PLoS ONE: nedregulering af homolog rekombination DNA-reparation gener ved HDAC hæmning i prostatakræft medieres gennem E2F1 Transskription Factor

Abstrakt

Baggrund

histondeacetylaseinhibitorer (HDAC-hæmmere) re-udtrykke tavshed tumorsuppressorgener og er i øjeblikket undergår kliniske forsøg. Selvom HDAC-hæmmere har været kendt for at inducere genekspression, er et lige antal gener nedreguleret ved HDAC-inhibering. Mekanismen bag denne nedregulering fortsat uklart. Her giver vi tegn på, at flere DNA reparation gener nedreguleres af HDAC hæmning og en mekanisme involverer E2F1 transskription faktor i processen.

Metode /vigtigste resultater

Anvendelse Analyse af Functional Annotation (AFA ) på mikroarraydata af prostatacancerceller behandlet med HDAC-hæmmere, fandt vi et antal gener i DNA beskadigelse respons og reparation veje er nedreguleres af HDAC-hæmmere. AFA afslørede berigelse af homologe rekombination (HR) DNA reparation gener af BRCA1 pathway, såvel som gener reguleret af E2F1 transcription faktor. Prostata kræftceller viste en nedsat DNA-reparation kapacitet og en øget sensibilisering til kemikalie- og radio-DNA skadelige agenter efter HDAC hæmning. Rekruttering af centrale HR reparation proteiner til stedet for DNA-skader, samt HR-reparation kapacitet blev kompromitteret på HDACi behandling. Baseret på vores AFA data, vi hypotese, at E2F transkriptionsfaktorer kan spille en rolle i nedregulering af centrale reparation gener upon HDAC-inhibering i prostatacancerceller. Chip analyse og luciferaseassays afslører, at nedregulering af centrale reparation gener medieres gennem nedsat rekruttering af E2F1 transskription faktor og ikke gennem aktiv undertrykkelse af undertrykkende E2F’ere.

Konklusioner /Betydning

Vores undersøgelse indikerer at flere gener i DNA-reparationsvej påvirkes ved HDAC-inhibering. Nedregulering af reparation gener på grund af et fald i mængden og promotor rekruttering af E2F1 transskription faktor. Da HDAC hæmning påvirker flere veje, der potentielt kan have en indvirkning på DNA-reparation, kunne kompromitteret DNA-reparation på HDAC hæmning også tilskrives flere andre veje ud over de undersøgte i denne undersøgelse dem. vores undersøgelse giver dog give indsigt i den mekanisme, der regulerer nedregulering af HR-DNA reparation gener på HDAC hæmning, hvilket kan føre til rationale brug af HDAC-hæmmere i klinikkerne

Henvisning:. Kachhap SK, Rosmus N, Collis SJ , Kortenhorst MSQ, Wissing MD, Hedayati M, et al. (2010) Nedregulering af homolog rekombination DNA-reparation gener ved HDAC-inhibering i prostatakræft medieres gennem E2F1 Transcription Factor. PLoS ONE 5 (6): e11208. doi: 10,1371 /journal.pone.0011208

Redaktør: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Tyskland

Modtaget: Marts 17, 2010; Accepteret: 25. maj 2010; Udgivet: 18 juni 2010

Copyright: © 2010 Kachhap et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet understøttes af Flight Attendant Medical Research Institute, David Koch Fund, som blev leveret af prostatakræft Foundation, prostatakræft Foundation Grant, Specialized Program for Forskning Excellence Grant P50-58236, og AEGON. MDW er støttet af Dr. Saal van Zwanenberg Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epigenetisk regulering af genekspression menes at være forårsaget af begge kromatin modulatorer, der modificerer N-terminale haler af histoner og DNA methylering enzymer, methylere CpG klynger i promotoren regioner af eukaryote genomer [1], [2 ], [3]. Kræftceller modulere epigenetiske maskiner til tavshed tumor og metastatiske undertrykkere at opnå selektiv vækst og invasive egenskaber [4], [5], [6]. Den HDAC klasse I og klasse II-enzymer danne komplekser med co-repressorer såsom NuRD og SMRT /NCoR komplekser [7]. Cancerceller, herunder prostatacancer (PSA), rekruttere forskellige HDAC’er forbundet med disse store multi-protein co-repressor komplekser til tavshed tumorsuppressorgener og dette tjener som et rationale for anvendelse af HDAC-hæmmere til behandling af cancer [8], [9] .

aktiviteten af ​​både klasse i og klasse II HDACs inhiberes af kortkædede fedtsyrer (phenylbutyrat, Valproic acid (VPA)) og hydroxamsyrer (vorinostat, Trichostatin A), mens benzamider (MS-275) synes at være specifikt for klasse i HDAC [8]. Omvendt klasse III HDAC, de sirtuins, ikke hæmmes af et af disse midler [10]. For nylig Vorinostat er blevet godkendt af FDA til behandling af kutant T-celle lymfom. Vi og andre har vist, at behandling af PCa med HDAC-hæmmere eller DNA methyltransferase hæmmere aflaster undertrykkelse, der forårsager reexpression af tavshed tumorsuppressorer fører til cellecyklusstop, ældning og apoptose [11], [12], [13]. Kombinationen af ​​HDAC-hæmmere med andre midler har vist sig at være effektiv for en bred vifte af cancerformer. Selvom HDAC-hæmmere har været kendt at opregulere et antal gener, er paradoksalt nok et lige antal gener undertrykkes ved HDAC-inhibering [14], [15], [16]. Undertrykkelse af gener upon HDAC hæmning kan være resultatet af indirekte aktioner under repressorer, som aktiveres og forårsage undertrykkelse i en HDAC passiv mode, eller repression kunne være forårsaget af aktiv rekruttering af HDAC’er til iværksættere af udvalgte gener [17]. Veje, der nedreguleres på HDAC hæmning oprette indstillinger for behandlingsmodaliteter, der er ineffektive i deres tilstedeværelse. De seneste rapporter tyder på, at HDAC-hæmmere såsom phenyl butyrat, VPA, MS-275 og SAHA kan potensere stråling følsomhed af cancerceller [18], [19], [20], [21]. Transkriptionel nedregulering af visse gener, der er involveret i homolog rekombination (HR) og ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ) DNA-reparationsveje har været impliceret [18], [19], [20], [22].

dobbelte strengbrud (DSBs) kan induceres af endogene midler, såsom reaktiv ilt arter og replikation stress ved strandede replikationsgafler, eller kan induceres af eksogene midler som ioniserende stråling [23]. Det er mere tydeligt, at DNA-beskadigelse registreres af proteinkomplekser, betegnet DNA-beskadigelse sensorer, som igen inducerer en signaltransduktionskaskade, der rekrutterer mægler og effektor proteiner til de beskadigede steder, hvilket fører til reparation af DNA [24]. Afhængig af omfanget af skaden, yderligere signaltransduktion advarer cellen til enten forsinke cellecyklus gennem checkpoint aktivering for reparationsprocesser at fuldføre, eller undergå apoptose [24]. Hver type DNA-ødelæggelse afføles og repareres af distinkte DNA-reparationsveje. MRN kompleks, bestående af Mre11-RAD50-NBS1 mediator kompleks, sanser DSBs og rekrutterer ATM, en PI3K-lignende kinase, til stedet for DSBs [25]. ATM aktiveres efter ansættelsen DSBs og phosphorylerer downstream substrater, indlede signaltransduktion proces [26].

ATM og relaterede kinaser, ATR og DNAPK, phosphorylerer en histon variant γ-H2AX ved ser-139 som indlæser til lokaliteter af DSBs og dækker megabaser flankerer DSB’er; dette udgør ioniserende stråling inducerede foci. Phosphorylerede γ-H2AX rekrutterer flere mediator proteiner [27]. Blandt disse mediatorer er BRCA1 forbundet overvågning kompleks og 53BP1. Signaltransduktionskaskaden forstærkes yderligere af transducer checkpoint kinaser, CHK1 og CHK2, der aktiveres ved phosphorylering via ATM og ATR. ATM og ATR sammen med CHK1 /Chk2 kinaser phosphorylerer et antal effektorceller substrater, der omfatter BRCA1, RAD51, p53, og Mdm2 [28]. Phosphorylering af p53 fører til dets stabilisering, hvilket medfører en cellecyklusstandsning gennem induktion af p21, eller i tilfælde af større DNA-skader, apoptose. Gået i stå replikationsgafler, der opstår på grund af DNA-skader og replikation stress, er registreres af PCNA relaterede rad9-rad1-hus1 eller 911-komplekset, hvis rekrutteringen til den gået i stå site er medieret af replikation protein A og ATR. De endelige effektor proteiner, der reparerer det beskadigede DNA aktiveres og rekrutteret af de ovennævnte kinaser og mediator proteiner til skadestedet og reparation ensues.

Gener af DNA reparation veje er stramt reguleret både på det transskriptionelle og sende transkriptionel niveau. På det transskriptionelle niveau, har E2F transkriptionsfaktorer været kendt for at spille en rolle i reguleringen reparation proteiner. Der er ni kendte E2F transkriptionsfaktorer, der kan opdeles i transkriptionelle aktivatorer (E2F1, E2F2, E2F3a) og repressorer (E2F4-8); E2F3b har været en hypotese til at fungere som en repressor [29]. E2F1 og E2F4 har været impliceret i reguleringen af ​​CHK1, BRCA1 og RAD51 gener [30], [31], [32].

For nylig, vi rapporterede en roman “multiple-loop, double-terning” cDNA microarray design, at analysere HDAC inhibitor inducerede ændringer i genekspression tværs følsomme og resistente PCA cellelinier [16]. Anvendelse Analyse af Funktionel Annotation (AFA) på datasættet fra ovenstående microarray eksperiment vi fandt, at adskillige gener af HR reparation og DNA skade responset pathway nedjusteres upon HDAC-inhibering. I denne rapport, vi demonstrerer transkriptionel nedregulering af flere DNA skade responset gener i PCA celler efter HDAC hæmning, give funktionel dokumentation for inddragelse af HR-reparation vej hos kompromitteret DNA-reparation, og giver en rolle E2F1 transskription faktor i nedregulering af DNA skader respons gener.

Resultater

AFA afslører HDAC-hæmmere nedmodulere flere gener i DNA-skader og respons pathway i PCa

AFA blev udført på vores nyligt offentliggjorte microarray data sæt af to PCA cellelinier (PC3 og DU-145) behandlet med vorinostat (tidligere kendt som SAHA) og VPA [16]. Analysen afslørede nedregulering af adskillige gener involveret i DNA beskadigelse respons og reparation (tabel 1). Protein-protein interaktion analyse af microarray data viste adskillige gener relateret til E2F1 og BRCA1 veje blev nedreguleret med begge HDAC-hæmmere mere end 1,3 gange i både PCA cellelinjer (Fig. 1a). Mange af disse nedreguleret gener er involveret i HR DNA-reparation vej. Overraskende NHEJ pathway beslægtede gener, specielt DNAPK og Ku, blev ikke påvirket i vores arrays. Tidligere rapporter har vist, at RAD51 nedreguleres ved HDAC inhibitor behandling i en række forskellige cellelinjer [18], [19], [20]. Vores microarray data viste, at ud over RAD51 og beslægtede gener, en lang række af gener involveret i DNA beskadigelse respons og reparationsvej såsom BRCA1, Chk1, Topo IIα, hus1, og Bubr1 blev nedreguleret ved HDAC inhibitor behandling (fig. 1b) .

a) DU145 og PC3 celler blev behandlet med to forskellige HDAC-hæmmere (vorinostat (Saha, 1 uM), og VPA (valproat, 1 mM) for inkubationsperioder (2 dage og 4 døgn). AFA afslører ned- regulering af gener involveret med DNA-skade og respons (se tabel 1). AFA resultater for protein-protein-interaktion indikerer BRCA1 og E2F interagerende net påvirkes af HDAC-inhibering. Farve koden repræsenterer som 10

-n

p-

værdier opnået fra Wilcoxon rank-sum test. b) DNA reparation gener nedreguleret ≥1.3 fold i både PC3 og DU-145 celler ved behandling med både VPA og vorinostat. c) Validering af AFA blev udført af en Q-PCR-analyse på en delmængde af gener nedreguleret ved 1,5 mM VPA behandling. Resultater er afbildet som gange ændring i forhold til ubehandlede kontrolceller.

For at forstå konsekvensen af ​​nedmodulering og få mere indsigt i mekanismen bag nedmodulering, udførte vi yderligere analyse under anvendelse af to PCa celle linjer (DU-145 og LNCaP) ved hjælp af HDAC-hæmmer VPA. For at validere vores microarray data, udførte vi en Q-PCR-analyse på en delmængde af reparation gener. Vore data viser, at alle de testede gener blev nedreguleret i begge cellelinier, bortset hus1 der blev nedreguleret kun i LNCaP-celler (fig. 1c). BRCA1, RAD51 og Chk1 er kendt for at være reguleret af E2F transkriptionsfaktor [30], [31]. Da AFA afslørede berigelse for nedmodulering af E2F1 målgener, herunder E2F1 selv undersøgte vi transkript niveau af både aktivator (E2F1) og repressor E2F (E2F4 og 6) transkriptionsfaktorer. Vores resultater viser, at E2F1 var signifikant nedreguleret i både cellelinier behandlet med VPA, mens repressoren E2F’ere ikke blev påvirket i nogen af ​​de cellelinier upon VPA behandling (fig. 1c).

nedmodulering af DNA reparation gener af HDAC hæmning fører til øget følsomhed af PCA celler til DNA skadelige stoffer

Tidligere rapporter fra vores gruppe og andre har vist, at HDAC-hæmmere som VPA kan mindske spredning af prostata cancer celler [11], [16]. HDAC-hæmmere har også været kendt for at virke som strålingssensibiliserende [18], [19], [20]. Vi antager, at nedmodulering af DNA reparation gener upon HDAC-inhibering ville medføre øget følsomhed over for forskellige DNA-ødelæggende midler. DU-145-celler blev underkastet klonogene overlevelse assays efter behandling med en kombination af HDAC-hæmmere og forskellige midler, der inducerer DSBs såsom stråling, cisplatin og hydroxyurinstof. En radiosensitivitet klonogene assay blev udført med stigende doser af VPA i nærvær af en stigende dosis af stråling. Som forventet, VPA gjorde radiosensitize DU-145 celler, og der var en stigning i følsomhed med stigende doser (Fig. 2a). For nylig er det blevet påvist, at en defekt i homolog rekombination kan føre til ændringer i lægemiddelfølsomhed profil, hvilket gør BRCA1 deficiente brystkræft følsomme over for mitomycin C, cisplatin, etoposid og andre stoffer, der producerer dobbeltstrengede læsioner [33]. Vi hævdede, at dette kan være tilfældet for HDACi behandlede PCA celler, hvor der er et fald i BRCA1 pathway relateret genekspression. Klonogene assays udført efter behandling af DU-145-celler med VPA alene eller i kombination med cisplatin og hydroxyurinstof, afslørede, at i sammenligning med et enkelt middel, kombinationen af ​​VPA med enten hydroxyurinstof eller cisplatin stærkt formindsket klonogene overlevelse (fig. 2b og c) .

a) klongenicitetsassayet udført i DU-145 efter behandling med forskellige doser af VPA i 48 timer inden bestråling med forskellige doser af stråling. Top panel viser repræsentative klonogene plader med 0Gy og 4 Gy stråling grafen nedenfor afbilder overlevende fraktion efter VPA behandlinger og bestråling. Error søjle repræsenterer standardafvigelse for tre uafhængige forsøg. b) klongenicitetsassayet udført på DU-145-celler behandlet med 1,5 mM VPA og cisplatin (100 nM og 250 nM) i 48 timer. Fejl søjle repræsenterer standardafvigelsen. c) klongenicitetsassayet udført på DU-145-celler behandlet med 1,5 mM VPA og hydroxyurea (0,5 mM og 1 mM) i 48 timer. Fejl søjle repræsenterer standardafvigelsen.

HDAC hæmning af VPA fører til et fald i DNA reparation proteiner af HR og DNA skade responset pathway

følsomhed over for forskellige DNA-ødelæggende agenter ved HDAC hæmning kunne være resultatet af kompromitteret eller subnormal DNA-reparation evne i behandlede celler. Dette kan tilvejebringes ved nedregulering af DNA reparation gener ved HDAC-inhibering. Radiosensibilisering af HDAC-hæmmere har været forbundet med et fald i RAD51 genekspression i PCa [20]. Til første test, om VPA forårsager et fald i dobbelt streng break DNA-reparation kapacitet på PCA celler udførte vi en neutral komet assay til at vurdere for DNA-reparation evne prostata kræftceller på HDAC hæmning [34], [35]. Under de anvendte forsøgsbetingelser, vi fandt ikke nogen statistisk forskel i halen øjeblik af VPA behandlede og ubehandlede kontrol celler uden stråling. Men i fravær af VPA behandling celler udsat for 4 Gy bestråling var i stand til at reparere det meste af deres beskadigede DNA i 4 timer. Men efter VPA behandling både prostatacellelinjer viste signifikant højere hale øjeblikke 4 timer efter udsættelse for 4 Gy bestråling tyder reduceret DNA reparation kapacitet (fig. 3a). For at bestemme, om DSB reparationen er kompromitteret på HDAC hæmning, vi ansat H2AX foci clearance som en indikator for effektiv DSB reparation. DU-145 og LNCaP-celler blev behandlet med VPA og bestrålet med 2 Gy, 4 Gy, og 6 Gys af stråling. Celler blev fikseret efter 4 timer for reparation og sonderet med Ser

139 fosforylerede H2AX antistoffer. Som forventet blev en stigning i H2AX foci findes i PCA celler behandlet med VPA, hvilket indikerer et fald i DNA-reparation kapacitet (fig. 3b). Kompromitteret DNA-reparation kan være resultatet af et fald i den samlede mængde af reparation protein og /eller et fald i lokalisering eller ansættelse af reparations-proteiner til det beskadigede sted. For at teste disse muligheder, vi først undersøgt niveauet af reparation proteiner, der viste sig at være downmodulated i vores microarray datasæt efter VPA behandling. Mange af disse gener, såsom RAD51, BRCA1 og Chk1, induceres ved DNA-beskadigelse [24]. For at undersøge, om disse proteiner forbliver nedreguleres ved HDAC-inhibering selv ved DNA-skader, udførte vi vores analyse i fravær og nærvær af stråling. En stigning i den samlede H3 acetylering i DU-145 og LNCaP-celler viste, at VPA forårsager en effektiv global HDAC inhibering ved doseringen anvendt til forsøgene (fig. 4a og data ikke vist). Forøgelse af koncentrationen af ​​VPA forårsager et fald i BRCA1 og RAD51 i begge DU-145 og LNCaP-celler, mens andre reparation proteiner, såsom DNAPK og NBS1 forblive upåvirket (fig. 4b og c). BRCA1 protein niveauer er ikke stabil i cellen, og toppe ved forskellige tidspunkter afhængig af fasen af ​​cellecyklussen. For at forstå, når BRCA1 nedreguleres i VPA-behandlede celler, blev lysater opsamlet på hvert tidspunkt efter behandlingen. BRCA1 blev fundet at falde så tidligt som 18 timer efter behandling (fig. 4c), hvilket indikerer en hurtig reaktion på HDAC-inhibering. Bestråling af PCA-celler, post behandling med VPA, demonstrerede visse DNA-skade respons og reparation proteiner, såsom ATR og NBS1 forblev upåvirket, mens DNAPK blev induceret ved VPA behandling i nærvær af stråling (fig. 5a). RAD51, blev BRCA1 og CHK1 fundet at forblive nedreguleret selv ved bestråling i VPA-behandlede celler. BRCA1 er et kerneprotein, der distribuerer til cytoplasmaet under visse betingelser. For at konstatere, at behandling med VPA resulterer i nedregulering af BRCA1 i den nukleare rum, blev DU-145-celler behandlet med VPA og bestrålet 48 timer efter behandling med 4 Gy stråling. Nukleare ekstrakter fremstillet ud fra disse celler blev immunoprobed for BRCA1. Som vist i fig. 5b, VPA-behandlede celler har en nedregulering af BRCA1 protein, selv efter bestråling.

a) Neutral komet assay udført på prostatacancerceller behandlet med 1,5 mM VPA i 48 timer og bestrålet med 6 Gy γ- stråling efterfulgt af en 4 h reparation interval. Bestrålede celler (0Gy) med og uden VPA behandling viste ingen signifikant forskel i komet hale øjeblikke. Grafen viser gennemsnitlige hale øjeblik af 50 celler fejl bar indikerer SD værdi på tre eksperimenter. Sammenligninger er blevet udført under anvendelse af t-test. b) Immunofluorescens viser H2AX Ser

139 farvning i DU-145-celler behandlet med 1,5 mM VPA i 48 timer og bestrålet med 4Gy stråling efterfulgt af 4 timer reparationstid. Grafen viser kvantificering af H2AX foci i kontrol (blå søjle) og behandlet (rød søjle) DU-145 og LNCaP-celler. Error søjle repræsenterer standardafvigelse for tre uafhængige forsøg.

a) Western blot, som viser acetylering af histon H3-protein i DU-145-celler efter behandling med forskellige doser af VPA i 48 timer. b) DNAPK og NBS1 proteinniveauer i VPA behandlet DU-145-celler i 48 timer. c) Western blot, der viser RAD51 og BRCA1 protein niveauer i LNCaP og DU-145-celler behandlet med varierende dosering af VPA i 48 timer. Blot til højre viser DU-145 celler behandlet med 1,5 mM VPA for varierende tidspunkter sonderet for BRCA1 protein.

a) PCA cellelinjer behandlet med 1,5 mM VPA i 48 timer, bestrålet med forskellige doser af stråling, probet for forskellige former for reparation proteiner ved Western blotting. Ubestrålet (0Gy celler) var også inkluderet. b) Samlet og kerneekstrakt af VPA (1,5 mM i 48 timer) behandlet DU-145-celler med og uden bestråling probet for BRCA1 protein. Ubestrålet (0Gy celler) var også inkluderet. c) Top panel viser TOPO IIα proteinniveauet i nuklear ekstrakt fra DU-145 celler efter VPA behandling. Bottom panel er en agarosegel viser TOPO IIα aktivitet i de samme ekstrakter, bane 4 er en negativ kontrol.

Vores resultater havde angivet en markant reduktion i TOPO IIα transkriptniveauer ved behandling med VPA. TOPO IIα løser catenated DNA ved at inducere en forbigående DSB og efterfølgende religering [36]. TOPO IIα er blevet impliceret i en række cellulære processer, herunder DNA-replikation, transkription og kromosom opdeling [37]. Vi forventede nedregulering af TOPO IIα proteinet efter HDAC-inhibering. Til vores overraskelse, fandt vi TOPO IIα protein opreguleres ved VPA behandling i begge prostatacellelinjer (fig. 5c og data ikke vist). For at undersøge om dette fører til en stigning i aktivitet af TOPO IIα protein anvendte vi kerneekstrakt fra VPA behandlet DU-145-celler til måling decatenation aktivitet af TOPO IIα. Som det ses i fig. 5c, VPA-behandlede celler decatenated kinetoplast DNA mere effektivt end ubehandlede kontrolceller. Dette antyder, at selv om TOPO IIα nedreguleres på transkriptet niveau ved HDAC-inhibering, der findes en post translationel regulering hvorved proteinet er stabiliseret ved HDAC-inhibering.

Rekruttering af centrale HR DNA reparation proteiner påvirkes ved HDAC-inhibering førende til et fald i HR DNA-reparation

Område- og tidsmæssig rekruttering af mægler og DNA-reparationsmekanismer proteiner til bestråling induceret foci er nødvendig for effektiv DNA-reparation at forekomme [24]. Vi undersøgte, om et fald i DNA-skade responset og reparation proteiner på HDAC hæmning også ført til et fald i rekrutteringen af ​​DNA reparation proteiner med den skadede lokalitet. VPA behandlet DU-145 og LNCaP celler blev bestrålet med 4 Gy af stråling og efterfølgende fikseret efter fire timers reparation.

Immunofluorescens blev udført for BRCA1 og RAD51 sammen med phosphorylerede H2AX proteiner. Der var en markant reduktion i farvning for BRCA1 og RAD51 foci på VPA behandling; kontrolceller på den anden side viste diskrete BRCA1 og RAD51 foci der colocalized med phosphoryleret H2AX (fig. 6a og b). Farvningen og lokalisering af NBS1 imidlertid forblev uændret efter VPA behandling (fig. 6a). Vi kvantificeret antallet af BRCA1 og RAD51 foci ved at tælle dem i celler med mere end tyve H2AX foci. Som vist i figur 6c, fandt vi, at der var en signifikant reduktion i antallet af reparation foci for begge de reparationsproteiner upon VPA behandling. Både LNCaP og DU-145 celler viste punktformig cytoplasmatisk farvning for både RAD51 og BRCA1. Disse resultater viser, at foruden nedregulering, er der en forringet rekruttering af reparation proteiner til det beskadigede sted ved HDAC-inhibering.

a) Immunofluorescensanalyse af DU-145-celler behandlet med 1,5 mM VPA i 48 timer og bestrålet med 4Gy af stråling probet for BRCA1 (rød) og NBS1 (grøn). Kerner blev modfarvet med DAPI. Cytoplasmatisk BRCA1 (pil) set i VPA behandlede celler tyder nedsat rekruttering af BRCA1 i VPA behandlede celler. b) Immunofluorescensanalyse af LNCaP-celler behandlet med 1,5 mM VPA i 48 timer og bestrålet med 4Gy af stråling probet for H2AX Ser

139 (rød) og RAD51 (grøn). Kerner blev modfarvet med DAPI. Celler med 25 H2AX Ser

139foci blev analyseret. Cytoplasmatisk RAD51 (pil) set i VPA behandlede celler tyder nedsat rekruttering af BRCA1 i VPA behandlede celler. c) Kvantificering af antallet af BRCA1 og RAD51 foci colocalizing med H2AX Ser

139 foci i DU-145 og LNCaP-celler efter behandling med 1,5 mM VPA og bestråling med 4Gy af stråling. I alt 100 celler med 25 H2AX Ser

139foci blev talt. Fejlsøjler indikerer standardafvigelse fra middelværdien. d) FACS-analyse viser en HR reparation under anvendelse af et plasmid reporterkonstruktion i LNCaP-celler efter behandling med varierende koncentration af VPA.

Hvorvidt dette fører til et fald i HR reparation var det næste spørgsmål vi undersøgt. Til dette har vi ansat en plasmid tilgang for at score HR effektivitet i LNCaP celler. Vi genererede en EGFP rekombination reporter konstruktion ved kloning en promotor EGFP opstrøms for pEGFPN1 vektor. En Bcl I-sted blev konstrueret i dette gen til at inducere DSB’er. EGFP-genet forud for CMV-promotoren var muteret, med den konsekvens, at funktionaliteten af ​​EGFP kun ville blive genoprettet, når der er effektiv HR reparation. Som vist i figuren 6d, var der en signifikant reduktion i antallet af HR dygtige LNCaP-celler upon VPA behandling. Disse resultater klart indikerer en inddragelse af HR-vejen i PCA celler efter HDAC hæmning.

E2F1 er involveret i nedregulering af centrale reparation proteiner upon HDAC hæmning

Da vores data viste transkriptionel nedregulering af reparation gener upon HDAC-inhibering, undersøgte vi histon H3 acetylering status promotorer af en delmængde af nedreguleret gener ved anvendelse chip assays. Interessant nok vores resultater viste et fald i H3 acetylering status for de proximale promotorregioner af alle de undersøgte gener (Fig. 7a). Et fald i acetylering af promotorregioner er også ledsaget af en stigning i binding af transkriptionelle repressorproteiner til promotorerne [7]. For at undersøge transkriptionsfaktorer, der kan medføre transskription undertrykkelse af DNA reparation gener upon HDAC hæmning, vi fokuserede vores opmærksomhed på de E2F transkriptionsfaktorer. BRCA1 og RAD51 har to E2F bindingssted i den proksimale promotor-regionen [31]. Både BRCA1 og RAD51 undertrykkes under hypoxiske betingelser ved rekruttering af E2F4 /p130 transskription repressorer. Under hypoxiske betingelser, E2F1 og E2F4 samtidig binde BRCA1 promotor på to tilstødende E2F sites at skabe transkriptionel repression af BRCA1 genekspression [30], [31]. Tilsvarende Chk1 og BubR1 har transskription bindingssteder for E2F transkriptionsfaktorer og er fremkaldt af E2F1 [32], [38].

a) chip analyse af VPA (1,5 mM i 48 timer) behandlet DU-145 celler for acetyleret histon H3 status i initiativtagerne til reparation gener. Baren diagram er en densitometri læsning af agarosegelen vist normaliseret til input. b) Activator og repressor E2F protein niveauer i VPA (1,5 mM i 48 timer), behandlede celler LNCaP og DU-145 cells.E2F niveauer forblev nedreguleret på VPA behandling, selv efter bestråling med 4Gy stråling, som vist i DU-145 celler, ubestrålet (0Gy ) celler tjente som en stråling kontrol. c) luciferasereporteren assays i DU-145 og LNCaP-celler, behandlet med varierende koncentrationer af VPA ved anvendelse proximale promotorregioner, som omfatter E2F bindende regioner af nedreguleret reparation gener. d) chipanalyse for E2F belægning i promotorregionerne af nedreguleret gener. Chippen blev udført under anvendelse af antistoffer mod E2F’er (1, 4, og 6) i VPA (1,5 mM i 48 h) behandlet og kontrol DU-145-celler. Baren diagram repræsenterer densitometriske aflæsninger normaliseret til de respektive indgange.

Siden E2F1 udskrift blev nedreguleret af HDAC-hæmmere, vi hypotese, at HDAC hæmning kan øge bindingen af ​​undertrykkende E2F’ere til nedreguleret reparation genpromotorer, og dermed resultere i aktiv undertrykkelse af DNA reparation gener. Vi undersøgte først proteinniveauer både aktivatoren og repressive E2F’ere efter behandling med VPA i både LNCaP og DU-145-celler. I overensstemmelse med de transkriptniveauer blev E2F1 proteinniveauet nedreguleres på VPA behandling, mens de repressive E2F’ere (E2F4 og 6) ændrede sig ikke. E2F1 forblev nedreguleret selv efter induktion af DNA-skade ved bestråling (fig. 7b). Der er således en differentiel respons af aktivatoren og repressive E2F’ere til HDAC-inhibering. Der er rapporter, der tyder en stigning i E2F1 transkriptionsaktivitet under neuronal apoptose på HDAC hæmning [39]. Dette kunne være væv-afhængig, som vorinostat medieret HDAC-inhibering resulterer i nedregulering af E2F beslægtede gener i myelomatose [40]. Endvidere binding af E2F1 til Arhi promotoren viste sig at blive reduceret med den HDAC-hæmmer Trichostatin A [41]. Selvom vi fundet E2F1 proteinniveauer nedreguleret ved HDAC-inhibering, der var en mulighed, at aktiviteten af ​​den resterende pulje af E2F1 blev forøget efter HDAC-inhibering. For at undersøge dette, klonede vi proximale regioner i BRCA1, RAD51, og Chk1, som omfatter E2F-bindingssteder, ind i pGL3 basic luciferase reporter vektor. VPA behandlet DU-145 og LNCaP-celler blev transficeret med promotoren reporter-konstruktioner sammen med kontrol Renilla luciferase vektor. Lysater blev underkastet en dual luciferase assay. Vores data afslørede en signifikant nedregulering af alle genpromotorer upon VPA behandling, med BRCA1 promotoren de mest berørte, sammenlignet med kontrolceller (fig. 7c). Hvorvidt dette indebærer nedsat binding af E2F1 eller øget binding af undertrykkende E2F4 eller E2F6 til nedreguleret genpromotorer var det næste spørgsmål, vi rettet. Primere til chip assays var designet til at flankere E2F steder i proksimale initiativtagere til BRCA1, RAD51, Chk1 og Bubr1 gener. Chromatin fra VPA behandlede og ubehandlede kontrolceller blev immunopræcipiteret ved anvendelse af antistoffer mod E2F1, E2F4 og E2F6. PCR-amplifikation af udfældet kromatin DNA afslørede promotor belægning af disse transkriptionsfaktorer. Der bekræfter en tidligere rapport, fandt vi samtidig brugsret E2F1 og E2F4 til BRCA1 og RAD51 genpromotorer og fandt et lignende mønster for Bubr1 promotoren. Under vores eksperimentelle betingelser, vi fandt ikke nogen E2F6 binding til nogen af ​​de undersøgte initiativtagere. Mens E2F1 bundet kraftigt til promotorområder i ubehandlede kontroller, var der en signifikant reduktion af E2F1 rekruttering ved HDAC-inhibering (fig. 7d). I modsætning til vores hypotese, fandt vi, at nedregulering af reparation gener er ikke som følge af en aktiv undertrykkelse af undertrykkende E2F’ere, men et generelt fald i rekrutteringen af ​​aktivator E2F1 til initiativtagerne.

Diskussion

Under udviklingen i PCa, visse DNA-reparationsveje er inaktiveret, som følge af hvilket, PCa erhverver genomisk ustabilitet. Dette er baggrunden for en større grad af endogene DNA skader i PCA celler end normale celler [42], [43]. For fortsat celle overlevelse, andre DNA-skader respons og reparation veje induceret og vedligeholdt.