PLoS ONE: kaffesyre Derivater hæmmer væksten af ​​Colon Cancer: Inddragelse af PI3-K /Akt og AMPK signalveje

Abstrakt

Baggrund

afvigende regulering af phosphatidylinositide 3-kinaser (PI3-K) /Akt, AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) og pattedyr mål for rapamycin (m-TOR ) signalveje i kræft har bedt betydelig interesse i, at disse veje til behandling af cancer. Koffeinsyre (CA) er blevet rapporteret at besidde vigtige antiinflammatoriske virkninger. Imidlertid er de molekylære mekanismer, hvorved CA derivater, herunder kaffesyre phenethyl ester (CAPE) og kaffesyre phenylpropyl ester (CapPE), udøver inhiberende virkninger på proliferationen af ​​human colorectal cancer (CRC) celler er endnu ikke belyst.

Metode /vigtigste resultater

CAPE og Cappe blev evalueret for deres evne til at modulere disse signalveje og undertrykke spredning af CRC celler både

in vitro

in vivo

. Anti-cancer effekter af disse CA derivater blev målt ved hjælp af proliferationsassays, cellecyklus analyse, western blotting assay, reportergenassay og immunhistokemiske (IHC) farvning analyser både

in vitro

in vivo

. Denne undersøgelse viser, at CAPE og CapPE udviser en dosisafhængig inhibering af proliferation og overlevelse af CRC celler gennem induktionen af ​​G

0 /G

1 cellecyklusstandsning og forøgelse af apoptotiske veje. Forbruget af CAPE og Cappe hæmmede markant væksten af ​​kolorektale tumorer i en mus xenograft model. De virkningsmekanismer omfattede en graduering af PI3-K /Akt, AMPK og m-TOR signalering kaskader både

in vitro

in vivo

. Afslutningsvis resultaterne demonstrerer nye anti-cancer mekanismer CA derivater mod væksten af ​​humane CRC celler.

Konklusioner

CA derivater er potente anticancer-midler, som styrker AMPK aktivering og fremme apoptose i humane CRC-celler. kan anvendes strukturen af ​​CA derivater til rationelt design af hidtil ukendte inhibitorer, der er målrettet humane CRC celler

Henvisning:. Chiang E-PI, Tsai SY, Kuo YH, Pai MH, Chiu HL, Rodriguez RL, et al. (2014) kaffesyre Derivatives hæmmer væksten af ​​Colon Cancer: Inddragelse af PI3-K /Akt og AMPK signalveje. PLoS ONE 9 (6): e99631. doi: 10,1371 /journal.pone.0099631

Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan

Modtaget: Juli 3, 2013; Accepteret: 16 maj 2014; Udgivet: 24 Juni 2014

Copyright: © 2014 Chiang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette materiale er baseret på arbejde understøttes til dels af Undervisningsministeriet, Taiwan, ROC under ATU planen, National Science Rådet tilskud, under aftaler NSC-100-2320-B-039-003, 100-2628-B005-002-MY4, 101-2320-B-039-054-MY3, 101-2320- B-005-006-MY3, 102-2911-i-005 -301, 101-2811-B-039-024, Department of Health Grant under aftaler DOH 102-TD-B-111-004 og DOH-102- TD-C-111-005 og Kina Medical University (CMU) tilskud under aftaler CMU101- Award -10, CMU100-ASIA-11, CMU101-ASIA-3, og CMU101-S-25. Eventuelle udtalelser, resultater, konklusioner eller anbefalinger til udtryk i denne publikation, er dem med forfatter (e) og afspejler ikke nødvendigvis visningen af ​​Undervisningsministeriet, National Science Rådet, Department of Health, National Chung Hsing University, Taipei Medicinske Universitet Asien University, University of California Davis og Kina Medical University. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de førende årsager til kræft og kræft dødelighed i mange lande [1], [2]. I USA alene, er omkring 50.000 dødsfald tilskrives denne kræft om året [1], [2]. Mange undersøgelser har vist, at mutationer af phosphatidylinositide 3-kinase (PI3-K) /Akt og mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) /ekstracellulært-signal-regulerede kinase (ERK) molekyler er almindeligt observeret i forskellige former for kræft [3] [4]. For eksempel onkogen aktivering af PI3-K /Akt molekyler øger celleproliferation ved at øge cyclin D1 plan [5], [6]. Det er velkendt, at den afvigende ekspression af cyclin D1 og Cdk4 proteiner er involveret i proliferation af CRC-celler [7]. Undertrykkelse af PI3-K /Akt og MAPK /ERK signalveje fører til blokade af celleproliferation og viser betydningen af ​​disse signaleringskaskader i kontrollen af ​​både cellecyklusprogression og cellevækst under cancerudvikling [4], [8] . Derfor PI3-K /Akt og MAPK /ERK signalveje spiller fremherskende roller ved bestemmelse af skæbnen for tumorvækst. Maligne cancerceller løsnes fra den primære tumor og migrere tværs strukturelle barrierer, herunder basalmembraner og det omgivende stromale ekstracellulære matrix (ECM) [9]. Tumorinvasion og metastase kræver begge en stigning i ekspressionen af ​​matrixmetalloproteinaser (MMP’er) og nedbrydningen af ​​ECM [9], [10]. MMP’er er zink-afhængige endopeptidaser stand til at nedbryde ECM komponenter [11]. Enzymer såsom MMP-9 nedbrydes ECM og skabe en mikromiljø, der opretholder tumor udvikling [10], [11].

AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) er en brændstof-sensing molekyle, der fungerer som en regulator af energibalance [12]. AMPK er blevet vist at blive ubikvitært udtrykt i pattedyrsceller og at være involveret i energi-homeostase [13]. En øget adenosinmonophosphat (AMP) /adenosintriphosphat (ATP) ratio, hvilket afspejler et fald i cellens energi tilstand, fører til aktivering af AMPK proteinet ved phosphorylering [14]. Den forøgelse af AMPK aktivering menes at være omvendt korreleret med kræft risiko [15]. Nylige undersøgelser har endvidere foreslået, at aktivering af PI3-K /Akt og MAPK /ERK signalmolekyler er forbundet med en nedsat grad af phosphoryleret (aktiveret) AMPK under tumorprogression [16], [17]. Yderligere undersøgelser konkluderet, at AMPK-agonister er virkningsfulde til behandling af cancer [15], [18], mens andre undersøgelser viste, at lipogen enzym fedtsyresyntase (FASN) reguleres af energiindtag og spiller en afgørende rolle i carcinogenese [19] . En nylig undersøgelse rapporterede, at FASN ekspression er korreleret med væksten og udviklingen af ​​CRC [20]. Phosphoryleringen (dvs. aktivering) af Akt blev vist at inducere ekspressionen af ​​FASN og til at udløse aggressive malignitet i cancerceller [21]. I modsætning hertil behandling med en AMPK agonist, der fører til aktivering af AMPK, undertrykt ekspression af FASN og blokeret væksten af ​​kolorektal tumor [22] – [24]. Desuden epidemiologiske undersøgelser anførte endvidere, at AMPK (PRKAG2) enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) er forbundet med risikoen for menneskelige CRC [25]. Således har AMPK-medieret energi homøostase tiltrukket interesse for denne vej som et middel til behandling human coloncancer.

Mange undersøgelser har vist, at phenoliske syreforbindelser funktion som potente antioxidanter [26]. Blandt dem, kaffesyre (CA) er et ikke-vitamin phenolforbindelse findes hovedsagelig i grøntsager og frugt. Ud over sin antioxidant aktivitet, CA udøver antiinflammatoriske virkninger i flere slags celler [27], [28]. Nylige undersøgelser viste, at kaffesyre phenethyl ester (CAPE), en CA derivat naturligt isoleret fra honningbier propolis, også udøver sine gavnlige virkninger gennem antioxidant og anti-inflammatoriske aktiviteter [29], [30]. Desuden er det blevet påvist, at CAPE hæmmer spredning af kræftceller og fungere som en potentiel anti-cancer middel [31], [32]. Der er imidlertid ingen rapport af de inhibitoriske virkninger af CA derivater på AMPK pathway og /eller FASN ekspression under udviklingen af ​​CRC. Desuden kan den manglende ensartede resultater på tværs af en lang række undersøgelser og den manglende bestemme virkningsmekanismen for CA derivater forklare vanskeligheden ved at påvise den

in vivo

fordele ved CA derivat tilskud mod CRC. Vi undersøgte derfor de hæmmende virkninger af forskellige CA derivater på humane CRC celler både

in vitro

in vivo

. Resultaterne viste, at CA-derivater, såsom CAPE og kaffesyre phenylpropyl ester (CapPE) signifikant inhiberede cellulær proliferation i humane CRC-celler. CAPE og Cappe induceret cellecyklusstop gennem undertrykkelse af PI3-K /Akt og mTOR signalveje. Endvidere Californien derivater reducerede cellulære ATP-niveauer og undertrykt FASN ekspression. Virkningsmekanismen var forbundet delvist med en øgning af den AMPK-vejen. Resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at CA derivater fungerer som kemoforebyggende midler mod human CRC ved at modulere PI3-K /Akt, mTOR og AMPK signalveje både

in vitro

in vivo

.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

Humane kolon kræftceller HCT-116 og SW-480 blev købt fra American Type Culture Collection (Walkersville, MD). De følgende monoklonale antistoffer blev erhvervet fra Cell Signaling Technology, Inc .: Anti- N-cadherin (# 4061), PTEN (# 9559), anti-phosphorylering PDK1 (Ser241; # 3061), total-PDK1 (# 3062), anti -phosphorylation Akt (S473; # 4060), total-Akt (# 9272), anti-fosforylering GSK3α (S21; # 9327), total-GSK3α (4337), anti-fosforylering GSK3p (S9; # 9323), total-GSK3p (# 9315), anti-fosforylering FOXO3 (T32; # 9464), total-FOXO3 (# 12829), total-TSC1 (# 6935), total-TSC2 (# 3990), total-LKB1 (# 3047), total- 14-3-3 (# 8312), anti-phosphorylering ERK 1/2 (T202 /Y204; # 9101), total-ERK 1/2 (# 9102), anti-phosphorylering AMPKα (T172; # 2535), total- AMPKα (# 5832), anti-phosphorylering m-TOR (S2448; # 5536), total-m-TOR (2983), anti-FASN (# 3180), anti-NF-KB (p65) (# 3033), anti -Cdk4 (# 2906), anti-p21

WAF /CIP1 (# 2947), anti-cyclin E (# 4132), anti-cyclin D1 (# 2978), anti-c-myc (# 9402) og anti -Lamin A (# 2032) (Danvers, MA). Anti β-actin (# A2066) antistof og forbindelse C (specifik inhibitor af AMPK) blev erhvervet fra Sigma (St. Louis, MO). Den aktive Akt (Myr-Akt1, Addgene plasmid # 9008) og kontrol tom vektor (pcDNA3, Addgene plasmid # 10792) blev opnået fra Addgene. Den tumornekrosefaktor α (TNF-α) rekombinant protein var fra R 90% blev anvendt til injektioner

Dyr, Kost og CA Afledte Tilskud

Voksen (3-4 uger gamle) BALB /C Ann. -Foxn1 nøgne mus (19-22 g) blev opnået fra National Laboratory Animal center (Taipei, Taiwan). Musene blev opretholdt under specifikke patogenfrie forhold i anlæg, der er godkendt af National Laboratory Animal Center i overensstemmelse med gældende regler og standarder (dyr protokol nr. 102-142-N). Ovennævnte brug dyr protokol er blevet revideret og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på Kina Medical University. Dyret Undersøgelsen blev gennemført i henhold til den nationale retningslinje og den godkendte dyr protokol for at opretholde dyrevelfærden og forbedre lidelser i forsøgsdyrene. Under hele forsøgsperioden blev mus fodret med en standard Lab 5010 Kost indkøbt fra LabDiet Inc. (St. Louis, MO, USA). Standarden kost indeholder råfedt (13,5% totalt kosten energi), protein (27,5%) og kulhydrat (59%), og havde ingen påviselige CA derivater, som angivet af leverandøren. Mus, der var blevet bedøvet med en inhalation af isofluoran blev anbragt i rygleje. Musene var subkutant (s.c.) injiceret med human coloncancer HCT-116-celler (1 x 10

6 /0,1 ml medium) i den højre flanke af hver BALB /C ANN-Foxn1 nøgen mus. Et godt lokaliseret bleb blev anset for at være et tegn på en teknisk tilfredsstillende injektion.

Efter inokulation blev musene inddelt i tre undergrupper (n = 6 pr gruppe). CA derivater blev givet til forsøgsdyrene ved gavage én gang dagligt ved et totalt volumen 0,15 ml. CAPE og CapPE grupper fik hver en daglig oral dosis af CA-derivater opløst i majsolie (4% vægt /vægt) ved 50 nmol /kg af BW gang om dagen. tumor kontrol gruppen fik majsolie (4% vægt /vægt) en gang pr eneste dag. Normale mus uden tumor- podning blev anvendt som den negative kontrol. Tumorvolumen blev beregnet ved følgende formel: 0,524 L1 (L2)

2, hvor L1and L2 repræsenterer den lange og korte akse af tumoren, hhv. BW blev bestemt en gang om ugen. Ingen signifikante forskelle i fødeindtagelse eller kropsvægt blev fundet i denne undersøgelse. Ved afslutningen af ​​forsøgsperioden blev dyrene aflivet ved CO

2 inhalation; tumorvæv blev derefter udskåret, vejet og straks nedfrosset. Disse tumorvæv blev sektioneret og farvet med Mayers hematoxilin- eosin (H CapPE: 5, 45, 56, 59 og 64%) (figur 2A). De IC50’er for CAPE og Cappe i humane CRC HCT-116 celler er 44,2 uM og 32,7 uM, hhv. Ved de koncentrationer på 5, 10, 20, 50 og 100 uM, CAPE og CapPE undertrykte signifikant proliferationen af ​​humane CRC SW-480-celler, hhv. (Inhiberende virkninger CAPE: 0,5, 8,9, 14, 19 og 32%; Cappe: 6, 15, 22, 26 og 47%) (figur 3A). De IC50’er for CAPE og Cappe i humane CRC SW-480 celler er 132,3 uM og 130,7 pM hhv. Disse resultater viser, at CAPE og CapPE hver er i stand til signifikant at hæmme proliferation af humane CRC-celler på en dosis-afhængig måde. CapPE synes at inhibere proliferation af humane CRC HCT-116 celler mere effektivt end CAPE. Derfor blev CAPE og Cappe udvalgt til yderligere undersøgelse af deres potentielle anti-cancer effekter på human CRC celler. Rolle signalering molekyler på celleproliferation i humane CRC celler behandlet med CA-derivater blev undersøgt. I disse celler Akt var enten overudtrykkes ved transfektion med en konstitutivt aktiv Myr-Akt1- plasmid, eller AMPK aktivitet blev inhiberet af forbindelse C. Som vist i figur 2A, både over-ekspression af Akt og undertrykkelse af AMPK aktivitet reddet celleproliferation hæmmes af CAPE eller Cappe behandlinger i human CRC HCT-116 celler. Virkningerne af Akt overekspression eller nedsat AMPK aktivitet på redning celleproliferation var mindre markant, men i SW-480-celler behandlet med CA-derivat (figur 3A). Ekspressionsniveauer af p-Akt og t-Akt proteiner ved overekspression af en konstitutivt aktiv form af Akt i human CRC HCT-116 og SW-480-celler blev vist i figur 2B og 3B henholdsvis. Ekspressionsniveauer af p-AMPK og t-AMPK proteiner ved behandling af forbindelse C i humant CRC HCT-116 og SW-480-celler blev vist i figur 2C og figur 3C henholdsvis. Resultaterne antydede, at CA-derivater virker som kemoforebyggende midler mod human CRC gennem en graduering af PI3-K /Akt og AMPK signalveje

(A) Humant CRC HCT-116-celler blev dyrket i RPMI-1640 medium med CAPE og CapPE (ved koncentrationer på 0, 5, 10, 20, 50 og 100 uM) i nærvær eller fravær af forbindelse C (10 uM) i 24 timer. Transfektioner af konstitutivt aktive Akt (Myr-Akt1) og tom vektor (pcDNA3) blev udført før behandling af CA-derivater. Celleproliferationen blev målt ved MTT-assay som beskrevet i Materialer og Metoder. Data er middelværdier ± SD (standardafvigelse) af tre uafhængige eksperimenter. De forskellige symboler (??? for CAPE og ▵ for Cappe) repræsenterer en statistisk signifikant forskel i forhold til CA derivat -untreated kontrolgruppe i hver gruppe, henholdsvis ved P 0,05. De forskellige symboler (# for CAPE_Akt, § for CAPE_compound C, ▴ for CAPPE_Akt, og ▪ for CAPPE_compound C) repræsenterer en statistisk signifikant forskel i forhold til hver tilsvarende CA derivative- behandlet kontrolgruppe i hver dosis undergruppe henholdsvis på P 0,05. (B-C) Cytoplasmatiske proteiner blev forberedt til Western blotting-analyse under anvendelse af monoklonale antistoffer mod anti-fosforylering Akt (S473), total-Akt, anti-fosforylering AMPKα (T172) og total-AMPKα.

(A) Human CRC SW-480-celler blev dyrket i RPMI-1640 medium med CAPE og CapPE (ved koncentrationer på 0, 5, 10, 20, 50 og 100 uM) i nærvær eller fravær af forbindelse C (10 uM) for 24 timer. Transfektioner af konstitutivt aktive Akt (Myr-Akt1) og tom vektor (pcDNA3) blev udført før behandling af CA-derivater. Celleproliferationen blev målt ved MTT-assay som beskrevet i Materialer og Metoder. Data er middelværdier ± SD (standardafvigelse) af tre uafhængige eksperimenter. De forskellige symboler (??? for CAPE og ▵ for Cappe) repræsenterer en statistisk signifikant forskel i forhold til CA derivat -untreated kontrolgruppe i hver gruppe, henholdsvis ved P 0,05. De forskellige symboler (# for CAPE_Akt, § for CAPE_compound C, ▴ for CAPPE_Akt, og ▪ for CAPPE_compound C) repræsenterer en statistisk signifikant forskel i forhold til hver tilsvarende CA derivative- behandlet kontrolgruppe i hver dosis undergruppe henholdsvis på P 0,05. (B-C) Cytoplasmatiske proteiner blev forberedt til Western blotting-analyse under anvendelse af monoklonale antistoffer mod anti-fosforylering Akt (S473), total-Akt, anti-fosforylering AMPKα (T172) og total-AMPKα.

CAPE og Cappe hver induceret G

0 /G

1 cellecyklusstop i CRC celler

for at bestemme om CA derivat-medieret suppression af celledeling skyldtes en anholdelse på et bestemt tidspunkt i cellecyklus, blev virkningerne af CAPE og Cappe undersøges nærmere i HCT-116 og SW-480 celler. Celler behandlet med CAPE eller CapPE blev underkastet flowcytometrisk analyse efter deres DNA blev farvet med PI. Histogrammer for de flowcytometriske data er vist i figur 4A. CAPE og CapPE signifikant induceret cellecyklusstop på G

0 /G

1 fase på en dosis-afhængig måde (P 0,05). Ved en koncentration på 50 uM, CAPE og Cappe væsentligt forøget cellecyklusstop af HCT-116 celler under G

0 /G

1 fase med op til 56% og 61%, henholdsvis, mens der i kontrolgruppen procentdelen af ​​celler i G

0 /G

1 fase var kun 34% (figur 4B). Ved en koncentration på 50 uM, CAPE og Cappe væsentligt forøget cellecyklusstop af SW-480 celler under G

0 /G

1 fase med op til 44% og 57%, henholdsvis, mens der i kontrolgruppen procentdelen af ​​celler i G

0 /G

1 fase var kun 37% (figur 4C). Disse stigninger i G

0 /G

1 anholdelse var for det meste på bekostning af S og G

2 /M fase cellepopulationer. CapPE synes at inducere G

0 /G

1 cellecyklusstandsning mere effektivt end CAPE i humane CRC-celler. Således er det sandsynligt, at CAPE og Cappe hæmmede celledeling af humane CRC celler gennem en cellecyklusstop på G

0 /G

1 fase.

Humane CRC celler blev synkroniseret i RPMI- 1640 medium med 0,05% FBS i vævskulturskåle natten over. For at måle fordelingen af ​​cellecyklussen, celle blev dyrket i nærvær eller fravær af CAPE og CapPE (0, 10, 50 og 100 uM) dyrket i 10% FBS RPMI-1640 medium i yderligere 24 timer. (A) måling af cellepopulationen ved forskellige cellecyklusfaser blev udført under anvendelse af flowcytometri analyse, som beskrevet under materialer og metoder. Dataene indikerer (B) HCT-116 celle (C) SW-480-celle population procent ved forskellige cellefaser under behandlingen af ​​CAPE eller Cappe i humane CRC celler. Humane CRC (D) HCT-116-celler (E) SW-480-celler blev behandlet med enten CAPE eller CapPE (ved koncentrationer på 0, 5, 10, 20, 50 og 100 uM) i 10% FBS RPMI-1640 i 24 timer . Kerneproteiner blev fremstillet til Western blotting-analyse under anvendelse af monoklonale antistoffer mod cyclin D1, Cdk4, PCNA, og lamin A-antistoffer, som beskrevet under materialer og metoder. Niveauerne af detektering repræsenterer mængden af ​​cyclin D1, Cdk4 og PCNA i kernerne i human CRC celler. Resultaterne (gennemsnit ± SD) repræsenterer den folder ændring af kontrolgruppen og er repræsentative for tre forskellige forsøg. De immunreaktive bånd noteret med en pil. De gennemsnitlige integrerede tætheder af disse proteiner reguleres med den interne kontrol lamin A protein er vist i nederste række.