PLoS ONE: Molekylær karakterisering af cirkulerende tumorceller i Human metastatisk colorectal Cancer

Abstrakt

Metastatisk kolorektal cancer (mCRC) er afhængig af udstationering af aggressive maligne celler fra den primære tumor i blodbanen og samstemmende, at tilstedeværelsen af ​​disse Cirkulerende tumorceller (CTC) er associeret med en dårlig prognose. I dette arbejde blev den molekylære karakterisering af CTC fra FRK patienter nærmede sig, med det formål at forstå deres biologi og forbedre deres kliniske anvendelighed i forvaltningen af ​​patienter med tarmkræft. Til dette blev EpCAM-baserede immunisolering af CTC kombineret med hele transkriptom forstærkning og hybridisering på cDNA microarrays. Genekspression data fra FRK patienter, når baggrunden af ​​uspecifik immunisolering fra en gruppe af kontroller var blevet fratrukket, resulterede i 410 gener, der karakteriserede CTC befolkning. Bioinformatik blev anvendt til biologiske fortolkning af dataene, hvilket viste, at CTC er kendetegnet ved gener relateret til celle bevægelse og adhæsion, celledød og proliferation og cellesignalering og interaktion. RTqPCR på en uafhængig serie af FRK-patienter og kontroller blev anvendt til validering af en række gener relateret til de vigtigste cellulære funktioner karakteriserer CTC befolkning. Sammenligning mellem primære carcinomer og lunge og levermetastaser yderligere involverede CTC-gener i fremme af metastaser. Desuden korrelationen mellem CTC-genekspression med kliniske parametre viste afsløring og prognose betydning. Konklusionen er, at molekylær karakterisering af CTC fra FRK patienterne og identifikation af diagnostiske og prognostiske biomarkører repræsenterer en innovativ og lovende tilgang i den kliniske håndtering af denne type patienter

Henvisning:. Barbazan J, Alonso-Alconada L , Muinelo-Romay L, Vieito M, Abalo A, Alonso-Nocelo M, et al. (2012) Molekylær karakterisering af cirkulerende tumorceller i Human metastatisk colorectal cancer. PLoS ONE 7 (7): e40476. doi: 10,1371 /journal.pone.0040476

Redaktør: Xin Wei Wang, National Cancer Institute, USA

Modtaget: Januar 17, 2012; Accepteret: 8 jun 2012; Udgivet: 10. juli 2012 |

Copyright: © 2012 Barbazan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist finansieret af det spanske sundhedsministerium (KP08 /00142) og Europa-Kommissionen Program Fondo Europeo de Desarrollo Regional (EFRU). Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse. J. Barbazan og L. Alonso-Alconada er modtagere af stipendier fra det spanske ministerium for uddannelse og videnskab og den baskiske regering (Spanien), hhv. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft hos mænd og den anden hos kvinder, med over 1,2 millioner nye kræfttilfælde skønnes at have fundet sted i hele verden i 2008 [1]. Klinisk, fjernt tumor formidling og metastase er de vigtigste faktorer i prognosen: mens ikke-invasiv trin I karcinomer præsentere en 90% for fem år overlevelse, fase IV carcinomer med fjernmetastaser korrelerer med et dramatisk fald til en overlevelse på 10% [2 ]. Derfor nye terapeutiske strategier til forbedring af effektiviteten mod metastatisk sygdom og præcise biomarkører for opfølgning af CRC patienter er store udfordringer, sammen med tidlig opsporing og screening i højrisiko-populationer.

Spredning af kræft er afhængig af frigørelsen af ​​aggressive maligne celler fra den primære tumor i blodstrømmen som hovedkilde af den yderligere metastase [3]. Det er almindeligt accepteret, at Cirkulerende tumorceller (CTC) egen eller erhverve evnen til at unddrage værtens immunsystem og for at nå en fjern orgel, normalt lever i CRC, hvor de etablerer en sekundær tumorvækst websted i en meget ineffektiv, men dramatisk proces [4]. Samstemmende, har tilstedeværelsen af ​​CTC i perifert blod blevet forbundet med dårlig prognose i forskellige typer af cancer, herunder CRC [5], [6]. Som formodede grundlæggere i genereringen af ​​metastaser, er CTC blive et felt af interesse, og forståelsen af ​​deres biologi kan åbne nye perspektiver i onkologi. Vedrørende deres molekylære karakterisering, i de senere år har en række grupper har præsenteret udtryk data fokuserer på bestemte gener eller signalveje i forbindelse med kræft til forbedring af følsomheden og specificiteten af ​​detektionssystemet [7], [8]. Smirnov et al. nærmede sig profilering af CTC gennem en diverse bryst, prostata og kolorektal metastatisk perspektiv [9]. Derudover er data at opstå på muligheden for at studere biologien og nytte at evaluere målrettede behandlinger baseret på den genomiske profilering af CTC [10], [11].

Inden for dette scenario, defineret af en begrænset effekt af de nuværende kemoterapier i behandlingen af ​​metastatisk CRC (mCRC) og CTC som centrale aktører i forvaltningen af ​​metastatisk sygdom, blev specifik molekylær profilering af CTC befolkning nærmede sig. Kombinationen af ​​CTC EpCAM-baserede immunisolering og nøjagtig ekstraktion af RNA fra det meget lille antal CTC plus hele transkriptom amplifikation, gjort det muligt at hybridisere cDNA fra CTC population på gen-ekspression microarrays. Ved at anvende denne procedure til en gruppe af FRK patienter sammenlignet med baggrunden af ​​uspecifikke isolerede hæmatopoietiske celler blev populationen af ​​immunisolerede CTC profileret specifikt. Ud over den molekylære karakterisering af CTC for forståelsen af ​​biologi en hovedkilde til metastaser i CRC disse data leveres potentielle terapeutiske mål og diagnostiske /prognostiske biomarkører.

Resultater

CTC immunisolering og Molekylær profilering

procedurerne for CTC immunisolering, RNA ekstraktion og forstærkning for hybridisa; tion på cDNA microarrays er afbildet i figur 1A. Kort beskrevet blev CTC immunisoleret fra 7,5 ml perifert blod fra trin IV FRK patienter (n = 6; Tabel S1). Magnetiske perler blev anvendt, som blev overtrukket med et monoklonalt antistof mod human epitelcelle adhæsionsmolekyle (EpCAM), en overflade molekyle højt udtrykt i epithel-oprindelse tumorer, såsom CRC. RNA fra isolerede CTC blev oprenset ved anvendelse af et kit specielt designet til lav hyppighed prøver. Samtidig blev den samme protokol anvendt på blodprøver fra raske donorer (n = 3) at etablere baseline af baggrunden fra uspecifik ikke-CTC immunisolering. Forud for genekspression analyse blev tilstedeværelsen af ​​isoleret CTC bekræftet ved direkte immunofluorescens visualisering under anvendelse af en cocktail af antistoffer mod cytokeratiner 8, 18 og 19 (fig S1), og ved en kombination af to biomarkører valideret til nøjagtig kvantificering af CTC i mCRC patienter (GAPDH-CD45; [12]) (Mann-Whitney U, p-værdi 0,05) (figur 1B). Desuden nøjagtigheden af ​​den metode vurderes som opsvinget sats i immunisolering resulterede i en median på 91,56% (Metoder S1).

(A) Skematisk fremstilling af den procedure, der anvendes til CTC molekylær karakterisering. CTC blev isoleret fra 7,5 ml perifert blod ved immunomagnetisk separation under anvendelse af anti-EpCAM belagte magnetiske kugler. Isolerede celler blev underkastet en RNA-ekstraktion efterfulgt af en hel transkriptom amplifikationsproces (WTA). Endelig amplificeret cDNA blev hybridiseret på Agilent genekspression arrays. (B) GAPDH-CD45 niveauer i kontroller og FRK patienter målt ved real time PCR. Vandrette søjler repræsenterer medianen værdi af hver gruppe (* p 0,05). (C) Spearman korrelationsanalyse mellem GAPDH-CD45-niveauer opnået både fra post-array-data og qPCR tidligere til WTA forstærkning. (D) SAM-analyse output graf, der viser genekspression forskelle mellem gruppen af ​​patienter og kontroller. Dots fremhævet svarer til gener med statistisk signifikante øgede niveauer af ekspression i gruppen af ​​patienter, sammenlignet med kontrolgruppen baggrund, overvejes at karakterisere CTC befolkning fra mCRC.

For at karakterisere CTC befolkning isolerede fra FRK patienter, den metode beskrevet af Gonzalez-Roca et al. blev tilpasset, til nøjagtig genekspressionsprofilering af meget små cellepopulationer [13]. Dybest set blev oprenset RNA behandles yderligere med DNasel, amplificeret under anvendelse af WTA2 hele transkriptom amplifikationsmetode, og komplementært DNA blev mærket og hybridiseret på Agilent ekspressionsvektorer arrays (figur 1A) (Gene Expression Omnibus, GEO Accessionsnummer:. GSE3