Abstrakt
MDA-7 /IL-24 var involveret i den specifikke cancer apoptose gennem undertrykkelse af Bcl-2-ekspression, som er en vigtig apoptose regulatoriske protein af det mitokondrielle død pathway. Men de underliggende mekanismer i denne forordning er uklare. Vi rapporterer her, at tumor-selektive replikerende adenovirus ZD55-IL-24 til Bcl-2 S-denitrosylation og samtidig ubiquitinering, der deltager i 26S proteasom nedbrydning. IL-24-siRNA helt blokerer Bcl-2 ubiquitinering via reversion af Bel-2 S-denitrosylation og beskytter den mod proteasomalaktivitet nedbrydning som bekræftede den betydelige rolle, MDA-7 /IL-24 i reguleringen posttranslationelle modifikation af Bel-2 i cancerceller . Nitrogenoxid (NO) er en vigtig regulator af protein S-nitrosylering og denitrosylation. NO-donor, natriumnitroprussid (SNP), nedregulerer Bcl-2 S-denitrosylation, dæmper Bcl-2 ubiquitinering og efterfølgende modvirker MDA-7 /IL-24-induceret cancercelle apoptose, hvorimod ingen inhibitor 2- (4-carboxyphenyl) -4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxy-3-oxid (PTIO) viser den modsatte virkning. Samtidig er disse INGEN modulatorer undgå at påvirke Bcl-2-phosphorylering, hvilket antyder, at NO regulerer Bcl-2 stabilitet i en phosphorylering-uafhængig måde. Desuden blev Bcl-2 S-nitrosylering reduktion induceret af ZD55-IL-24 tilskrives både iNOS fald og TrxR1 stigning. iNOS-siRNA letter Bcl-2 S-denitrosylation og ubiquitin-nedbrydning, hvorimod TrxR1 inhibitor auranofin forhindrer Bcl-2 fra denitrosylation og ubiquitinering, dermed tilbageholder den caspase signal-aktivering og efterfølgende kræftcelle apoptose. Tilsammen vores undersøgelser viser, at MDA-7 /IL-24 inducerer Bcl-2 S-denitrosylation via regulering af iNOS og TrxR1. Endvidere denitrosylation af Bcl-2 resultater i sin ubiquitinering og efterfølgende caspase protease familie aktivering som følge heraf, apoptose modtagelighed. Disse resultater giver en hidtil ukendt indsigt i MDA-7 /IL-24-induceret vækstinhibering og carcinoma apoptose
Henvisning:. Tian H, Wang J, Zhang B, Di J, Chen F, Li H, et al. (2012) MDA-7 /IL-24 inducerer Bd-2 Denitrosylation og Ubiquitin-Nedbrydning Involveret i Cancer Cell apoptose. PLoS ONE 7 (5): e37200. doi: 10,1371 /journal.pone.0037200
Redaktør: Demetrios Vavvas, Massachusetts Eye Ear Infirmary-Harvard Medical School, USA
Modtaget: December 6, 2011; Accepteret: 16. april, 2012; Udgivet: 21 maj, 2012 |
Copyright: © 2012 Tian et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette projekt blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 81.071.854) og Videnskab og Teknologi Institut for Jiangsu-provinsen (BK2010177, BK2010179). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Interleukin 24 (IL-24), også kaldet melanom differentiering associerede gen-7 (MDA-7), er en unik medlem af IL-10-genfamilien, der viser en selektiv induktion af kræft specifik apoptose uden skadelige virkninger på normale celler [1] – [3]. MDA-7 /IL-24 inducerer væksthæmning og apoptose i et bredt spektrum af humane cancerceller, herunder melanom, malignt gliom, og bryst- [4] – [8]. Inddragelsen af MDA-7 /IL-24-induceret apoptose i tumorvæv var forbundet med endoplasmatiske reticulum (ER) stress og mitokondriel dysfunktion og reaktive oxygenarter (ROS) produktion [7], [9], [10]. Desuden MDA-7 /IL-24-induceret potent “tilskuer antitumor” aktivitet, en evne til at blokere tumor angiogenese, synergi med stråling, kemoterapi, monoklonale antistof behandlingsformer og immunmodulerende aktivitet [11], [12], som gør det til en ideel værktøj til cancer genterapi.
Selvom veje, ad hvilke MDA-7 /IL-24 forbedrer apoptose i tumorceller ikke er fuldt belyst, beviser fra flere undersøgelser tyder på, at MDA-7 /IL-24 medierer mange proteiner vigtigt for indtræden af væksthæmning og inddragelse af mitokondrie apoptotisk celledød pathway [7]. B-celle-lymfom-gen 2 (Bcl-2), en af de anti-apoptotiske Bcl-2-familiemedlemmer, er lokaliseret i den ydre mitokondriske membran. Nogle antiapoptotiske mekanismer Bcl-2 omfatter regulering af calcium-homeostase og neutralisering af proapoptotiske protein Bax ved at danne heterodimerer. Desuden Bcl-2 fremmet blokaden af cytochrom c-frigivelse og sammenslutningen med mitokondrie apoptose faktor Apaf1 endelig forhindret aktiveringen af caspase protease familie og konserveret mitokondriel integritet [13], [14]. MDA-7 /IL-24 undertrykte Bcl-2-protein-ekspression, hvilket dermed øget forholdet mellem specifikke pro- og anti-apoptotiske proteiner vippe balancen fra overlevelse til døden i carcinomceller. I modsætning hertil overekspression af Bcl-2 beskyttede prostatacancerceller fra MDA-7 /IL-24-medieret apoptose, hvilket tyder på Bcl-2 spiller en vigtig rolle i cancerceller apoptose som respons på MDA-7 /IL-24 [8]. Imidlertid har den nøjagtige mekanisme, ved hvilken MDA-7 /IL-24 reguleret Bcl-2 for at lette mitokondriel dysfunktion ikke blevet identificeret. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi tumor-selektive replikerende adenovirus, der udtrykker IL-24 (ZD55-IL-24), som udgår den essentielt viralt E1B 55 kDa-genet og udøvede en stærk cytopatisk virkning og signifikant apoptose i tumorceller uden normale celler [15] yderligere at undersøge mekanismen for MDA-7 /IL-24 inducerende Bcl-2 nedregulering og efterfølgende carcinoma celle apoptose.
(A) Tidsforløb analyse af IL-24-protein-ekspression i HeLa, A375 og 7860 celler behandlet med ZD55-IL-24 (20 MOI). (B) Tidsforløb analyse af E1A-protein-ekspression i HeLa, A375 og 7860-celler behandlet med ZD55-IL-24 (20 MOI). (C) Tidsforløb analyse af Bcl-2-protein-ekspression i HeLa, A375 og 7860-celler behandlet med ZD55-IL-24 (20 MOI). β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (D) ZD55-EGFP (5 MOI), der bærer rapport gen EGFP blev anvendt til at påvise infektioner effektiviteten af replikative adenovirus til forskellige tidspunkter (forstørrelse x 200). (E) Hela, A375 og 7860 celler levedygtighed behandlet med ZD55-IL-24 (20 MOI) på de forskellige tidspunkter blev bestemt ved MTT-assayet. Data er middelværdier ± standardafvigelse (S.D.) fra tre uafhængige forsøg (n = 3); *
s
. 0,05 versus kontrolgruppen
(A) Virkninger af de forskellige titre af ZD55-IL-24 (0,1 MOI, en MOI, 5 MOI, 10 MOI , 20 MOI) på Bcl-2-ekspression induceret af Western blotting 48 timer efter infektion af ZD22-IL24. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (B) ZD55-EGFP på de forskellige titere blev anvendt til at påvise infektioner effektivitet replikativ adenovirus (Forstørrelse x 200). (C) Hela cellelevedygtigheden behandlet med de forskellige titere af ZD55-IL-24 blev bestemt ved MTT-assayet. Data er middelværdier ± standardafvigelse (S.D.) fra tre uafhængige forsøg (n = 3); *
s
0,05 versus kontrolgruppen
(A) Hela, A375 og 7860 celler i respons på ZD55-IL-24 (20 MOI) var forberedt på immunpræcipitation bruger. anti-Bcl-2-antistof. De resulterende immunkomplekser blev analyseret for anti-S-nitrosocysteine ved Western blotting og stod for Bcl-2 S-nitrosylering niveau ved forskellige tidspunkter 12 timer, 24 timer, 36 timer og 48 timer, hhv. (B) Tidsforløb for Bcl-2 ubiquitinering i Hela-celler blev detekteret ved immunfældning ved anvendelse af anti-Bcl-2-antistof og derefter efterfulgt af immunoblotting med anti-ubiquitin antistof. (C) Effekt af IL-24-siRNA (100 nM) ved IL-24, Bcl-2-ekspression, Bcl-2 S-nitrosylering og ubiquitinering i Hela-celler blev detekteret ved Western blotting og co-immunoudfældning. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. De tilsvarende bånd blev scannet og den optiske densitet (O.D.) blev bestemt som gange ændring versus kontrolgruppen. Data er middelværdier ± standardafvigelse (S.D.) fra tre uafhængige forsøg (n = 3); *
s
0,05 versus kontrolgruppen;
#
s
0,05 versus scrambled siRNA-gruppe på Airbnb
(A) Tidsforløb analyse af caspase-9, caspase-3 og PARP i Hela celler behandlet med ZD55. -IL-24 (20 MOI). De tilsvarende bånd blev scannet og den optiske densitet (O.D.) blev bestemt som gange ændring versus kontrolgruppen. (B) Tidlig apoptose og sen apoptose i HeLa-celler blev påvist ved farvning af celler med Annexin V-FITC (grøn farve) og propidiumiodid (rød farve) til forskellige tidspunkter. (C) Hela-celler behandlet med ZD55-IL-24 til forskellige tidspunkter blev farvet med Annexin V-FITC /propidiumiodid (PI) og straks analyseret ved flowcytometri. Data er præsenteret som den procentdel af Annexin V-positive celler fra tre uafhængige forsøg. *
s
. 0,05 versus kontrolgruppen
(A) Hela, A375 og 7860 celler blev forbehandlet med ZD55-IL-24 (20 MOI) i 24 timer og derefter behandlet med NO-donor SNP (2 mM), ingen inhibitor PTIO (300 uM) og SNP samtidig indgivelse af reduktionsmiddel DTT (10 mM) i 6 timer henholdsvis. Bcl-2 S-nitrosylering blev detekteret ved immunfældning ved anvendelse af anti-Bcl-2-antistof og derefter efterfulgt af immunoblotting med anti-S-nitrosocysteine antistof. (B) Virkning af NO modulatorer på Bcl-2 ubiquitinering i Hela-celler blev detekteret ved immunfældning ved anvendelse af anti-Bcl-2-antistof og derefter efterfulgt af immunoblotting med anti-ubiquitin antistof. (C) Effekt af NO modulatorer på Bcl-2-ekspression i HeLa, A375 og 7860 celler blev detekteret ved western blotting under anvendelse af anti-Bcl-2-antistof. (D) Hela, A375 og 7860 celler blev forbehandlet med ZD55-IL24 i 24 timer og derefter behandlet med proteasomalaktivitet inhibitor MG132 (10 uM) i 6 timer. Bcl-2-ekspression blev analyseret ved Western blotting ved anvendelse af anti-Bcl-2-antistof. (E) Bcl-2-phosphorylering i Hela-celler blev detekteret ved Western blotting med anti-p-Bcl-2 (Ser87) antistof. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. De tilsvarende bånd blev scannet og intensiteterne blev bestemt ved optisk densitet (O. D) målinger. Data er gennemsnit ± standardafvigelse (S.D.) fra tre uafhængige eksperimenter (n = 3).
#
s
0,05 versus ZD55-EGFP; *
s
0,05 versus ZD55-IL-24-gruppen;
@
s
. 0,05 versus DMSO gruppe
(A) Hela celler blev forbehandlet med ZD55-IL24 (20 MOI) i 24 timer og derefter tilsat med NO donor SNP (2 mM), ingen inhibitor PTIO (300 uM), SNP samtidig administration af reduktionsmiddel DTT (10 mM) og proteasomalaktivitet inhibitor MG132 (10 uM) i 6 timer henholdsvis. Procaspase-9, kløvet caspase-9, procaspase-3, spaltet caspase-3 blev detekteret ved Western blotting. (B) Virkning af NO modulatorer SNP, PTIO, SNP + DTT og proteasominhibitor MG132 på tidlig apoptose og sen apoptose i HeLa-celler behandlet med ZD55-IL-24 blev påvist ved farvning med Annexin V-FITC (grøn farve) og propidiumiodid (rød farve) hhv. (C) Hela-celler blev farvet med Annexin V-FITC og propidiumiodid og straks analyseret ved flowcytometri. (D) Virkninger af NO modulatorer og MG132 på Hela cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-analysen. De tilsvarende bånd blev scannet og den optiske densitet (O.D.) blev bestemt som gange ændring versus kontrolgruppen. Data er gennemsnit ± standardafvigelse (S.D.) fra tre uafhængige eksperimenter (n = 3).
#
s
0,05 versus ZD55-EGFP gruppe; *
s
0,05 versus ZD55-IL-24-gruppen;
@
s
0,05 versus DMSO gruppe
(A) Tidsforløb analyse af iNOS udtryk i Hela, A375 og 7860 celler behandlet med ZD55-IL-24. (20 MOI). (B) Hela, A375 og 7860 celler blev transficeret med iNOS-siRNA (100 nM) i 12 timer, derefter behandlet med ZD55-IL-24 i 12 timer. Virkning af iNOS-siRNA på iNOS-ekspression blev analyseret ved Western blotting. (C) Effekt af iNOS-siRNA på Bcl-2-protein-ekspression blev analyseret ved Western blotting. (D) Effekt af iNOS-siRNA på Bcl-2 S-nitrosylering blev detekteret ved immunfældning ved anvendelse af anti-Bcl-2-antistof og derefter fulgt af immunoblottedes med anti-S-nitrosocysteine antistof. (E) Effekt af iNOS-siRNA på ubiquitin-Bcl-2 blev detekteret ved immunfældning ved anvendelse af anti-Bcl-2-antistof og derefter efterfulgt af immunoblotting med anti-ubiquitin antistof. (F) Effekt af iNOS-siRNA på caspase-9, caspase-3 og PARP i Hela-celler blev detekteret ved Western blotting. De tilsvarende bånd blev scannet og den optiske densitet (O.D.) blev bestemt som gange ændring versus kontrolgruppen. Data er gennemsnit ± standardafvigelse (S.D.) fra tre uafhængige eksperimenter (n = 3). *
s
0,05 versus kontrolgruppen;
#
s
. 0,05 versus scrambled siRNA-gruppe på Airbnb
(A) Tidsforløb analyse af TrxR1 udtryk i Hela, A375 og 7860 celler behandlet med ZD55-IL 24 (20 MOI). (B) Hela, A375 og 7860 celler blev behandlet med ZD55-IL-24 i 24 timer og derefter tilsat med TrxR1 inhibitor auranofin (5 uM) i 6 timer. Virkning af TrxR1 inhibitor auranofin på TrxR1 proteinekspression blev detekteret ved Western blotting. (C) Effekt af TrxR1 inhibitor auranofin på Bcl-2-protein-ekspression i HeLa, A375 og 7860 celler blev påvist ved western blot assay. (D) Virkning af TrxR1 inhibitor auranofin på Bcl-2 S-nitrosylering blev detekteret ved immunfældning ved anvendelse af anti-Bcl-2-antistof og derefter efterfulgt af immunoblotting med anti-S-nitrosocysteine antistof. (E) Effekt af TrxR1 inhibitor auranofin på Bcl-2 ubiquitinering i Hela-celler blev detekteret ved immunfældning ved anvendelse af anti-Bcl-2-antistof og derefter efterfulgt af immunoblotting med anti-ubiquitin antistof. (F) Effekt af TrxR1 inhibitor auranofin på caspase-9, 3 og PARP blev detekteret ved Western blotting. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. De tilsvarende bånd blev scannet og den optiske densitet (O.D.) blev bestemt som gange ændring versus kontrolgruppen. Data er gennemsnit ± standardafvigelse (S.D.) fra tre uafhængige eksperimenter (n = 3). *
s
0,05 versus ZD55-EGFP;
#
s
0,05 versus DMSO gruppe
(I) IL-24 hæmmer iNOS udtryk fører til reduktion af NO omsætning og dæmpning af Bel-2 S-. nitrosylering. (II) Trx denitrosylates S-nitrosylerede Bcl-2 via sin dithiol-del, hvorved der dannes en reduceret Bcl-2 og oxideret Trx; oxideret Trx reduceres (og derfor genaktiveres) af selen-flavoprotein Trx reduktase (TrxR) og NADPH, hvilket tyder på, at TrxR ved at reducere oxideret Trx kan lette Bcl-2 denitrosylation. (III) under basale tilstand, Bcl-2 S-nitrosylering stabiliserer proteinstruktur og modstår at ubiquitin-proteasom nedbrydning. Dannelse af heterodimerer med proapoptotiske protein såsom Bax, inhibering af cytochrom c-frigivelse og caspase protease familie aktivering og regulering af mitokondrie transmembranpotentiale er nogle af mekanismer, hvorved Bcl-2 udøver sin anti-apoptotisk virkning. (IV) som respons på IL-24, Bcl-2 S-denitrosylation via både iNOS fald (a) og TrxR1 stigning (b) letter Bcl-2 ubiquitinering, som endelig nedbrydes af 26S-proteasomet. Bax udløser frigivelse af cytochrom c og aktivering af caspase-protease-familien, som medierede intracellulære proteolyse som er karakteristisk for celle apoptose.
Selvom ekspressionen af Bcl-2 reguleres af flere mekanismer, såsom transkription , posttranslationelle modifikation, dimerisering og nedbrydning [16], [17], og flere tegn viser, at posttranslationelle modifikation spiller en afgørende rolle i en potentiel Bcl-2 omsætning under stress tilstand [18], [19], [20]. Nogle undersøgelser tyder protein S-nitrosylering er en regulatorisk proces i signaltransduktionsveje, der justerer funktionen af Bcl-2 ved kovalent binding af en nitrogenoxid (NO) gruppe til en cystein thiol sidekæde. Det er blevet vist, at de to cysteinrester af Bcl-2, Cys
158 og Cys
229 er ansvarlige for S-nitrosylering af Bcl-2, og mutation af disse to rester fuldstændigt at inhibere Bcl-2 S-nitrosylering [16]. S-nitrosylering er blevet reguleret af NO syntaser (Noss), herunder neuronal NOS (nNOS), endotel NOS (eNOS) og inducerbar NOS (iNOS) [21], [22]. Blandt tre INGEN synthaser, iNOS, et Ca
2 + -uafhængigt enzym, defineres som “high-output ‘NOS, genererer store mængder af NO. Nogle tidligere papirer viser også iNOS viste sig at blive forøget i fremskredne stadier af melanom og ekspressionen af MDA-7 /IL-24 negativt reguleret iNOS udtryk i maligne melanom cellelinjer [23], [24], [25], hvilket tyder på, at iNOS kan bidrage til at øge tumorudvikling. Ikke desto mindre er den nøjagtige rolle iNOS i tumorigenese er uklar. Hvorvidt ZD55-IL-24-induceret iNOS fald vil yderligere påvirke Bcl-2 S-nitrosylering niveau er det første mål for vores nuværende undersøgelse. I betragtning af, at protein S-nitrosylering niveau ikke kun afhænger af NO-medieret S-nitrosylering via NOS men også denitrosylating enzym, såsom thioredoxin (Trx /TrxR) systemer [26], vi også undersøge, om Bcl-2 S-nitrosylering reduktion i svar på ZD55-IL-24 bestemmes af både iNOS og Trx /TrxR systemer.
Nogle foreliggende rapporter viser, at cisplatin-induceret dannelse af reaktive oxygenarter forårsager Bcl-2 S-nitrosylering som inhiberer 26S proteasom nedbrydning, hvilket tyder at S-nitrosylering kan udøve den biologiske funktion gennem skiftende proteinet stabilitet. Tilsvarende kunne NO-medieret S-nitrosylering af Bcl-2 forbundet med dets ubiquitin nedbrydning være vigtigt i apoptose resistens og udvikling af lungecancer induceret af Cr (VI) og andre carcinogener [16], [27]. Der er derfor en stigende interesse til at forstå den cellulære mekanisme, om Bcl-2 S-nitrosylering ændring i tilsætning af ZD55-IL-24 er impliceret i sin ubiquitinering og proteasomalaktivitet nedbrydning.
Da de mekanismer, hvorved MDA-7 /IL-24 undertrykker Bcl-2-ekspression og letter kræft celle apoptose er ikke blevet klarlagt. Vores nuværende undersøgelse bestemmes den betydelige rolle, Bcl-2 denitrosylation i sin ubiquitin proteasom nedbrydning, som endelig medierer caspase signal-aktivering og kræft celle apoptose som reaktion på ZD55-IL-24. Desuden Bcl-2 S-nitrosylering formindskelse i respons på ZD55-IL-24 indbefatter både iNOS-medieret S-nitrosylering og Trx /TrxR1 involveret med denitrosylation, som efterfølgende letter ubiquitinmedieret proteasom nedbrydning. Sådan en stram sammenhæng mellem Bcl-2 denitrosylation og ubiquitinering kaster nyt lys over IL-24-induceret Bcl-2 nedbrydning og specifik tumor apoptose.
Materialer og metoder
Celler og reagenser
det humane Henrietta Lacks (Hela) cellelinie, den humane malignt melanom cancer cellelinje (A375) og den humane renale carcinomacellelinie (7860) blev opnået fra Shanghai Cell Collection (Shanghai, Kina). Hela og A375-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (GIBCO BRL, Grand Island, NY) indeholdende 5% føtalt bovint serum (FBS, GIBCO-BRL), 2 mM L-glutamin og 100 enheder /ml penicillin /streptomycin og en 5% CO2 miljø ved 37 ° C. Nyrecanceren 7860 celler blev dyrket i RPMI1640-medium, suppleret med 5% FBS og antibiotika. Natriumnitroprussid (SNP), 2- (4-carboxyphenyl) -4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxy-3-oxid (PTIO), dithiothreitol (DTT), dimethylsulfoxid (DMSO) og Z-Leu- Leu-Leu-al (MG132) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO), Antistoffer for Bcl-2, phospho-Bcl-2 (Ser87), NOS2 (iNOS), protein A-agarose, og IL -24-siRNA, iNOS-siRNA og scrambled kontrol-siRNA blev købt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Antistoffer til ubiquitin og S-nitrosocysteine var fra Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO). Antistoffer til β-actin, procaspase-3, spaltet caspase-3, procaspase-9, kløvet caspase-9-antistoffer, anti-poly ADP-ribose polymerase (PARP) og spaltes PARP blev indkøbt fra Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA)
virus konstruktion og produktion
pZD55, E1 B 55-kDa-slettet onkolytiske adenovirus byggeri plasmid.; pCA13, E1-slettede adenovirus shuttle plasmid; og ZD55 forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) med reportergen EGFP blev venligst stillet til rådighed af professor Liu (Xin-Yuan Liu, Institut for Biokemi og Cellebiologi, Shanghai Institutes for Biologisk Institut, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, Kina). IL-24 blev først klonet i pCA13 til dannelse pCA13-IL-24. Derefter IL-24 udskåret fra pCA13 blev subklonet ind pZD55 at konstruere pZD55-IL-24. Oncolytisk adenovirus blev ZD55-IL-24 genereres i HEK293 celler (Shanghai Cell Collection, Shanghai, Kina) ved homolog rekombination mellem pZD55-IL-24 og adenovirus emballage plasmid pBHGE3 (Microbix Biosystems), hhv. Storskala oprensning af alle adenoviruspartikler blev udført ved ultracentrifugering med cesiumchlorid ifølge standardteknikker. De titre blev bestemt ved anvendelse af en mindeplade assay på HEK293 celler.
Små interfererende RNA assay
For forsøg med IL-24 specifikke siRNA’er, celler (3 × 10
5 per brønd) var udpladet i 6-brønds plader. 24 timer efter inkubation blev Hela-celler vasket, genopfyldes med frisk medium og behandlet med ZD55-IL-24 (20 MOI) i 12 timer, cellerne blev efterfølgende vasket og anbragt i frisk dyrkningsmedium og tilsat med IL-24 specifikt siRNA ( 100 nM) ved anvendelse af et siRNA transfektionsreagens. Efter 24 timer af siRNA transfektion blev cellelysater fremstillet og underkastet western blot-analyse som beskrevet nedenfor.
I forsøg med iNOS-siRNAs, celler blev transficeret med 100 nM iNOS-specifik siRNA i 12 timer, celler blev efterfølgende vasket og anbragt i frisk dyrkningsmedium og derefter behandlet med ZD-55-IL-24 (20 MOI) i 12 timer. Efter 24 timer af siRNA transfektion blev cellelysater fremstillet og underkastet western blot-analyse som beskrevet nedenfor.
Western Blotting
Efter særlige behandlinger, blev celler inkuberet i lysepuffer indeholdende 20 mmol /L Tris-HCI (pH 7,5), 1% Triton X-100, 150 mmol /l NaCl, 10% glycerol, 1 mmol /l Na
3VO
4, 50 mmol /l NaF, 100 mmol /l phenylmethylsulfonylfluorid, og en kommerciel protease inhibitor blanding (Roche Molecular Biochemicals) i 20 minutter på is. Efter uopløselige debris blev pelleteret ved centrifugering ved 14.000 g i 15 minutter ved 4 ° C blev supernatanterne opsamlet og bestemt for proteinindhold ved anvendelse af Bradford-metoden (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Proteiner (80 ug) blev løst under denaturerende betingelser ved SDS-PAGE (10%) og overført til nitrocellulosemembraner. Efter blokering i 2 timer i phosphatpufret saltvand med 0,1% Tween 20 (PBST) og 3% bovint serumalbumin (BSA) blev membranerne inkuberet natten over ved 4 ° C med det egnede primære antistof i PBST indeholdende 3% BSA. Membraner blev derefter vasket og inkuberet med alkalisk phosphatase-konjugeret gede-anti-kanin IgG eller anti-mus IgG (Sigma, 1:10 000) i PBST i 2 timer og udviklet ved hjælp NBT /BCIP farve substrat (Promega, Madison, USA).
immunopræcipitation
i immunopræcipitation cytosoliske fraktioner (hver indeholdende 400 ug af proteiner) blev fortyndet fire gange med HEPES-buffer indeholdende 50 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100 og 1 mM hver af EGTA, EDTA, PMSF og Na
3VO
4. Prøverne blev derefter præinkuberet i 1 time med 20 pi protein A agarose og centrifugeret for at fjerne eventuelle ikke-specifikt klæbet proteiner fra protein A agarose. Supernatanten blev derefter inkuberet med 2 ug specifikke antistoffer natten over ved 4 ° C. Efter tilsætning af protein A agarose blev blandingen inkuberet ved 4 ° C i yderligere 2 timer. Prøver blev tredobbelt vasket med HEPES-buffer og elueret ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) ladningsbuffer derefter kogt ved 100 ° C i 5 minutter. Immune komplekser blev adskilt ved 10% SDS-PAGE og analyseret ved Western blotting som beskrevet ovenfor.
Måling af apoptose ved Annexin V analyse
En Annexin V-bindende assay blev anvendt ifølge producentens instruktioner. Kort beskrevet blev celler (3 x 10
5 pr brønd) i plader med 6 brønde blev behandlet med ZD55-IL24 (20 MOI) for forskellige tidsrum 12 timer, 24 timer, 36 timer, 48 timer og 72 timer. Celler blev opsamlet, og Annexin V-FITC og propidiumiodid (PI) dobbelt farvning-assay blev udført ifølge producentens anvisninger ((Nanjing Keygen Biotech, Kina). Samlede celler blev kortvarigt vasket med iskold phosphatbufret saltvand (PBS ) to gange og resuspenderet i 200 pi 1 × bindingsbuffer indeholdende 5 pi Annexin V-FITC i 15 minutter og derefter i 300 pi 1 × bindingsbuffer indeholdende 5 pi propidiumiodid (PI) i 5 minutter ved stuetemperatur i mørke. efter inkubation blev cellerne analyseret under anvendelse af et FACStar flowcytometer.
Cellelevedygtighed assay
carcinomaceller (1,0 x 10
4 per brønd) blev inkuberet i tre eksemplarer på en plade med 96 brønde og behandlet med ZD55-IL-24 og NO modulatorer. Cell overlevelsesrate blev vurderet ved en standard 3- (4, 5-dimethylthazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay (Sigma, St. Louis , MO) i nærvær eller fravær af de angivne testprøver i et endeligt volumen på 0,2 ml for forskellige tidsrum ved 37 ° C. derefter 20 pi MTT-opløsning (5 mg /ml i PBS) blev derefter tilsat til hver brønd . Efter 4 timers inkubation ved 37 ° C blev 150 pi DMSO tilsat. Endelig blev pladerne rystet og den optiske densitet ved 570 nm blev målt på ELX-800 spektrometer læser (Bio-Tek Instruments Inc., USA). Fire replikatbrønde blev testet pr assay og hvert eksperiment blev gentaget tre gange. levedygtighed procent celle blev beregnet som forholdet mellem de eksperimentelle prøver til kontrolprøverne × 100.
Statistisk analyse
Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD. Statistisk analyse af resultaterne blev udført under anvendelse af t-test eller envejs-analyse af varians (ANOVA) efterfulgt af Duncans nye metode Multiple Range eller Newman-Keuls test.
P
-værdier. 0,05 blev betragtet som signifikante
Resultater
Effekt af ZD55-IL-24 på Bcl-2-ekspression og kræft celle levedygtighed
Protein udtryk for IL-24 og E1A ledsaget med adenovirus ZD55-IL-24 replikation og translation i Hela blev A375 og 7860 celler påvises ved Western blotting på de forskellige tidspunkter. Vores data viste en tydelig stigning af IL-24 fra 24 timer til 72 timer sammenlignet med kontroller, som vist i fig. 1A. Samtidig, E1A protein stående for replikation evne ZD55-IL-24 viste den indlysende forøgelse fra 12 timer til 72 timer i fig. 1B, som er magen til tidsforløbet for forstærket grønt fluorescensprotein (EGFP) ekspression behandlet med ZD55-EGFP i fig. 1D. Desuden Bcl-2-ekspression har den inverse fald fra 24 timer til 72 timer (fig. 1c). Desuden blev Bcl-2 fald i respons på ZD55-IL-24 vist på en dosis-afhængig måde. De effektive titere af ZD55-IL-24 til at hæmme Bcl-2-ekspression er 10 og 20 MOI, som vist i fig. 2A. For yderligere at undersøge, om ZD55-IL24 påvirker tre carcinomceller overlevelse blev cellelevedygtigheden bestemt ved MTT-assayet (fig. 1E). Vores resultater viste, at ZD55-IL-24 effektivt reduceret celleoverlevelse og denne inhibering blev også vist i en dosisafhængig måde (fig. 1 E og 2C). Tilsammen indikerer disse resultater den ZD55-IL24 kunne mediere et højt niveau og stabil IL-24 ekspression fra 24 timer til 72 timer og reducere Bcl-2-protein niveau i tids- og dosisafhængig måde.
Effekt af ZD55-IL-24 på Bd-2 S-nitrosylering og ubiquitinering
for at undersøge om ZD55-IL-24 ville bidrage til ændringer af Bel-2 S-nitrosylering og ubiquitinering, vi har registreret Bcl-2 S -nitrosylation og ubiquitinering niveau i Hela, A375 og 7860 celler. Resultaterne viste, at ZD55-IL-24 i HeLa-celler formindsket Bcl-2 S-nitrosylering fra 79% ved 24 timer til 38% ved 48 timer sammenlignet med kontrolgruppen (fig. 3A). I modsætning hertil Bcl-2 ubiquitinering steg fra 1,4 gange ved 24 timer til 2,3 gange ved 48 timer, som vist i fig. 3B. Resultaterne fra A375 og 7860 celler var i overensstemmelse med den ovennævnte tendens. For yderligere at bekræfte den potentielle rolle af IL-24 i reguleringen af Bcl-2 S-nitrosylering og ubiquitinering, specifikke IL-24-siRNA blev brugt til at knockdown IL-24-ekspression. Vores data indikerer IL-24-siRNA naturligvis restaureret Bcl-2 S-nitrosylering og således undertrykkes Bcl-2 ubiquitinering sammenlignet med scrambled kontrol siRNA (fig. 3C). Derfor ZD55-IL-24-induceret faldt Bcl-2 S-nitrosylering og øget Bcl-2 ubiquitinering.
Effekt af ZD55-IL-24 på caspase aktivering og kræft celle apoptose
For yderligere bestemme, om Bcl-2 uregelmæssig formindskelse i respons på ZD55-IL-24 ville resultere i aktiveringen af caspase signalvej i Hela-celler, caspase-9, caspase-3 og PARP blev påvist på den forskellige tidspunkter 12 timer, 24 timer , 36 timer og 48 timer henholdsvis som vist i fig. 4A. Resultaterne viste, at procaspase-9 gradvist faldt fra 76% ved 24 timer til 36% efter 48 timer. I modsætning hertil spaltede caspase-9 tilsvarende forøget fra 1,5- ved 24 h til 2,5 gange ved 48 timer sammenlignet med kontrolgruppen. Caspase-3 og PARP udført tilsvarende ændring som caspase-9. Vores resultater viser, at ZD55-IL-24 inducerede kløvning af caspase-9, caspase-3 og PARP at aktivere caspase signalvejen. Desuden blev HeLa-celler apoptose detekteret ved Annexin V /PI og derefter analyseret ved anvendelse af flowcytometri (fig. 4B og C). Resultaterne viste, at ZD55-IL-24 drastisk forbedret apoptose i HeLa-celler fra 2.3- ved 24 timer til 7,4 gange ved 72 timer sammenlignet med kontrolgruppen. Tilsammen ZD55-IL-24 indledte caspase signal-aktivering og kræft celle apoptose.
Effekt af Bcl-2 S-nitrosylering ændring om regulering af sit ubiquitinering som reaktion på ZD55-IL-24
For at undersøge om ZD55-IL-24 kunne regulere Bcl-2 S-nitrosylering via NO, som efterfølgende påvirker dets ubiquitinering, vi behandlede Hela, A375 og 7860 celler med NO-donor SNP, NO hæmmer PTIO og SNP co-administration af reduktionsmidlet DTT efter administration af ZD55-IL24 hhv. Som vist i fig. 5A, eksogene NO-donor SNP effektivt øgede Bcl-2 S-nitrosylering denne rednings effekt blev negeret ved co-administration med DTT. Samtidig, ingen inhibitor PTIO væsentligt reduceret Bcl-2 S-nitrosylering. Omvendt NO-donor SNP inhiberede ubiquitinering af Bcl-2, men DTT samtidig behandling modvirkes virkningerne af SNP. Desuden ingen inhibitor PTIO lettet ubiquitinering af Bcl-2 i fig. 5B. Fig. 5C viser ZD55-IL-24 behandling i 24 timer forårsagede et signifikant fald i Bcl-2-ekspression, som blev yderligere reduceret ved tilsætning af NO inhibitor PTIO. I modsætning hertil behandling med NO-donor SNP signifikant modstand ZD55-IL-24-induceret Bcl-2 nedregulering. 6A. 7A. Fig.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.