PLoS ONE: Evaluering af “stjæle” Fænomen på effekten af ​​Hypoxi Aktiveret Prodrug TH-302 i bugspytkirtlen Cancer

Abstrakt

Bugspytkirtelkræft duktale adenokarcinomer er desmoplastiske og hypoxisk, som begge er forbundet med dårlig prognose. Hypoxi-aktiverede prolægemidler (Haps) er specifikt aktiveres i hypoxiske miljøer til at frigive cytotoksiske eller cytostatiske effektorer. TH-302 er en HAP, der i øjeblikket ved at blive evalueret i et klinisk fase III forsøg inden for bugspytkirtelkræft. Anvendelse af dyremodeller, viser vi, at tumor hypoxi kan forværres ved anvendelse af en vasodilator, hydralazin, forbedring TH-302 virkningsfuldhed. Hydralazine reducerer tumor blodstrømmen gennem “stjæle” fænomen, hvori atonal umodne tumorvaskulatur ikke spile samordnet med den normale vaskulatur. Vi viser, at MIA PaCa-2 tumorer udviser en “stjæle” effekt som svar på hydralazin, hvilket resulterer i nedsat tumor blodgennemstrømning og efterfølgende reduktion tumor pH. Effekten observeres ikke i SU.86.86 tumorer med modne tumorvaskulatur målt ved CD31 og glatmuskelactin (SMA) immunhistokemi farvning. Kombinationsbehandling af hydralazin og TH-302 resulterede i en reduktion i MIA PaCa-2 tumorvolumen vækst efter 18 dages behandling. Disse undersøgelser understøtter en kombination virkningsmekanisme for TH-302 med en vasodilator, der forbigående øger tumor hypoxi

Henvisning:. Bailey KM, Cornnell HH, Ibrahim-Hashim A, Wojtkowiak JW, Hart CP, Zhang X, et al. (2014) Evaluering af “stjæle” Fænomen på effekten af ​​Hypoxi Aktiveret Prodrug TH-302 i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 9 (12): e113586. doi: 10,1371 /journal.pone.0113586

Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: Juni 30, 2014, Accepteret: 26 oktober 2014; Udgivet: 22 December, 2014

Copyright: © 2014 Bailey et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud R01CA125627-02; R01CA077575-10; P30CA076292-16 (Robert J. Gillies) og P30CA023074-35 (Amanda F. Baker). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og forfatterne af dette manuskript har følgende konkurrerende interesser: Charles P. Hart er ansat af Threshold Pharmaceuticals. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

pancreas duktale adenokarcinomer (PDAC) patienter har ekstremt dårlige prognoser, med en 5-års overlevelse på ca. 6%. Overlevelse er fortsat lav på grund af både manglende tidlig påvisning af lokaliseret PDAC og ineffektivitet af traditionelle kemoterapi til at styre PDAC progression. Disse lave overlevelsesrater demonstrerer behovet for at udvikle nye behandlingsstrategier. Patologisk PDAC tumorer er stærkt forskellige og indeholde en dynamisk desmoplastiske stromal rum, som begge bidrager til tumorudvikling og kemoterapi modstand [1], [2]. Ud over at være en mekanisk barriere for penetration lægemiddel, desmoplastiske stroma bidrager til tumor hypoxi; en fælles fysiologisk træk af PDAC tumorer, er også forbundet med resistens mod kemoterapi og strålebehandling [3] – [5]. Hypoxi-associeret kemoterapi resistens kan medieres af: manglende lægemiddelafgivelse til tumoren grundet dårlig perfusion [4]; hypoxi-induceret resistens over for apoptose [6]; og nedsat celleproliferation af de hypoxiske cellefraktioner [7]. Derudover har vist hypoxiske tumorvæv at være steget metastatisk potentiale [8] og et flertal af PDAC tumorer til stede som metastatisk sene sygdom [9].

For nylig bestræbelser på at terapeutisk målrette hypoxiske rum af tumorer er blevet forfulgt gennem brug af hypoxi-aktiverede prodrugs (Haps). HAPs er relativt inaktiv i væv med normal iltning (PO

2), men er reduceret med udvalgte én-elektron oxidoreduktaser under hypoxiske betingelser for at frigive cytotoksiske sprænghoveder. En første generation HAP tirapazamin viste potentiel terapeutisk fordel i kombination med standardbehandling [10] – [12], og demonstrerede moderat succes i fase I – II kliniske forsøg [13], [14]. Ufuldstændig tumor penetration og en kort halveringstid har stimuleret bestræbelser på at designe forbedrede tirapazamin analoger med bedre opløselighed, cytotoksicitet, selektivitet og vævspenetration [15] – [17]. En anden generation HAP, TH-302 er samlet på en 2-nitroimidazol hypoxi-følsomme udløse og selektivt aktiveres under ekstrem hypoxi ( 0,5% O

2) frigive brom-isophosphoramide, en DNA krydsbinding cytotoksisk effektor [18]. TH-302 er meget effektiv i prækliniske xenograft tumormodeller [19], og er ved at blive undersøgt klinisk til flere kræftformer, herunder PDAC. Et fase I /II studie viste, at TH-302, i kombination med gemcitabin, øget progressionsfri overlevelse med 2 måneder til PDAC patienter [20], og denne kombination nu har avancerede til fase III (NCT01746979, EMD Serono).

Prækliniske TH-302

in vitro

in vitro

monoterapi identificerede følsomme og resistente bugspytkirtelkræft linjer ligner nøje klinisk respons i PDAC patienter [21], [22]. Som tumor hypoxi er påkrævet for TH-302-aktivitet, og fordi TH-302 udviser en tilskuer-virkning ved at dræbe celler i tilstødende normoksiske væv [22], vi hypotese, at TH-302 virkningsfuldhed kunne forbedres ved transient forøgelse af hypoxiske fraktion i faste tumorer . I silico modeller og eksperimentelle beviser viser, at den mest effektive metode til at mindske tumor pO

2 er at øge cellulære respiration [23]. Dette blev tidligere vist i koloncarcinomcellelinie, RKO, hvori farmakologisk inhibering af HIF-1α med echinomycin øget iltforbrug, nedsat tumor pO

2 og øget aktiviteten af ​​HAP, tirapazamin [24]. Denne behandling resulterede i en kronisk hypoksisk miljø, der kunne føre til yderligere hypoksisk tilpasning af tumorceller og HAP bivirkninger. Derimod foreslår vi, at forbigående og akut forværring af hypoxi, i kombination med TH-302, ville være mere effektiv med færre bivirkninger. Tidligere arbejde har også observeret, at exogent pyruvat forøger hypoxiske fraktion i pladecellecarcinom (SCC) tumorer [25] gennem en forbigående stigning i oxygenforbrug [26]. Vi har også observeret, at exogent pyruvat øget effektivitet af TH-302 i præklinisk SCC og PDAC modeller [26], [27]. At udforske alternative farmakologiske metoder til at forbigående forværre hypoxi og dermed øge den anti-tumor egenskaber af TH-302, vi heri undersøge “stjæle” fænomen. Den “stjæle” fænomen opstår, når vasodilatorer, såsom hydralazin, forårsager sunde blodkarrene til at udvide, der fører til nedsat systemisk blodtryk. Tumorvaskulatur er ofte umodne og atonal, mangler evnen til at snøre eller spile. Derfor under systemisk vasodilation, der er en fysiologisk reduktion i blodtrykket, som ikke kan matches af tumormikromiljøet og vaskulaturen. Den resulterende trykforskel skaber et forbigående fald i tumor perfusion, påvirker tumor fysiologi og resulterer i øget hypoxi og acidose [28] – [33]

I denne undersøgelse har vi den hypotese, at hydralazin kan anvendes akut at reducere perfusion. og øge hypoxi i tumor mikromiljø, hvilket vil øge effektiviteten af ​​TH-302. Vi valgte tre menneskelige bugspytkirtelkræft cellelinje xenograftmodeller, som tidligere var blevet vist at være variabelt følsomme over for TH-302 monoterapi [18], [21], [22]. Tumor pH blev målt før og efter administration af hydralazin som biomarkør for reduceret perfusion. Ændringer i blodgennemstrømning følgende hydralazin behandling blev kvantitativt målt ved anvendelse Doppler ultralyd til at bekræfte en reduktion i tumor perfusion og udforme doseringsregime for at maksimere virkningen af ​​”stjæle” fænomen. Kombinationsbehandling af hydralazin og TH-302 blev evalueret med den hypotese, at hydralazin behandling ville øge TH-302 effekt i “stjæle” -følsom linjer. Resultaterne viste, at hydralazin forbedret TH-302 effekt, omend effekten størrelse var lille og var kun moderat betydning i tumorer (MIA PaCa-2), der udviser mellemliggende følsomhed over for TH-302 som monoterapi.

Materialer og metoder

Cell Culture

SU.86.86 og Hs766t celler blev opnået fra Threshold Pharmaceuticals (South San Francisco, CA) og MIA PaCa-2 celler blev opnået fra American Type Cell Collection (ATCC, Manassas, VA). Celler blev holdt i overensstemmelse med ATCC retningslinjer. Celler blev inkuberet i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS (Hs766t og SU.86.86) eller DMEM suppleret med 10% FBS (MIA PaCa-2), og blev holdt ved 37 ° C i 5% CO

2. Mycoplasma og cellelinie ægthed (karyotype) tests blev udført.

Animal Studies

Alle procedurer var i overensstemmelse med vejledningen for pasning og anvendelse af forsøgsdyr Resources (1996), National Research Council, og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg, University of South Florida under den godkendte protokol R4033. Immunkompromitterede mus blev opstaldet i en ren facilitet med særlige vilkår, der omfatter HEPA filtreret ventilerede bure, autoklaveret strøelse, autoklaveres boliger, autoklaveret vand, bestrålet mad og særlige bur skiftende procedurer. Mus blev aflivet af CO

2 indånding ved tumorer bidraget til en gevinst på 20% i kropsvægt i forhold til kontroller på samme tidspunkt, eller mus oplevet en 10% tab i kropsvægt, en tumor målt større end 2000 mm

3, eller mus viser tegn på dissemineret sygdom såsom pulmonal metastaser angivet med anstrengt vejrtrækning. Alle dyr blev huset ved enten USF Vivarium inden Moffitt Cancer Center eller inden for Arizona Cancer Center facilitet

SCID-beige hunmus (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) blev inokuleret med 5 -. 10 × 10

6 celler i 1: 1 Matrigel (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ): PBS-opløsning subkutant på højre flanke. Tumorvækst blev overvåget hver anden uge med elektroniske kalibre hele varigheden af ​​eksperimenterne. Tumorvolumener blev beregnet ved hjælp af: volumen = (

l

×

w

2) /2, hvor

l

= længste længde og

w

= korteste længde. Orthotopisk Pancreastumor model: Nude hanmus (n = 3) blev injiceret med 1 x 10

6/20 pi MIA PaCa-2-celler i PBS. Mus blev bedøvet med 3% isofluran og opretholdt med 1,5% isofluran under hele proceduren. Efter lateral incision blev milten og distale pancreas mobiliseres og celler injiceret direkte i pancreas. Den abdominale indre væg blev syet, og den ydre hud incision blev lukket med hæfteklammer. Analgesi blev administreret til det kirurgiske sted til smertelindring. Mus blev overvåget dagligt indtil kramperne blev fjernet, cirka en uge. Tumor volumen blev overvåget ugentligt af ultralyd.

pH-elektrode

pH-målinger blev opnået ved hjælp af en FE20 Five Easy pH-meter (Mettler-Toledo, Columbus, OH). Alle dyr blev bedøvet med isofluran (3,5%), og forblev under anæstesi (1,5-3,5% isofluran) under hele forsøget. En reference og pH-elektrode (MI-401F og MI-408B henholdsvis Mikroelektroder Inc., Bedford, NH) blev anvendt til måling af pH ved først at indsætte den referenceelektrode (OD 1 mm) under huden på musen nær tumoren (flanke). PH-elektroden (OD 0,8 mm) blev derefter indsat op til 1,3 cm i midten af ​​hver subkutan tumor. Elektroder blev kalibreret før og efter hvert sæt målinger. To målinger blev taget på hvert tidspunkt og gennemsnittet beregnes. Efter de indledende pH-målinger blev dyrene indgivet 100 pL intraperitoneal (ip) injektion af 10 mg /kg hydralazin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). PH blev målt hvert 30. minut op til tre timer efter IP-injektion, og omhu for at måle pH i omtrent samme sted i tumoren ved hvert tidspunkt. Efter den sidste pH-måling blev dyrene aflivet, og tumorerne blev høstet til histologi.

Data blev bearbejdet ved at tage gennemsnittet af de to pH-værdier målt på hvert tidspunkt. Ændringen i pH, eller delta (Δ (

t

), hvor

t

er tiden efter injektion af hydralazin eller saltvand, i minutter) blev målt som forskellen mellem det første tidspunkt pH og hvert efterfølgende tidspunkt pH. For hver tumor, den gennemsnitlige delta (

Gennemsnitlig

Δ) er den gennemsnitlige delta for alle dyr af denne tumortype:

Hvor

t

er tid, der spænder fra 30 til 180 minutter efter injektion,

En

er dyret,

n

t

er antallet tidspunkter målt, og

n

A

er antallet af dyr med denne tumortype. Den maksimale ændring i pH på noget tidspunkt efter injektion blev identificeret for hvert enkelt dyr. Den gennemsnitlige maksimale over hver tumortype blev beregnet, og blev også identificeret den største ændring for nogen dyr i hver gruppe. Antallet af dyr målt varierede pr tumortype: Hs766T, n = 3; MIA PaCa-2 n = 4; og SU.86.86, n = 7.

OxyLite

Tumor iltning niveauer blev overvåget ved hjælp OxyLab (Oxford Optronics, Oxford, UK) tredobbelt parameter E-serien fiberoptiske sonder, der blev indsat i alle tumorer. Disse præ-kalibrerede hypoxi pæle er baseret på luminescens quenching og måling af pO2 er baseret på oxygen-standset levetid luminescerende farvestof. Signaler fra OxyLab sonden blev erhvervet ved hjælp af OxyLab pO2 E og OxyLab LDF overvågningssystemer tilsluttet en pc. Output datasignaler fra disse skærme blev konverteret til pO2 (mmHg) værdier og registreres i realtid ved hjælp af en multi-kanal dataopsamlingssystem (PowerLab 8SP, ADInstruments, Australien), der kører under Chart til Windows (Ver.5.02, ADInstruments, Australien) . Bedøvede mus (Isofluran, 100% O

2) blev fastspændt på en brugerdefineret immobilisering platform for at forhindre bevægelse og eftermonteres med en varmepude til at opretholde kroppens temperatur. Ekstra forholdsregler blev taget for at forhindre enhver bevægelse af hypoxi sonder samt begrænse indblanding fra eksterne lyskilder derved eliminere artefakt. Pæle (OD ~450 um) blev indsat i tumoren og fikseres i position ved hjælp stereotaktiske fremgangsmåder. Indtræden i hver af tumorerne blev foretaget med en 19 g kanyle og pæle blev fodret ind i tumoren ved ~ 3 mm fra tumor overflade og nål blev trukket tilbage. Pæle blev omhyggeligt markeret med gradueringer for at nå den samme dybde i alle tumorer. Tumor PO2 niveauer blev overvåget, indtil en stabil basislinie iagttoges. Tidstro målinger blev taget i 10 minutter ved baseline og konstant i 60 minutter efter en 100 pi intraperitoneal (ip) injektion af 10 mg /kg hydralazin. Tumor iltnings- niveauer før og efter hydralazin injektioner blev sammenlignet. Antallet af dyr målt: MIA PaCa-2 n = 4.

Ultralydbilleddannelse

Ultralydsscanning blev udført på Vevo2100 med 22-55 MHz transducer MS550D (VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada). Mus bærende MIA PaCa-2-tumorer (n = 4) blev bedøvet (som beskrevet ovenfor) gennem varigheden af ​​billeddannelse. Color Doppler billeder blev taget for at etablere placeringen af ​​en større blodkar i tumoren. Når et tilstrækkeligt stort blodkar var placeret, blev en pulseret Wave (PW) Doppler udtaget til kvantificering af strømning. Dyret modtog en 100 pi injektion af 10 mg /kg hydralazin, og strømmen i den samme blodkar blev målt hvert 5. minut i 30 minutter. For Mia PaCa-2 ortotopisk tumorer, blodgennemstrømning blev målt i 180 minutter.

Drug regimer og tumorvækst Kinetics Overvågning

Dyr blev parret modsvares af tumor volumen (som beregnet ved hjælp af elektroniske calipre), når tumorer nåede -200 mm

3. Dyrene blev opdelt i fire narkotika behandlingsgrupper (n = 9 dyr pr behandlingsgruppe for Hs766T og SU.86.86, tal angivet for MIA PaCa-2): i) TH-302 (n = 9), ii) Hydralazine (n = 7 ), iii) TH-302 + Hydralazine (n = 7) og iv) Saline (kontrol, n = 10). Behandlingerne blev administreret som ip injektioner til un-bedøvede dyr. Doserne var 50 mg /kg TH-302 i 200 pi saltvand for hvert dyr i gruppe I og III, 10 mg /kg hydralazin i 100 pi saltvand per dyr [29] i gruppe II og III, og 200 pi saltvand til gruppe IV . Gruppe iii modtaget hydralazin 30 minutter før administration af TH-302. Under samtidig dosering af hydralazin og TH-302, hydralazin blev injiceret ip umiddelbart inden TH-302. Alle behandling planer blev administreret qdx5 i to samtidige uger. De tumor volumen blev målt to gange om ugen ved hjælp af elektroniske calipre for varigheden af ​​forsøget.

Tissue Forarbejdning og Immunhistokemi

Ved afslutningen af ​​de

in vivo

undersøgelser, dyr blev aflivet og tumorer blev udskåret. Tumorer blev fikseret i formalin og indlejret i paraffin til yderligere behandling. Farvning for hematoxylin og eosin (H 20% i kropsvægt i forhold til kontroller på samme tidspunkt, eller mus oplevet en 10% tab i kropsvægt, en tumor målt større end 2000 mm

3, eller mus viser tegn på dissemineret sygdom såsom pulmonal metastaser angivet med vanskelige besværet vejrtrækning.

Resultater

Tidligere undersøgelser har vist en variabel reaktion på tre PDAC cellelinjer , Hs766t, MIA PaCa-2 og SU.86.86, at TH-302 monoterapi både

in vitro

in vivo

. Behandling af celler dyrket under anoxiske forhold med TH-302 viser, at MIA PaCa-2 celler er de mest følsomme (IC

50 = 2,1 ± 0,7 mmol /l); SU.86.86 reagerer moderat (IC

50 = 12 ± 1,2 mmol /l); og Hs766t den mindst følsomme (IC

50 = 60 ± 7,5 mmol /l) [21]. Interessant

in vivo

, tumor xenograftmodeller med de samme cellelinjer viser forskellige reaktioner på TH-302 monoterapi. Hs766t reagerede mest positivt på TH-302 behandling [22], med komplet hæmning af tumorvækst, mens MIA PaCa-2 tumorer var moderat lydhør [34] og SU.86.86 tumorer er resistente over for TH-302 monoterapi [33]. Den differentierede respons PDAC celler

in vitro

in vivo

understreger betydningen af ​​den hypoxiske fraktion inden for en tumor for maksimal TH-302 effekt

in vivo

, som SU .86.86 tumorer er stærkt vaskulariserede og godt iltet, mens Hs766t tumorer har store hypoxiske fraktioner [19] og en mutation i homologien-afhængige DNA-reparation (HDR) -gen FANCG hvilket gør dem mere følsomme over for Br-IPM effektor [35].

hydralazine og “stjæle” effekt

Siden har tidligere vist hydralazin behandling for at reducere tumor blodgennemstrømning

in vivo

[28], vi hypotese, at hydralazin kunne anvendes til forbigående øge hypoxiske fraktion i tumorer og øge TH-302 virkningsfuldhed. Hydralazin har også vist sig at øge tumor acidose [29], som kan være en effektiv metode til at identificere tumorer, der udviser en “stjæle” effekt, der ville være mere følsomme over for kombinationsterapi. For at teste hypotesen, mus bærende subkutane SU.86.86 blev MIA PaCa-2 eller Hs766t tumorer bedøvet og tumor pH blev målt under anvendelse af en pH-mikroelektrode. For at måle pH-ændringer som følge af blodgennemstrømning ændringer blev mus administreret 10 mg /kg hydralazin via intraperitoneal (ip) injektion. Tumor pH-målinger blev opnået hver 30 minutter efter hydralazin behandling i tre timer. Vi antager, at tumorer, som udviser den “stjæle” effekt vil opleve tumor forsuring efter hydralazin behandling. TH-302 følsom Hs766t tumorer (n = 3) udviste ingen ændring i gennemsnitlig pH efter behandling med hydralazin (fig. 1). TH-302 resistente SU.86.86 tumorer (n = 7), der imidlertid opstå en paradoksal lille stigning i pH (+0,05 pH-enheder) efter behandling med hydralazin (fig. 1). MIA Paca-2 tumorer (n = 4), der er moderat reagerer på TH-302, konsekvent udviste en reel “stjæle” effekt efter hydralazin behandling, oplever en væsentlig reduktion i pH (- 0,12 pH-enheder) i forhold til SU.86.86 (

s

0,007) og Hs766t (

s

. 0,05) (figur 1). Selvom heterogenitet eksisterede mellem tumorprøver, hver undersøgt prøve reagerede på samme måde som de andre tumorer i deres kohorter, som det fremgår ved at observere enkelt maksimum dyr forandring, gennemsnittet af den maksimale respons fra hvert dyr i løbet af eksperimentet og den gennemsnitlige ændring i pH for hver dyr for hvert tidspunkt målte (fig. 1). Disse resultater indikerer, at administration af hydralazin medførte nedsat perfusion i MIA PaCa-2 tumorer, men påvirkede ikke perfusion i enten Hs766t eller SU.86.86 tumorer.

Mus bærer subkutane SU.86.86 (n = 7), Hs766t (n = 3) eller MIA PaCa-2 (n = 4) flank tumorer blev bedøvet og tumor pH-målinger blev opnået. En reference elektrode blev indsat under huden på musen i en ikke-tumor, medens pH elektrode blev indsat op til 1,3 cm i midten af ​​hver tumor. To målinger blev taget på hvert tidspunkt og gennemsnittet beregnes. Efter de indledende pH-målinger blev mus administreret 10 mg /kg hydralazin via ip injektion. Tumor pH blev målt i 3 timer efter behandling. Data, rapporterede repræsenterer den gennemsnitlige maksimale ændring i hver kohorte, den gennemsnitlige pH-ændring for hver kohorte og enkelt maksimum dyr pH-ændring for hver kohorte. Data rapporteres som gennemsnitlig ændring i pH ± SEM. *

P

0,05; **

P

. 0,007

For yderligere at udforske virkningerne af hydralazin på tumorer, der udviste den “stjæle” effekt, vi brugte Doppler ultralyd til at måle tumor blodgennemstrømning efter hydralazin behandling i MIA PaCa-2 tumorer. Før hydralazin behandling blev farve Doppler billeder opnået tværs MIA PaCa-2-tumorer (n = 4) for at identificere større tumorvaskulatur (fig. 2A, venstre panel). Ved hjælp af en pulserende Wave (PW) Doppler, blev blodgennemstrømning gennem tumorvaskulatur målt over 30 minutter efter hydralazin ip administration (fig. 2A, højre panel). Vi observerede en reduktion i blodgennemstrømningen inden for 15 minutter hydralazin injektion (fig. 2A, højre panel). Kvantificering af disse data bekræftede en reduktion i tumor blodgennemstrømning begynder 15 minutter efter hydralazin injektion med en fortsat nedgang gennem 30 minutter (fig. 2B). Virkningen af ​​hydralazin på blodgennemstrømningen kan vedvare længere end 30 minutter. For at udforske denne mulighed, blodgennemstrømning i Mia PaCa-2 ortotopisk pankreatiske tumorer (N = 3), en tumor model, der er mere fysiologisk relevant, blev overvåget ved Doppler ultralyd i 180 minutter. Blood flow reduceret til minimale niveauer med 30 minutter, understøtter de subkutane tumor observationer, men i de ortotopisk tumorer, blodgennemstrømning forblev på dette niveau i 90 minutter med genvinding sted mellem 90 og 120 minutter. På grund af lighederne i blodgennemstrømningen mellem subkutane og ortotopisk Mia PaCa-2 tumorer, var vi overbeviste om, at overvågning tumor iltning (70 minutter) ved hjælp af ilt elektroder i subkutane tumorer (N = 5) ville være en nøjagtig gengivelse. Svarende til pH elektrode data, tumor iltindholdet faldt inden for 5 minutter efter hydralazin men vendte ikke tilbage til baseline inden for tidsrammen af ​​denne undersøgelse. Heterogenitet blev observeret som graden af ​​oxygen tilbagegang varieret (fig. 2D).

mus med MIA PaCa-2-tumorer blev analyseret ved Doppler ultralyd til at kvantificere tumor blodgennemstrømning. A)

Venstre panel:

tumorer blev scannet ved hjælp af farve Doppler imaging at identificere større tumorvaskulatur før behandling. Rød repræsenterer blodstrømmen gennem tumorvaskulatur. Hvid pilene vaskulatur valgt til analyse.

Højre panel:

Efter hydralazin administration, Pulsed Wave (PW) Doppler anvendtes hvert 5. minut i 30 minutter for at kvantificere blodgennemstrømning gennem tumorvaskulatur. Repræsentative diagrammer, der viser et fald i tumor blodgennemstrømning efter hydralazin behandling. B) Kvantificering af tumor blodgennemstrømning ændringer i MIA PaCa-2 subkutane tumorer (n = 4) efter hydralazin behandling. Data er rapporteret som middelværdi hastighed (mm /sek) ± SEM. C) Kvantificering af tumor blodgennemstrømning ændringer i Mia PaCa-2 ortotopisk pankreatiske tumorer (n = 3) efter hydralazin behandling. Data er rapporteret som middelværdi hastighed (mm /sek) ± SEM. D) Tumor iltning blev målt før og efter hydralazin hjælp OxyLite (oxygen) nåleelektroder i subkutane Mia PaCa-2 tumorer (N = 5). Målingerne indsamlet over tid på et enkelt sted inden tumoren. Komplet eksperimentelle detaljer kan findes i afsnittet metoder. Data er præsenteret som pO2 (mmHg). Pilen ved T = 10 minutter betegner, I.P. injektion af hydralazin.

Histologisk evaluering af PDAC kar

Tumor prøver fra hver cellelinje blev analyseret histologisk at karakterisere kar. CD31 og glatmuskelactin (SMA) er to almindelige tumorvaskulatur immunhistokemisk (IHC) markører, der identificerer tilstedeværelsen (CD31), og løbetiden og tone (SMA) af vaskulatur. Tumorer med betydelig kar, der tonale forventes ikke at udstille den “stjæle” fænomen, som tumorvaskulaturen ville spile i koordination med de systemiske virkninger af hydralazin behandling. Brug positiv pixel analyse, vi kvantificeret procentdelen af ​​Hs766t, SU.86.86 og MIA PaCa-2 tumorer, der indeholdt CD31 og SMA farvning. I overensstemmelse med tidligere resultater, SU.86.86 tumorer havde signifikant mere CD31 (

s Restaurant 0,05) (. Figur 3A-B) farvning end enten Hs766t eller MIA PaCa-2, og signifikant mere SMA (

s

. 0,005) end MIA PaCa-2 tumor prøver (figur 3A, C). Disse data indikerer, at SU.86.86 tumorer er godt vaskulariserede med modne kar, der kunne forventes at spile som reaktion på hydralazin behandling. MIA Paca-2 og Hs766t tumorer havde lignende mængder af CD31-farvning (fig. 3A-B). MIA PaCa-2 tumorer havde den mindste mængde af SMA-farvning blandt de tre testede (fig. 3A, C) tumorer. Disse data indikerer, at MIA PaCa-2 vaskulatur er umodne og atonal. Som MIA PaCa-2 tumorer vises nedsat tumor blodgennemstrømning (fig. 2) og en efterfølgende fald i tumor pH (fig. 1), konkluderer vi, at MIA Paca-2 tumorer udviser den “stjæle” effekt på grund af umodne tumorvaskulatur.

Hs766t, MIA PACA-2 og SU.86.86 tumorer blev fikseret og indlejret i paraffin som forberedelse til IHC farvning for tumorvaskulaturen markører, CD31 og SMA. A) Repræsentative billeder af tumorer farvet med CD31 og SMA. Scale søjler repræsenterer 100 um. Positive pixel analyse af B) CD31 og C) SMA-farvning over hele området af en tumor. Data præsenteres som% Positivitet [(Positive pixels /samlede pixels) × 100] ± SEM. *

P

0,05; **

P

. 0,005

Hydralazine forbedrer TH-302-aktivitet in vivo

For at teste TH-302 monoterapi og kombinationsbehandling med hydralazin for hver celle line xenograft blev mus implanteret med subkutan Hs766t, SU.86.86 eller MIA PaCa-2 flank tumorer og parvist sammensat i fire kohorter: ubehandlede (saltvand), TH-302 alene (50 mg /kg ip), hydralazin alene (10 mg /kg ip) og TH-302 /hydralazin kombinationsbehandling. I kombinationsterapi, blev TH-302 indgivet 30 minutter efter hydralazin administration som dette syntes at være tidspunktet for maksimal effekt på perfusion post-hydralazin. Alle kohorter blev behandlet i to cykler af 5 på hinanden følgende behandlinger efterfulgt af 2 dage off, og tumorvolumener blev overvåget med elektroniske kalibre i løbet af undersøgelsen. Tumor volumenkontrol af TH-302 monoterapi eller kombinationsbehandling blev anset tabt, når tumorer nåede 1000 mm

3, som er nærmere beskrevet i Kaplan Meier kurver. Som forventet, Hs766t tumorvækst var helt hæmmet med TH-302 monoterapi (fig. 4A-B), SU.86.86 tumorvækst var upåvirket af TH-302 monoterapi (fig. 4C-D) og MIA Paca-2 tumorer reagerede moderat til behandling (fig. 4E-F). Kombinationsbehandling af hydralazin efterfulgt af administration af TH-302 havde nogen gavnlig effekt på tumorvolumen kontrol i mus, der bærer Hs766t eller SU.86.86 tumorer i forhold til kohorter behandlet med TH-302 monoterapi. Vigtigt er, ingen af ​​disse tumormodeller udviste den “stjæle” effekt efter hydralazin administration (fig. 1). MIA PaCa-2 tumorer reagerer moderat til TH-302 monoterapi (fig. 4E-F) og oplevet en stigning i tumor acidose på grund af reduceret tumor blodgennemstrømning efter hydralazin behandling (fig. 1). Mus med MIA PaCa-2 tumorer oplevede en beskeden yderligere reduktion i tumor volumen vækst, når de behandles med TH-302 /hydralazin kombinationsbehandling sammenlignet med TH-302 monoterapi (fig. 4E-F). På trods af en tendens til reduktion i tumorvækst mellem TH-302 /hydralazin kombinationsbehandling og TH-302 monoterapi, statistiske analyser af vækstkurver indikerer, at forskellene ikke nåede statistisk signifikans (

s

0,08). Dette forsøg blev gentaget to gange mere med lignende resultater (data ikke vist). I alle tilfælde havde MIA PaCa-2 tumorer behandlet med kombinationsbehandling reduceret vækst, men det var ikke signifikant lavere (p = 0,08) end den TH-302 monoterapi gruppe. Ved at kombinere data fra alle forsøg ikke ændre signifikansniveauer.

Mus bærer subkutan Hs766t (n = 9 pr kohorte), SU.86.86 (n = 9 pr kohorte) eller MIA PaCa-2 (numrene i parentes for hver behandling kohorte) tumorer var parvist sammensat i 4 kohorter: saltvandskontrol (n = 10), TH-302 alene (n = 9), hydralazin alene (n = 7), og TH-302 + hydralazin (n = 7 ).