PLoS ONE: Landskab Målrettet Anti-Cancer Drug Synergier i melanom Identificerer en Novel BRAF-VEGFR /PDGFR kombinationsbehandling

Abstrakt

En nyere generation af anti-cancer medicin rettet mod underliggende somatiske genetiske driver begivenheder har resulteret i høj single-agent eller single-pathway responsrater hos udvalgte patienter, men få patienter opnår komplet respons og en betragtelig fraktion af patienter tilbagefald inden for et år. Således er der et presserende behov for identifikation af kombinationer af målrettede midler, der inducerer mere komplet respons og forebygge sygdomsudvikling. Vi beskriver resultaterne af en kombination skærm af et hidtil uset omfang i pattedyrsceller udført ved anvendelse af en samling af målrettede, klinisk medgørlige midler over et stort panel af melanoma cellelinier. Vi finder, at selv de mest synergistiske narkotika par er kun effektive i et diskret antal cellelinjer, der ligger til grund en stærk sammenhæng afhængighed for synergi, med stærke, udbredte synergier ofte svarer til ikke-specifikke eller off-target narkotika effekter såsom multiresistens protein 1 (MDR1) transporter hæmning. Vi identificerede stoffer sensibiliserende cellelinier, der er BRAF

V600E mutant men uløseligt resistente over for BRAF inhibitor PLX4720, herunder vaskulær endotelvækstfaktor receptor /kinase insert domæne receptor (VEGFR /KDR) og blodpladeafledt vækstfaktorreceptor (PDGFR) familie inhibitor cediranib. Kombinationen af ​​cediranib og PLX4720 induceret apoptose

in vitro

tumorregression i dyremodeller. Denne synergistiske interaktion skyldes sandsynligvis indgreb af multiple receptor (RTK’er), hvilket viser potentialet i lægemiddel- stedet genspecifikke kombination opdagelse tilgange. Patienter med forhøjet biopsi KDR udtryk viste nedsat progressionsfri overlevelse i forsøg med mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) kinase pathway hæmmere. Således high-throughput uvildig screening af målrettede kombinationer narkotika, med passende bibliotek udvælgelse og mekanistisk opfølgning, kan give klinisk-handlingsrettede lægemiddelkombinationer

Henvisning:. Friedman AA, Amzallag A, Pruteanu-Malinici I, Baniya S, Cooper ZA, Piris A, et al. (2015) Landskab af målrettet Anti-Cancer Drug Synergier i melanom Identificerer en Novel BRAF-VEGFR /PDGFR kombinationsbehandling. PLoS ONE 10 (10): e0140310. doi: 10,1371 /journal.pone.0140310

Redaktør: Suzie Chen, Rutgers University, UNITED STATES

Modtaget: August 22, 2015; Accepteret: September 24, 2015; Udgivet: 13. oktober 2015

Copyright: © 2015 Friedman et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (P01CA163222 og R21CA175907 til DEF, 1K08CA160692-01A1 og U54CA163125 til kæben, 1U54HG006097-01 til CHB), Dr. Miriam og Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (DEF), den Doris Duke Medical Foundation (DEF), en Elsa U. Pardee Foundation tilskud (DEF), en Fred Lovejoy Resident Forskning og Uddannelse Award (AAF), en Brigham og kvinders Hospital Institut for Dermatology NIH Training Grant T32AR007098-38 (AAF), og tilskud fra Wellcome Trust (086.357 og 102.696, CHB, DAH)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser .

Introduktion

Selvom svarprocenter inden genetisk udvalgte subpopulationer af patienter solide tumor kræft kan være høj, såsom 60-80% blandt

BRAF

V600E

mutant melanom patienter, der fik den BRAF-hæmmer vemurafenib [1], få patienter opnå single-agent komplet respons. Således et betydeligt antal patienter har iboende modstandsdygtighed over for MAPK-vejen inhibering. Selv blandt patienter, der reagerer, vil de fleste udvikler erhvervet resistens inden for et år, ofte på grund af yderligere mutationer eller bypass veje [2, 3]. For nylig flere grupper har opdaget mekanismer erhvervet resistens over for BRAF målrettet terapi, som regel i oprindelig følsomme cellelinjer såsom A375 [4-7], der peger på kompleksiteten i at identificere bjærgning terapeutisk strategi og få undersøgelser har behandlet

de novo

modstand mod vemurafenib i forbindelse BRAF

V600E [8]. Drug kombinationer har potentiale til at løse

de novo

og erhvervet resistens, men forudsige narkotika kombination aktivitet fra enkelte agenter er endnu ikke muligt dels fordi der kun relativt små datasæt af kombination eksisterer. Kandidat-baserede opdagelse af kombination drug mål som sekventering tumorer til yderligere driver somatiske mutationer [8] eller upartiske RNAi eller cDNA skærme kan give handlingsrettede mål. Dog kan disse tilgange glip potentielle høj-ordens interaktioner med inhibitorer rettet mod flere proteiner og deres kliniske relevans kan afhænge af lange drug discovery indsats omkring nye targets. Desuden baseret på en stærk sammenhæng afhængighed ses for enkeltstof aktivitet forventes det, at kombinationer aktivitet og synergisme også vil være sammenhæng specifik. Det er dog endnu ikke klart, om kombinationer af målrettede midler kunne være effektiv på tværs af en bred vifte af tumor undertype, hvilket gør dem, der gælder for flere patienter end deres single agent bestanddel eller om modstanden skal løses af et stort antal af kontekst specifikke kombinationer adressering mindre grupper af patienter end de konstituerende enkelte midler. Flere grupper er begyndt at identificere lægemiddelinteraktioner på en fordomsfri måde i cancerceller [9, 10], som har ført til vigtige indsigter. Vi har tidligere beskrevet massivt-skaleret single-agent drug screening tværs af en stor panel af genotypisk definerede kræft cellelinjer [11]. For at forstå den overordnede landskab og potentiale skaleret lægemiddelinteraktionsstudie screening tværs kræft cellelinjer som en indledende fase af en kræftcelle-line Kombination (C

3) projekt, vi screenede en stor samling af modermærkekræft cellelinjer tværs af flere tusinde kombinationer af målrettede inhibitorer. Melanom blev udvalgt på baggrund af tilgængeligheden af ​​et stort antal cellelinier, der huser en fælles muteret onkogen (BRAF

V600E) og en valideret målrettet terapi.

Resultater Salg

Systematisk kombinationslægemiddel synergi opdagelse

for at få indsigt i landskabet af klinisk relevante synergistiske kombinationer målrettede agenter i kræft, vi samlet et bibliotek på 108 forbindelser. Da vi var interesseret i at finde lægemiddelkombinationer med potentiale for klinisk oversættelse og hvor virkningsmekanisme ville være medgørlig, valgte vi velkarakteriserede onkologiske lægemidler godkendt af Food and Drug Administration (FDA) eller i sene kliniske forsøg; to tredjedele af disse midler er blevet anvendt klinisk (Fig 1A og S1 tabel). Vi derefter vælge de mest lovende signaltransduktionsinhibitorer i klinisk udvikling, og dem, leveres en stor mangfoldighed af molekylære mål for bredt dækker kræft signalveje; denne kategori udgjorde størstedelen af ​​vores bibliotek, på 67/108 lægemidler. Vi suppleret disse med lægemidler rettet mod cellecyklus regulatorer, epigenetiske modulatorer, nukleare hormonreceptorer og andre nye mekanismer under intens præklinisk undersøgelse. Endelig har vi medtaget et begrænset antal lægemidler repræsenterer store traditionelle cytotoksiske kemoterapier. Dette stof panel udvider væsentligt ud over en nylig rapporteret kombination skærm i melanom udnytte 40 stoffer [10]. Et panel af 36 melanom celler linjer blev valgt som repræsenterer store genotypiske klasser (S2 tabel) og omfattede seks nye patient-afledte kortsigtede melanom kulturer ( 10 passager fra biopsi). Af de 30 tidligere etablerede cellelinier 19 er blevet karakteriseret på det genomiske niveau i yderligere detaljer (S2 tabel). Samlet set denne skærm omhandler et meget større antal lægemiddelkombinationer og cellelinier end tidligere rapporteret [9, 10, 12]. Givet praktiske begrænsninger screening stort antal kombinationer på tværs fuld dosis matricer af kombinationer, valgte vi to fast-forholdet dosiskombinationer. Vi udførte en skærm køre-in på tværs af ti cellelinjer at vælge doser, som resulterede i 70% levedygtighed at indfange syntetiske letale begivenheder (data ikke vist). Vi byggede derefter et bibliotek med alle 5,778 kombinationer svarende til alle mulige to-lægemiddelkombinationer tværs af de 108 stoffer, og enkelte lægemidler. Vi screenede i 1.536 brønde ultra-high-throughput format ved hjælp af høj-indhold og automatiseret billedanalyse-baseret udlæsning af celletal ved nukleær farvning (Fig 1B). Foruden celletælling ved nukleær farvning, vi også systematisk kortlagt drug kombinerede virkninger på celledød ved samtidig anvendelse af antistoffer mod spaltet PARP og normalisering til den samlede nukleare optælling for at opnå en celledød score. I alt for alle lægemiddelkombinationer ved to koncentrationer på tværs af alle cellelinjer og måling både celletælling og celledød, genereret vi et landskab af 800.000 kombinatoriske stof datapunkter (S3 tabel). I betragtning af vores begrænsede dækning af lægemiddel-lægemiddel-dosis matrix, vi brugte Bliss uafhængighed metriske synergi til at repræsentere uventede kombinationseffekter [13-15].

(A) Oversigt over klinisk udvikling etape af 108 stoffer indgår i lægemiddelkombinationen panel. (B) Eksempel på rå UHTS genererede data, der påviser celletal oplysninger fra DAPI kanal og apoptose data fra kløvet PARP immunofluorescens; positiv kontrol af HSP90 inhibitor 17-AAG behandling er vist. (C) Sammendrag matrix af kombinatorisk lægemiddel data, med hvert punkt repræsenterer virkningen af ​​en af ​​5,778 kombinationer på standard lægemiddelkoncentration, som medianen virkning af kombinationen lægemidlet gennem alle 36 melanomcellelinjer på den relative celletal (venstre) og den beregnede Bliss synergi score for denne kombination (til højre). (D) Histogram af antal cellelinjer en given lægemiddelkombination viste synergi. Peak række synergier blev set i en cellelinje, hvilket indikerer mange synergier er private. (E) Som i (C), der viser median virkning af kombinationen lægemiddel (ved standard koncentration) på den relative cPARP positive del (venstre) og den beregnede Bliss synergi for at cPARP niveau (højre). (F) Grafisk fremstilling af lægemiddelkombinationer (drug par forbundet med en kant), som viste en signifikant uventet høj cPARP over et forudsagt niveau ved den givne celletal. Node størrelse angiver antallet af narkotikarelaterede par, der den givne stof vises med andre lægemidler på “uventet apoptotiske” liste. Edge farve indikerer stoffet parret koncentration (standard eller lav), hvor det forhøjede cPARP blev fundet; kant mønster indikerer, om den forhøjede cPARP blev fundet i fastsættelsen af ​​lav celletal eller normal celletal ( 80% kontrol)., med forhøjet cPARP i fastsættelsen af ​​normal levedygtighed potentielt repræsenterer “langsom” død kinetik for den kombination

Indledende analyse af synergieffekterne værdier viste, at et stort antal kombinationer demonstrerede 40% Bliss uafhængighed i mere end en cellelinje, herunder flere lægemidler med bred letalitet og synergi, når parret med andre lægemidler på tværs af cellelinien samling (figur 1C). Det er imidlertid kun 0,3% af synergistiske kombinationer demonstrerede sand syntetisk letalitet, hvor individuelle lægemidler ikke havde nogen virkning ( 80% levedygtighed), men stærk synergistisk levedygtighed 50%. Således fleste lægemidler med synergistiske interaktioner vise nogle målelig virkning af mindst ét ​​enkelt middel. Vi observerede, at nogle lægemidler sensibiliserede celler til mange andre lægemidler; disse omfattede proteasominhibitor bortezomib, pro-apoptotiske B-cellelymfom 2 (BCL2) familiemedlem inhibitor ABT263, og mikrotubulus-inhibitor vincristin (fig 1C). Interessant, at størstedelen af ​​lægemiddelkombinationer viser synergi viste sådan synergi i tre eller færre linier (56%; Fig 1D). Således fleste drug kombinationseffekter stærkt afhænger den cellulære kontekst. Selv kombinationer viser dybtgående synergier i en delmængde af cellelinier er ikke synergistiske eller effektive i andre cellelinjer. Interessant, dette gælder også for kombinationer, der må forventes at være meget bredt synergistisk, fordi de målrette to mekanistisk komplementære cellulære processer. For eksempel kombinationen af ​​gemcitabin, et DNA-beskadigende middel, sammen med DNA-beskadigelse reparationsvej kinase CHK1 inhibitor AZD-7762, er stærkt synergistisk i kun en delmængde (6/36) af cellelinier. Mens dette kan skyldes forskelle i DNA-skader sats på tværs af cellelinjer, observerede vi flere andre tilfælde af stærk synergi, der ses kun i nogle få linier.

En række lægemidler inducerede øget celledød som målt ved cPARP , herunder ABT263 og den brede kinaseinhibitor MIDOSTAURIN (fig 1E). Færre narkotika viser bred synergi i cPARP induktion sammenlignet med celletal; én undtagelse var nilutamid, en androgen receptor antagonist. Generelt lægemiddel-lægemiddel-kombinationer reducerer celletallet efter 72 timer viste også en stigning i procentdelen af ​​celler positive for cPARP farvning ( “hurtige” kinetik). Men en delmængde af kombinationer forøget cPARP uden at påvirke celletal (S1A og S1B Fig). Vi hypotesen, at denne delmængde sandsynligvis repræsenterer kombinationer med “langsom” kinetik celledød induktion. Vi udviklede en regressionsmodel for dette forhold at identificere disse outlier apoptoseinducerende kombinationer i hver cellelinie. Samlet set viste 4% kombinationer et overskud øget cPARP forhold til celletælling. Specifikke lægemidler induceret apoptose uventet oftere i dette sæt af kombinationer (Fig 1F). Ikke overraskende ABT263 inducerede høj cPARP bredt i forhold til celletælling og blev beriget med både “hurtige” og “langsom” kinetiske mønstre kombinationer. Interessant, fingolimod, en partiel agonist for SP1R, en receptor menes at være involveret i apoptotisk celle genkendelse af immunceller snarere end i celleautonom regulering af apoptose og bortezomib viste en “hurtig” mønster af død induktion. I modsætning hertil FK866, viste en nicotinamid phosphoribosyltransferase hæmmer en “langsom” mønster af apoptose induktion.

Drug synergi og off-target effekter

For at prioritere synergistiske kombinationer for yderligere mekanistisk dissektion, vi først analyseret interaktioner med de stærkeste Bliss uafhængighed scores over mest antallet af cellelinjer. Flere af disse interaktioner er tidligere blevet beskrevet i litteraturen, validering skærmen identificere

bona fide

synergistiske interaktioner. Blandt disse indgår MK1775, et WEE-1 inhibitor, og AZD7762, en CHK1 /2 hæmmer (S2A Fig); dobbelt inhibering af begge cellecyklus checkpoint kinaser er tidligere blevet beskrevet i flere forskellige tumortyper i cellekultur og

in vivo

[16]. Synergistisk interaktion mellem målrettede hæmmere og BCL2 familiemedlem inhibering er tidligere blevet beskrevet [17, 18], og vi også observeret en sådan interaktion mellem høje doser af CHIR265, en pan-Raf inhibitor og ABT263 (S2B Fig). ABT263 sensibiliseret også et stort antal cellelinier ( 10) i den primære skærm til bortezomib og fytokemiske indol-3-carbinol. En særlig stærk synergistisk interaktion blev set mellem BI78D3, en JNK-inhibitor og TZDZ8, en GSK3p-inhibitor (S2C Fig). Men vi var ude af stand til at observere synergi ved RNAi knockdown enten target klasse sammen med lægemiddelbehandling (S2D Fig), eller mellem en udvidet samling af andre JNK og GSK3p værktøj forbindelser (S2E Fig); Desuden blev denne synergi set på tværs af en række andre transformerede og ikke-transformerede celler (S2F Fig), hvilket tyder på det var en bred, idiosynkratiske, og off-target cytotoksisk synergistisk vekselvirkning usandsynligt at være klinisk anvendelig på grund af sin aktivitet mod ikke-transformerede celler.

Vi valgte en af ​​disse stærke synergistiske interaktioner for yderligere mekanistiske undersøgelser. Vi observerede en stærk vekselvirkning mellem lapatinib, en EGFR familie inhibitor og vincristin, en mikrotubulus-inhibitor (fig 2A). Vincristin bruges sjældent i melanom terapeutiske regimer og EGFR familiemedlemmer er ikke kendt for at have en chauffør rolle i melanomer undtagen i adaptive modstand mod BRAF inhibitorer [7]. Vi bekræftede stærk ~ 10X sensibilisering af nogle, men ikke alle, melanom celler til vincristin med lapatinib, med en Bliss værdi 50% og kombinationsindeks (Cl) på 0,37 [19] (Fig 2B og S3A og S3B Fig), og flere andre EGFR familiemedlem inhibitorer, herunder erlotinib (S3C Fig). Men vi var ude af stand til at bevidstgøre A375-celler til vincristin efter enkelt eller kombinatorisk knockdown af lapatinib mål for EGFR og HER2 (S3D Fig). Desuden viste cellecyklus analyse synergistisk anholdelse i G

2 /M med vincristin-lapatinib kombination, som man ville forvente med stigende vincristin dosis (fig 2C). Lapatinib og andre 4-anilinoquinazolin-afledte tyrosinkinaseinhibitorer, er blevet beskrevet som inhibitorer af P-gp familie af multilægemiddelresistens (MDR) transportører [20, 21]. Verapamil, en kanonisk MDR1-hæmmer, resulterede i en lignende synergistisk interaktion med vincristin (S3E Fig). På grund af den stærke synergi mellem vincristin og lapatinib i A375, men ikke WM451Lu celler, vi undersøgt, om forskellen MDR familie udtryk kan ligge til grund for cellelinje specificiteten af ​​den synergistiske interaktion. Samlet set har vi observeret en generel tendens til øget synergi mellem vincristin og lapatinib i cellelinjer med højere MDR1 mRNA-ekspression. (S3F Fig). Fordi enkelte celle kontekst kan påvirke robustheden af ​​den generelle tendens, vi specifikt sammenlignet en følsom over for en ufølsom cellelinie. Vi observerede 8-fold ekspression af MDR1-mRNA i A375-celler vs. WM451Lu celler (Fig 2D). Endvidere lapatinib forøget bibeholdelse af en MDR substrat farvestof lighed med verapamil (Fig 2E). Knockdown af MDR1 af RNAi i A375-celler sensibiliserede cellerne til vincristin cellevækst hæmning (fig 2F og S3G Fig). Overekspression af MDR1 i WM451Lu celler induceret resistens mod vincristin i en lapatinib-afhængig måde (Fig 2G og S3H Fig). På trods af den “målrettet” karakter af nogle kinaseinhibitorer, kan deres aktivitet mod MDR familiemedlemmer frembringe en synergistisk virkning ikke er relateret til deres primære mål. I overensstemmelse med dette, observerede vi synergi mellem vincristin og lapatinib tværs af en række andre hurtigt prolifererende celler (S3I Fig). Lignende fund af promiskuøse synergistiske interaktioner via biotilgængelighed er blevet fundet i gær antifungale lægemiddel kombinationsskærme [22]. Et stort antal forbindelser på tværs af en række strukturelle klasser kan vise MDR hæmning, understøtter vores observation, at vincristin blev sensibiliseret af et stort antal af andre lægemidler (Fig 1D).

(A) Screening resultater, der viser virkningerne på begge koncentrationer af vincristin og lapatinib, hver for sig og som en kombination, der viser stærk synergi tværs fleste melanomcellelinjer som angivet ved høj Bliss synergieffekter scores. (B) Bekræftelse af den synergistiske virkning af kombinationen af ​​lapatinib (5 uM) i A375 (

n

= 19), men ikke WM451Lu (

n

= 14) celler. Fejl- søjler repræsenterer s.d. måling replikater. (C) Repræsentant flowcytometri data, der viser lapatinib forstærker G

2 /M skift af A375 cellepopulation i overensstemmelse med øget vincristin effekt. (D) Log

2 relative ekspression af det givne multiresistens transportør i A375 versus WM451Lu celler, viser forøget MDR1-ekspression i A375-celler. Fejl- søjler repræsenterer s.d. af måling gentagelser (

n

= 9). (E) Calcein dye flux forsøg, der viser forøget fluorescensintensitet (hvilket indikerer nedsat MDR flux) i nærvær af lapatinib eller kontrol MDR inhibitor verapamil (både ved 5 uM); kvantificering af celle grå værdier vist til venstre. Fejl- søjler repræsenterer s.d. af måle- replikater (

n

= 4, 200 celler pr replikat). (F) MDR1 knockdown af siRNA forårsager en synergistisk effekt på cellelevedygtighed i overværelse af 5 nM vincristin. Fejl- søjler repræsenterer s.d. af måling gentagelser (

n

= 7). (G) Overekspression af MDR1 (sammenlignet med GFP kontrol) i WM451Lu nedsætter følsomheden over for vincristin, en virkning reversibel med 5 uM lapatinib. Fejl- søjler repræsenterer s.d. af måle- replikater (

n

= 4)

VEGFR /PDGFR antagonister synergistisk med BRAF inhibitorer

For at identificere mere specifikke synergistiske kombinationer, vi fokuserede på kombinationer, der måske fat iboende modstand mod BRAF-hæmmer vemurafenib. Vi identificerede adskillige BRAF

V600E cellelinjer, herunder ISTMel1 og RPMI7951, som viste modstand mod PLX4720 selv ved høje doser ( 5 uM, væksthæmning 50%), når der sammenlignes med følsomme linjer såsom UACC62 og SkMel28 (IC

50 500nM) (fig 3A). Mange af de 107 andre lægemidler i vores bibliotek viste synergistiske interaktioner med PLX4720 i bestemte celle sammenhænge (S4A Fig). Vi anvendte den statistiske analyse af microarray (SAM) tilgang [23] til at identificere kombinationer med PLX4720 som var specifikt synergistisk i PLX4720-resistente cellelinier (s4b Fig). Blandt disse omfattede HDAC-hæmmer vorinostat, for nylig fundet at virke synergistisk med BRAF-hæmmere i nogle melanom cellelinjer [24]. Vi bemærkede betydelig synergi mellem RTK-hæmmer cediranib og PLX4720 i disse resistente cellelinier (Fig 3B), med et CI på 0,35 (S5A Fig), men ikke i følsomme linjer, selv ved lave doser af PLX4720. Synergi blev også observeret mellem cediranib med MEK-inhibitor selumetinib (AZD6244), og med den tredobbelte kombination af cediranib, PLX4720, og selumetinib, hvilket tyder på en generel interaktion mellem cediranib og hæmning af BRAF-drevne MAPK signalering (S5B og S5C Fig). Langsigtede vækst- analyser bekræftede en stærk synergistisk interaktion (Fig 3C). Kombinationen af ​​cediranib og PLX4720 hurtigt induceret apoptose i resistente celler, som vist ved Annexin V-farvning og cPARP Western blotting (Fig 3D). Mens enkelt middel PLX4720 behandling forårsagede cellecyklusstandsning i følsomme cellelinjer, var der ingen signifikant virkning af lægemidlet kombinationen på cellecyklussen (S5D Fig). I modsætning til resultaterne med lapatinib, fandt vi ingen sensibilisering af resistente linjer til PLX4720 med MDR inhibitor verapamil (S5E Fig).

(A) Effekt af PLX4720 (PLX4720) på tværs melanomceller i den primære screening, demonstrere nogle

BRAF

mutant melanomer vise iboende modstand mod BRAF hæmning. Modstand (defineret som 50% levedygtighed ved 5 uM PLX4720) i disse linjer blev bekræftet i sekundære assays (nedenfor). (B) Cediranib viste synergistiske virkninger med PLX4720 i flere uløseligt resistente linjer i den primære skærm; disse effekter blev verificeret i standard vækst analyser i sekundære skærme (nedenfor, med 2 pM cediranib). BRAF inhibitor-sensitive linjer UACC62 og SkMel28 viste ingen synergi på noget PLX4720 dosis, mens resistente ISTMel1 og RPMI7051 linjer viste stærk synergi med cediranib (Bliss 30%). Fejl- søjler repræsenterer s.d. af måle- replikater (

n

= 3-4). (C) Langsigtede krystal violet-farvede koloni vækst analyser bekræftede vedvarende synergi mellem PLX4720 (PLX) og cediranib (CED) i resistente ISTMel1 og RPMI7951 linjer, men ikke PLX4720 sensitive linjer UACC62 og SkMel28. (D) Annexin V assays viste, at cediranib apoptose, når de kombineres med PLX4720 hos resistente ISTMel1 celler, sammenlignet med følsomme UACC62, og som bekræftet ved Western blotting for at spaltet PARP (nedenfor). Fejl- søjler repræsenterer s.d. af måling gentagelser (

n

= 3). (E) Western blotting bekræftede udtryk for cediranib mål PDGFRβ og variabelt, KDR og PDGFRα i PLX4720-ufølsom ISTMel1 og RPMI7951 celler, med svagere eller fraværende udtryk i PLX4720 følsomme UACC62 og SkMel28 celler. Tyve-fire timer behandling med PLX4720 moderat undertrykt KDR og induceret PDGFRβ udtryk, et mønster også set

in vivo

(S9A Fig). (F) Western blotting bekræftet on target undertrykkelse af PDGFRα og PDGFRβ fosforylering (sidstnævnte efter immunpræcipitation og blotting til phospho-tyrosin givet lav tæthed). KDR phosphorylering var for svag til at blive observeret af vestlige rutinemæssigt i kultur, men blev set

in vivo

(se S9A Fig). (G) RNAi-medieret knockdown af KDR (venstre) med pools eller individuelle siRNA’er viste synergi til ~ 30%; synergi var proportional med KDR knockdown (se S7A Fig). Fejl- søjler repræsenterer s.d. af måling gentagelser (

n

= 6). På højre gennemsnitlige Bliss værdier over flere gentagelser viste stigende synergi med samtidig knockdown af flere cediranib mål KDR og PDGFRβ, og mere svagt, PDGFRα. Fejl- søjler repræsenterer s.d. af måle- replikater (

n

= 5-8).

Cediranib er en potent og selektiv hæmmer af PDGFR og VEGFR familie af receptortyrosinkinaser i kliniske forsøg, der hovedsagelig anvendes som et anti-angiogenese agent [25]. Mens PDGFRα og β overekspression tidligere har været forbundet med erhvervet vemurafenib resistens [6, 7, 26], har denne familie ikke blevet impliceret i celle-autonom primære vemurafenib modstand. For yderligere at forstå mekanismen af ​​lægemiddelkombinationen, testede vi en udvidet liste over RTK-inhibitorer i klinisk anvendelse eller udvikling. Nogle, men ikke alle, viste lignende hæmmere synergier med PLX4720, og i nogle, men ikke alle resistente linjer (S6A Fig). Interessant kun cediranib og tivozanib, ikke det mere specifikke inhibitorer axitinib (VEGFR) eller crenolanib (PDGFR), udviste konsistent og potent synergistisk aktivitet med PLX4720 tværs af en bred vifte af doser, hvilket antyder en specifik inhiberende aktivitet af disse forbindelser på en delmængde af mål . Cellelinie udtryk databaser viste ekspression af cediranib mål i resistente cellelinier (S6B Fig), som vi bekræftet ved Western blotting (Fig 3E). Generelt har vi også fundet, at melanomcellelinjer udtrykker højere niveauer af KDR end nogen anden afstamning i en stor samling af cancercellelinier (S6c Fig), hvilket antyder en specifik celle-autonom rolle for KDR i melanom udvikling. Vi har detekteret on target undertrykkelse af cediranib af phosphorylering af både PDGFRα og PDGFRβ (fig 3F). Dernæst forsøgte vi at rekapitulere synergi mellem PLX4720 og cediranib ved knockdown af dens primære mål. siRNA knockdown af KDR viste en synergistisk nedgang i celleantal, når det kombineres med PLX4720 behandling proportional knockdown effektivitet; desuden samtidig knockdown af multiple cediranib mål, herunder PDGFRα og PDGFRβ øget synergi med BRAF inhibering (fig 3G og S7A og S7B Fig). Selvom vi ikke kan udelukke, at nogle af de synergistisk aktivitet skyldes hæmning af andre RTK mål ikke indgår i vores analyse, disse resultater tyder på, at særlig stærk synergistisk aktivitet af cediranib i kombination med PLX4720 skyldes hæmning af KDR og relaterede RTK herunder PDGFRα og PDGFRβ.

aktivering eller genaktivering af større veje nedstrøms for RTK’er såsom mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) og phosphatidylinositol-3-OH-kinase (PI (3) K) -Akt pathways tidligere har været impliceret i resistens mod målrettede behandlinger, herunder vemurafenib i både

in vitro

og kliniske studier [8, 27-32]. Modsætning til de fleste studier af resistente cellelinier, PLX4720 fuldstændig undertrykt ERK-aktivering i de uløseligt-resistente linjer; desuden dobbelt hæmning af MAPK-vejen med PLX4720 og selumetinib viste ingen synergistisk interaktion (S8A og S8B Fig), og cediranib viste fortsat synergi i tredobbelt kombination med både PLX4720 og selumetinib (S5C Fig). Disse resultater foreslået yderligere veje ud over MAPK er relateret til cediranib aktivitet. Cediranib undertrykt S6K fosforylering i både følsom (UACC62) og resistente (ISTMel1) linjer, og kombinationen undertrykt aktivering i resistente linjer af de fleste Akt pathway komponenter med pathway phospho-antistof arrays (S8C Fig). For at afgøre, om det var simpelthen en markør for RTK hæmning og /eller synergi, eller mekanismen for den observerede synergi, vi testede, om PI3K /Akt pathway hæmmere kan virke synergistisk med PLX4720. Interessant, viste Akt pathway hæmning eneste variabel og moderat synergi med PLX4720 trods stærk pathway undertrykkelse (S8D og S8E Fig). Disse resultater tyder på, at undertrykkelse af MAPK eller PI3K signalering nedstrøms for KDR /PDGFR RTK kun delvist bidrager til synergi mellem cediranib og PLX4720 og terapeutisk medgørlige iboende resistensmekanismer rækker ud over disse to veje. Blandt potentielle nedstrøms pathway påvirket af PI3K /Akt pathway suppression observeret af lægemiddelkombinationen, β-catenin er en kendt substrat af GSK3p, hvis aktivering kan følge faldet Ser9 phosphorylering observeret med kombinationen. Selv om flere β-catenin pathway modulatorer viste ingen antagonisme eller synergi med PLX4720 i vores primære screening (S9A Fig), og GSK3p har et antal kendte substrater [33], kan denne pathway være en af ​​de potentielle effektorer af lægemiddelkombinationen.

Næste testede vi, om synergistisk hæmning af væksten af ​​melanom celler ved cediranib og PLX4720 kunne sammenfattet

in vivo

. I to xenograftmodeller med de resistente linjer ISTMel1 og RPMI7951, observerede vi en stærk vekselvirkning mellem inhibitorer på tumor progression (Fig 4A og S9A-S9C Fig). ISTMel1 viste moderat indledende følsomhed over for PLX4720, men cediranib undertrykt senere væksten af ​​tumorer, mens på PLX4720; i modsætning hertil i RPMI7951, kombinationen af ​​cediranib og vemurafenib faldt indledende tumorvækst ud over effekten af ​​hvert lægemiddel for sig.

(A) ISTMel1 xenografter blev genereret i immundefekte mus (

n

= 8 per gruppe), der blev behandlet med PLX4720 eller kontrol chow og givet cediranib eller vand ved oral sondeernæring. ISTMel1 xenografter viste et første svar på PLX4720 behandling alene efter cirka to uger, med nogle ekstra, men ikke-signifikant respons på cediranib behandling. Værdier er vist som middelværdi +/- S.E.M. intervaller, med betydelige forskelle i gennemsnitlig tumorstørrelse både PLX4720 og PLX4720 og cediranib-behandlede mus sammenlignet med kontrol behandling af ANOVA. Kombinationen betydeligt forsinket progression (defineret som 500 mm

3 størrelse) uden denne indledende reaktion (højre,

s

0,002 mellem PLX4720 og PLX4720 + cediranib arme ved log-rank test) . (B) I modsætning til ISTMel1 xenografter viste RPMI7951 implanteret en signifikant forskel ved ANOVA test i første svar på PLX4720 versus PLX4720 og cediranib behandling efter tre uger, og, til højre, viste en langvarig forsinkelse af progression (defineret som tumor 250 mm

3) af helt PLX4720 tumorer (

s

0,0001 mellem PLX4720 og PLX4720 og cediranib arme ved log-rank test). Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d. Fejl- søjler repræsenterer s.d.