer i cancerceller [4]. I lyset af vores resultater, at IDO tillægges modstand mod BER inhibitor MX (figur 2), vi indstillet til undersøgt, om tilstedeværelsen af ​​IDO påvirket følsomheden af ​​A549 klonale cellepopulationer til pemetrexed, potentielt forbinder IDO ekspression med forbedret BER funktion i cancerceller . Klonale A549 cellepopulationer huser scrambled kontrol shRNA (3 kloner) eller anti-IDO shRNA (2 kloner) blev behandlet med eller uden IFNy i 48 timer og derefter med pemetrexed (200 nM) og fik lov til at proliferere i 72 timer. Der var ingen signifikante forskelle i følsomhed til pemetrexed blandt de 5 kloner før IFNy induktion, hvorvidt kloner vurderes individuelt (fig 3A) eller betyde relative følsomhed af de tre kontrol shRNA kloner (n = 3 vurderinger af hver klon) blev sammenlignet med den betyde relative følsomhed af de 2 anti-shRNA kloner (n = 3 vurderinger af hver klon) (fig 3C). Antisense-medieret nedregulering af IFNy-induceret IDO, i modsætning, lysfølsomme hver af de 2 kloner, der huser anti-IDO shRNA til pemetrexed, sammenlignet med alle 3 kloner husende scrambled kontrol shRNA (Fig 3B). Når middelværdien proliferation af kontrol- og anti-IDO shRNA kloner efter IFNy-induktion blev sammenlignet, der huser anti-IDO shRNA var ca. dobbelt så følsomme over for pemetrexed (Fig 3C). Antisense-medieret reduktion i IDO derfor lysfølsomme A549 klonpopulationer til pemetrexed.

Proliferation af hver af 5 individuelle A549-celle klonpopulationer før (diagram A) og efter (diagram B) IDO induktion med IFNy. A549 klonale populationer blev dyrket med eller uden IFNy (25 ng /ml) i 48 timer, derefter med pemetrexed (200 nM), og optalt 72 timer senere. Hvide søjler: A549 kloner transficeret med røræg, ikke-målrettet kontrol shRNA. Grå søjler: A549-celler transficeret med anti-IDO shRNA. Hver søjle repræsenterer middelværdien af ​​3 værdier (

n

= 3) ± SD. Resultater normaliseres til kontrolværdier celler ikke behandlet med pemetrexed, uden (panel A) eller med (panel B) IFNy behandling. Panel C: Induktion af IDO i A549 klonal celle inducerer resistens over for pemetrexed (200 nM). Resultater blev opnået fra 3 eller 2 uafhængige klonal cellepopulationer med røræg, ikke-targeting kontrol shRNA eller anti-IDO shRNA hhv. Hver bjælke repræsenterer en middelværdi på 9 (hvide søjler) eller 6 (sorte søjler) værdier ± SEM. * Signifikant forskel, Students

t

-test,

s

. 0,05

IDO i humane tumorceller formidler Modstand mod kombineret behandling af pemetrexed og Methoxyamin

Et fase i klinisk forsøg med kombineret MX og pemetrexed er afsluttet (NCT00692159) og kliniske fase II forsøg med, at narkotika kombination i flere indikationer, herunder NSCLC er planlagt (NCT01851369, NCT02395692, NCT02535325, og NCT02535312) [26] . I betragtning af vores observation af IDO-medieret resistens over for både pemetrexed og MX, blev det en hypotese, at IDO kunne fremkalde resistens over for kombineret MX og pemetrexed behandling. For at teste denne hypotese blev IDO induceret i A549 klonal cellepopulationer og derefter disse populationer blev behandlet med en kombination af pemetrexed (30 nM) og MX (3 mM) og proliferation vurderes efter 72 timer. Svarende til, hvad der blev observeret efter behandling med MX eller pemetrexed som enkelte agenter, IDO nedregulering sensibiliserede cancerceller til kombineret behandling (Fig 4A og 4B). Desuden efter IFNy induktion af IDO og udsættelse for kombineret pemetrexed og MX, når gennemsnitlige spredning værdier for de 3 kontrolpunkter kloner blev sammenlignet med betyde spredning værdier for de 2 kontrolpunkter kloner (n = 3 vurderinger for hver klon), celler, der huser anti-IDO shRNA var 7 gange mere følsom over for den kombinerede lægemiddelbehandling end celler med scrambled kontrol shRNA (fig 4C). Forud for IFNy induktion af IDO ekspression, var der ingen forskel (figur 4C). Der var en beskeden positiv sammenhæng mellem mængden af ​​IDO i IFNy-inducerede tumorceller og deres modstand mod kombineret behandling med disse to lægemidler (Fig 4D, R

2 = 0,70). Disse data viser betydningen af ​​IDO ved mediering resistens over for terapeutiske midler både alene og i kombination.

Proliferation af hver af 5 individuelle A549-celle klonpopulationer før (diagram A) og efter (diagram B) IDO induktion med IFNy . A549 klonale populationer blev dyrket med eller uden IFNy (25 ng /ml) i 48 timer. Dyrkningsmedium blev derefter erstattet med frisk vækstmedium indeholdende pemetrexed (30 nM) og methoxyamin (MX) (3 mM). Tumorceller fik derefter lov til at proliferere i 72 timer, derefter opregnet. Hvide søjler: A549 kloner transficeret med røræg, ikke-målrettet kontrol shRNA. Grå søjler: A549-celler transficeret med anti-IDO shRNA. Hver søjle repræsenterer middelværdien af ​​3 værdier (

n

= 3) ± SD. * Signifikant forskel, Students

t

-test,

s

0,05. Resultater normaliseres til kontrolværdier celler ikke behandlet med pemetrexed og methoxyamin, uden (panel A) eller med (panel B) IFNy behandling. Panel C: Induktion af IDO i A549 klonal celle inducerer resistens mod kombineret pemetrexed (30 nM) og MX (3 mM) behandling. Resultaterne blev opnået fra 3 uafhængige klonale cellepopulationer med scrambled kontrol shRNA eller anti-IDO shRNA, og hver bjælke repræsenterer et gennemsnit af 9 (hvide søjler) eller 6 (sorte søjler) værdier ± SEM (*

s

0,05). Resultater normaliseres til kontrolværdier celler ikke behandlet med gemcitabin, uden (panel A) eller med (panel B) IFNy behandling. Paneler D-F: Proliferation af hver af 5 individuelle A549-celle klonpopulationer før og efter IDO induktion med IFNy. A549 klonale populationer blev dyrket med eller uden IFNy (25 ng /ml) i 48 timer og, 5FUdR (200 nM) i 72 timer, og derefter optalt. Hvide søjler: A549 kloner transficeret med røræg, ikke-målrettet kontrol shRNA. Grå søjler: A549-celler transficeret med anti-IDO shRNA. Hver søjle repræsenterer et gennemsnit af 9 (hvide søjler) eller 6 (sorte søjler) værdier ± SD for Paneler D og E og SEM for panel F ± SD. * Signifikant forskel, Students

t

-test,

s

0,05. Resultaterne er normaliseret til at kontrollere celler ikke behandlet med 5FUdR, uden (panel A) eller med (panel B) IFNy behandling.

IDO Nedregulering har ikke oplysningsvirksomhed over for humane tumorceller til 5FUdR