PLoS ONE: En fælles genetisk variant (97906C & gt; A) DAB2IP /AIP1 er forbundet med en øget risiko og tidlig debut af lungekræft i kinesiske Hanner

Abstrakte

DOC-2 /DAB2 interaktiv protein (DAB2IP) er en roman identificeret tumorsuppressorgen der hæmmer cellevækst og letter celle apoptose. En genetisk variant i

DAB2IP

gen blev rapporteret at være forbundet med en øget risiko for aggressiv prostatakræft nylig. Siden DAB2IP indebærer i udviklingen af ​​lungekræft og lav udtryk for DAB2IP observeres i lungekræft, vi hypotese, at variationerne i

DAB2IP

gen kan øge den genetiske modtagelighed for lungekræft. I en case-kontrol studie af 1056 lungekræfttilfælde og 1056 køn og alder frekvens-matchede kræft-fri kontrol, vi undersøgte sammenhængen mellem to almindelige polymorfier i

DAB2IP

gen (-1420T G, rs7042542, 97906C A, rs1571801) og risikoen for lungekræft. Vi fandt, at sammenlignet med de 97906CC genotyper, bærere af variant genotyper (97906AC + AA) havde en signifikant øget risiko for lungekræft (justeret odds ratio [OR] = 1,33, 95% CI = 1,04-1,70,

P

= 0,023) og antallet af variant (risiko) allel arbejdede i en dosis-respons måde (

P

trend = 0,0158). Yderligere lagdeling analyse viste, at risikoen foreningen var mere udtalt hos forsøgspersoner i alderen under 60 år, mænd, ikke-rygere, ikke-drikkende, overvægtige grupper og i dem med familie kræft historie i første eller anden grad slægtninge, og 97906A interageret med overvægt på risiko lungekræft. Vi fandt endvidere antallet af risikofaktorer alleler (97906A allel) var negativt korreleret med tidlig diagnose alder af lungekræft hos mandlige patienter (

P

= 0,003). Der blev dog ikke signifikant sammenhæng observeret på -1420T G polymorfi. Vore data antydede, at 97906A variant genotyper er associeret med øget risiko og tidlig indtræden af ​​lungekræft, især hos mænd

Henvisning:. Yang L, Li Y, Ling X, Liu L, Liu B, Xu K et al. (2011) En fælles genetisk variant (97906C A) DAB2IP /AIP1 er forbundet med en øget risiko og tidlig debut af lungekræft i kinesiske Hanner. PLoS ONE 6 (10): e26944. doi: 10,1371 /journal.pone.0026944

Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA

Modtaget: Marts 16, 2011; Accepteret: 6 oktober 2011; Udgivet: 26 okt 2011

Copyright: © 2011 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af National Natural Scientific Foundation of China giver 30872178, 81072366 (Dr. J. Lu) og 30.872.142 (Dr. W. Ji), Guangdong Provincial videnskabelige Research Grants 8251018201000005 og Guangdong Provincial højtstående eksperter Tilskud 2010-79 ( Dr. J. Lu). Derudover ingen yderligere ekstern finansiering modtaget for denne undersøgelse. Alle finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den mest almindelige form for kræft og den største årsag til dødsfald blandt tumortyper i verden [1]. I USA blev det anslået, at der ville være 222,520 nye lungekræft forekomster og 157,300 lungekræft dødsfald i 2010 [1]. Data fra den nationale død undersøgelsen og kræft registrering af fastlandet Kina viste også, at lungekræft var den hyppigste dødsårsag i de fleste byer i Kina [2]. I Guangzhou, incidensraten af ​​lungekræft var 61,18 /10

5 hos mænd, og 32,56 /10

5 hos kvinder i 2004, i overensstemmelse hermed, med en dødelighed på 59,37 /10

5 hos mænd, og 27,82 /10

5 hos kvinder [2]. Alle disse viste, at de byrder lungekræft er alvorlige i hele verden, især hos mænd.

Epidemiologiske undersøgelser har vist, at de mest ætiologiske faktorer af lungekræft er fra miljø, herunder cigaretrygning, erhvervsmæssig udsættelse for polycykliske aromatiske kulbrinter, asbest, metaller og svejserøg, luftforurening, og fejlernæring eller diæter [3]. Det er dog kun en lille del af personer, der udsættes for farlige miljøfaktorer udviklede lungekræft sygdom, der tyder på, at andre end miljø faktorer, såsom værten (f.eks kroniske lungesygdomme) eller genetiske faktorer (fx gen variation) kan prædisponere individer at udvikle lungecancer [4]. For nylig, en meta-analyse, herunder resultater fra 41 studier rapporteret, at lungekræft familiens historie var en risikofaktor for lungekræft [5]. Disse viste, at den genetiske faktor spiller en rolle i udviklingen af ​​den menneskelige lungekræft.

DAB2IP

, kodning gen af ​​DOC-2 /DAB2IP protein, også kendt som apoptose signal- regulere kinase 1-interagerende protein-1 (AIP1), er et hidtil ukendt medlem af RAS GTPase- aktiverende genfamilie. DAB2IP, ikke kun direkte aktiverer TNF induceret ASK1-JNK celle apoptotisk signalering og hæmmer TNF induceret IKK- NF-KB-cellevækst signalering [6] – [8], men også undertrykker phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) -Akt pathway og dermed fører til celle apoptose [9] og negativt regulere RAS-medierede celle overlevelse signal via dens interaktion med DAB2 [10]. Endvidere undersøgelse afslørede også en funktion af DAB2IP i modulering epitel-til-mesenchymal overgang og cancermetastase [11]. På grund af den afvigende methylering i

DAB2IP

promotorregion, lav ekspression af DAB2IP blev fundet i flere typer cancer, herunder lungecancer og øget niveau af DAB2IP kan undertrykke cancervækst [12] – [17]. DAB2IP knockout-mus viste, at mangel på DAB2IP protein kraftigt kan forøge epithelcellevandring og inflammatorisk angiogenese [18]. Alle data tyder på, at

DAB2IP

kan fungere som et tumorsuppressorgen.

DAB2IP

gen lokaliserer på kromosom 9q33.1-33.3. Det er på høje polymorf, 1457 polymorfier og to almindelige forskellige udskrifter er blevet rapporteret i dette gen. For nylig en undersøgelse rapporterede, at en genetisk polymorfi (rs1571801) i intron 1 af

DAB2IP

gen var signifikant forbundet med øget risiko for aggressiv prostatakræft både i African American og europæiske befolkning [19]. Fordi de fleste af patienterne de lungekræftpatienter er mænd og DAB2IP mangelfuld blev også grundlagt i lungekræft [15], er det sandsynligt, at den genetiske variation i

DAB2IP

gen kan bidrage til at øge risikoen for lungekræft, som det gjorde i prostatacancer. Variationer i promotoren af ​​dette gen kan påvirke gen funktioner. Taget disse sammen, vi hypotese, at de genetiske variationer i

DAB2IP

gen og deres mulige interaktioner med miljømæssige faktorer er forbundet med risiko for lungekræft.

I dette hospital-baseret case-kontrol undersøgelse herunder 1056 lungekræftpatienter og 1056 køn og alder frekvens-matchede genetiske ubeslægtede kræft-fri kontrol, vi genotype to almindelige polymorfier i

DAB2IP

gen (-1420T G, rs7042542, i promoter region, 97906C A, rs1571801, i intron 1) og undersøgt deres forbindelse med risiko for lungekræft.

Resultater

emner demografi

de fordelinger af demografiske variabler og risikofaktorer i 1056 sager og de 1056 kræft-fri kontrol er beskrevet andetsteds [20], og disse variabler blev yderligere justeret for multivariat logistisk regressionsmodel til at kontrollere eventuel confounding af de vigtigste virkninger af den undersøgte SNP og anvendes i senere lagdeling og gene- miljø interaktion analyse. Desuden af ​​de 1056 sager, der var 683 (64,7%) tilfælde af cantoneses, 90 (8,5%) teocheweses, 198 (18,8%) hakkases og 85 (8,0%) fag fra andre provinser. af de 1056 kontroller, der var 700 (66,2%) cantoneses, 81 (7,7%) teocheweses, 195 (18,5%) hakkases og 80 (7,6%) fag fra andre provinser. Forskellen i fordelinger af sub-nation mellem cases og kontroller var ikke statistisk signifikant (

P

= 0,8538), og dette blev anvendt i den senere og gen-miljø interaktion lagdeling analyse (tabel 1).

de fordelinger af

DAB2IP

genotyper og risikoen for lungekræft

de fordelinger af de to SNPs genotyper blandt kontroller og sager, og de justerede odds ratio forbundet med lungekræft er sammenfattet i tabel 2. Begge genotypefrekvenser i kontrol populationen var i overensstemmelse med de forudsagte under Hardy-Weinberg ligevægt (

P

= 0,454 for -1420T G;

P

= 0,113 for 97906C EN). Genetisk koblingsuligevægt mellem -1420T G locus og 97906C Et locus ikke forekomme som LD analysen i kontroller vist (D ‘= 0,015 og r

2 = 0,001), hvilket tyder på hver kan have en uafhængig effekt på risikoen for . lungekræft

Som vist i tabel 2, Allel hyppigheden af ​​97906C blev en SNP vist signifikante forskelle mellem de tilfælde og kontroller (

P

= 0,0381). Multivariat logistisk regressionsanalyse viste, at efter justering for forstyrrende faktorer i forhold til CC genotyper, CA havde en signifikant øget risiko for lungekræft (justerede odds ratio [OR] = 1,31; 95% CI = 1,01-1,68;

P

= 0,0436), AA homozygot havde en ikke-signifikant øget risiko for lungekræft (justeret OR = 1,90; 95% CI = 0,80-4,53;

P

= 0,1438) på grund af sin sjældne frekvens, men der var en signifikant tendens til en allel dosis effekt på risiko for lungekræft (

P

trend = 0,0158). Under co-dominant model af arv, bærere af en allel (dvs., Californien /AA genotyper) havde en 0,33 gange øget risiko for lungekræft (95% CI = 1,04-1,70;

P

= 0,023 ). Men for -1420T G SNP, de genotype og allelfrekvenserne ikke signifikant forskellig mellem de tilfælde og kontroller (

P

= 0.5263 og 0.4549, henholdsvis). Konsekvent, var der ingen signifikant sammenhæng mellem denne SNP og risiko for lungekræft

Stratificering analyse af

DAB2IP

97906C . A genotyper og risikoen for lungekræft

Vi yderligere evalueret sammenslutninger af de 97906CA /AA variant genotyper med lungekræft risiko stratificeret af udvalgte variabler. Som vist i tabel 3, sammenlignet med den fælles vildtype homozygot genotype, den skadelige genotyper 97906CA /AA var mere udtalt hos mænd (justere OR = 1,42, 95% CI = 1,06-1,89), i yngre individer (justere OR = 1,51 , 95% CI = 1,06-2,14), i ikke-rygere (justere OR = 1,43, 95% CI = 1,00-2,10), i nondrinkers (justere OR = 1,45, 95% CI = 1,10-1,92), i overvægtige grupper ( justere OR = 2,33, 95% CI = 1,30-4,16), og i dem med familie kræft historie i første eller anden grad slægtninge (justere OR = 2,55, 95% CI = 1,04-6,25). Betragtninger, ikke signifikant sammenhæng mellem -1420T blev G polymorfi og risikoen for lungekræft findes i nogen af ​​de undergrupper (data ikke vist)

Desuden har vi vurderet mulige interaktioner (eller effekt ændringer. ) mellem polymorfi og alder, køn, rygning, alkohol, familie historie af kræft, og BMI-grupper på kræftrisiko. Mens montering multiplikative modeller, vi kun fundet, at de 97906A variant genotyper interageret med BMI på at øge kræftrisiko (interaktion test

P

= 0,0348). Vi analyserede yderligere mulige interaktioner med den Multifaktor dimensionalitet Reduction (MDR) software, og fandt, at der var interaktioner af 97906A variant genotyper, BMI og rygning på øget kræftrisiko (interaktion test

P

= 0,0003). Disse resultater tyder på en mulighed for interaktion mellem 97906A variant genotyper og overvægt på risiko lungekræft.

Alder ved debut af lungekræft og varianter af

DAB2IP

Fordi en tidlig alder ved debut af kræft er en funktion af genetisk modtagelighed for sygdommen, vi analyserede forholdet mellem alder ved debut af patienter med lungecancer og genotyper af

DAB2IP

viste en Pearson korrelationsanalyse at alder ved debut faldet betydeligt som antallet af risikofaktorer alleler steget i hanner (r = -0,11,

P

= 0,0026), men ikke hos kvinder (r = -0,06,

P

= 0,2923). Vi yderligere tildelt disse 746 mandlige patienter til en af ​​tre grupper på grundlag af det antal risikofaktorer alleler, og fandt, at den alder ved debut (middelværdi ± SD) var 61,1 ± 11,7 år i 610 patienter med nul risiko allel (dvs. CC genotyper), det var betydeligt lavere i 124 patienter med en risiko allel (CA genotyper) (58,8 ± 11,2); og det blev yderligere reduceret i 12 patienter med to risikofaktorer alleler (AA genotyper) (55,4 ± 9,5). Bærerne af 97906CA eller AA genotyper var 2,3 år eller 5,7 år yngre end CC genotyper. (ANOVA test

P

= 0,0386) (fig. 1). Vi yderligere udført Cox regressionsanalyse med og uden justering for køn, alder, røg status, drikke status og BMI, og fandt, at den genetiske variant 97906A (97906CA og AA) i

DAB2IP

var en uafhængig faktor for den tidlige debut af patienter med lungecancer (

P

= 0,033,

P

annonce = 0,031)

associering mellem det 97906C . En genotype og

DAB2IP

mRNA niveauer

Som vist i figur 2A, mRNA niveauerne af

DAB2IP

i 32 lungekræft væv var væsentligt lavere end deres tilstødende normale væv (

P

0,001). Men forskellene i DAB2IP mRNA-ekspression blandt 97906C A genotyper var ikke signifikant i hverken tumorvæv (

P =

0,188) eller normalt væv (

P =

0,165), som vist i figur 2B og 2C. Det foreslog, at SNP 97906C . Kan en have nogen væsentlig indflydelse på dette gen udtryk

A, Relative mRNA niveauer af

DAB2IP

udtryk i lungekræft væv sammenlignet med deres tilstødende normale lungevæv ; B, Relativ mRNA niveau i

DAB2IP

udtryk ved 97906C En genotype i lungekræft væv. C, Relativ mRNA niveau i

DAB2IP

udtryk ved 97906C En genotype i normale væv. blev ikke observeret nogen signifikant sammenhæng mellem den 97906C En genotype og

DAB2IP

mRNA-niveauer hverken i kræft væv eller i normale væv Kolonner, betyder fra tre uafhængige forsøg; barer, SD; og Students t-test blev anvendt til at teste forskellene i ekspressionsniveauerne af forskellige konstruktioner

Påvisning af DAB2IP /MLL fusion gen

I genotype-analyse af 97906C . A genotyper i dem 82 lungekræft væv og deres tilstødende normale væv, fandt vi, at af kræft væv 19 tilfælde var bærere af CA, 2 tilfælde var AA, af de tilstødende normale væv 17 tilfælde var bærere af CA og ét tilfælde var AA. Vi amplificerede fragmentet af DAB2IP /MLL fusionsgenet med PCR-fremgangsmåden som von Bergh AR beskrevet for alle de 82 lungekræft væv og deres tilgrænsende normale væv. Vi undlod imidlertid at opdage

AB2IP /MLL

fusion gen.

Diskussion

I dette lungekræft case-kontrol undersøgelse i en sydlig kinesisk befolkning, vi undersøgte sammenhængen mellem to almindelige varianter af

DAB2IP

og risikoen for lungekræft med en relativ stor stikprøve på 1056 lungekræftpatienter og 1056 kræft-fri kontrol. Signifikant sammenhæng blev observeret mellem 97906C En polymorfi og risiko for lungekræft. De 97906A variant genotyper viste sig at være forbundet med øget risiko, især i de undergrupper af emner yngre end 60 år, mænd, aldrig rygere, aldrig drikker, overweighter eller obesities, og dem med familie kræft historie. Endvidere blev det øgede antal risikofaktorer alleler forbundet med mere tidlig alder ved debut af lungekræft. Men for polymorfi -1420T G, blev der ikke fundet bevis for nogen forbindelse mellem denne SNP og risiko for lungekræft. Så vidt vi ved, er dette den første genotype foreningen undersøgelse af

DAB2IP

SNPs og risikoen for lungekræft.

En undersøgelse viste det intron1 genetisk variant 97906A i

DAB2IP

var forbundet med en øget risiko for aggressiv prostatakræft [19]. På grund af den kritiske rolle DAB2IP i ætiologien for lungekræft, her fandt vi, at 97906C A SNP var også forbundet med en øget risiko for lungekræft hos mænd; Det tyder på, at 97906A varianter kan spille en vigtig rolle i ætiologiske for lungekræft. Vi havde udført bioinformatik analyse med Vista-værktøjer (https://genome.lbl.gov/vista/index.shtml) ved at sammenligne de genomiske strukturer af

DAB2IP

gen blandt menneskelig (GeneID: 153.090) og mus ( GeneID: 69.601), rotte (GeneID: 192126), hund (GeneID: 491.356), ko (GeneID: 541.268), fandt vi, at 97906C Et locus lokaliserer i evolutionært konserverede områder (ecrs), som ikke ændres gennem evolution og serveres som funktionelle cis-agerende elementer [21]. Vi analyserede yderligere mulige genetisk statistiske lignende SNPs til 97906C A i en 5 Mb region på kromosom 9 via HapMap SNP-databasen (release # 36, https://www.hapmap.org/, November 9, 2009) genotypebestemmes i CHB trios med ssSNPer web interface (https://gump.qimr.edu.au/general/daleN/ssSNPer/). Ina regionen fra 123228424 bp opstrøms til 123728423 bp nedstrøms 97906C A, fandt vi også en intron 1 polymorfismer rs1984038 som var 3184 bp opstrøms af 97906C A var i helt LD (D ‘= 1,00, r

2 = 1,00) med 97906C A [22], og det var også hører til de ecrs. Men vi hverken fundet nogen signifikant effekt af 97906C En SNP på mRNA udtryk for DAB2IP gen i lungekræft væv og deres tilstødende normale væv; og vi ikke har kunnet påvise den mulige virkning af SNP på DAB2IP /MLL fusion gen i kræft væv. Tager disse beviser sammen, det påvist, at 97906C A er et bevaret genetisk markør

I lagdeling analyse, fandt vi, at variant genotyper (97906CA + 97906AA) var mere udtalt i mandlige, yngre, aldrig rygere,. nondrinkers, overvægtige grupper og personer med arvelig kræft. Strenge miljømæssige faktorer såsom rygning er risiko for lungekræft og gen-miljø interaktion er velkendt involveret i ætiologien af ​​lungekræft [23], men her fandt vi, at 97906A varianten kan påvirke udviklingen af ​​lungekræft hovedsagelig på grund af autoktont arvet effekt. Som vist, 97906C A er mere markant hos unge individer, hos ikke-rygere og i nondrinkers. Konstant dem med familie historie af kræft i en første- eller anden – grad slægtninge var mere tilbøjelige til at udvikle lungekræft som følge af den genetiske baggrund høj 97906A frekvens. Desuden observerede vi samstemmende beviser for en statistisk signifikant vekselvirkning mellem 97906A og overvægt. Vi formodede androgener kan fungere som mellemled for den tætte sammenhæng mellem androgener og fedme [24] og androgener, funktion på ekspressionen af ​​DAB2IP ved at undertrykke EZH2 udtryk [25]. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afsløre mekanismen som akkumulerede studier har bekræftet, at overvægt øger risikoen for human cancer, herunder lungekræft [26].

Interessant vi også fundet, at de 97906A variant genotyper var forbundet med en tidlig debut alder af lungekræft hos mandlige patienter i en allel dosis-virkning måde. DAB2IP kan vedrøre patogenesen af ​​lungecancer som studie har vist, at DAB2IP i prostatakræft påvirket reparation effektiviteten af ​​DNA dobbelt-strenget pauser induceret af medicinsk udsættelse for ioniserende stråling, som er en risikofaktor for lungekræft [27]. Således er vores fund viste 97906C . En polymorfisme kan være et bevaret genetisk markør til at forudsige risikoen for lungekræft og yderligere tidlig debut af lungekræft hos mænd

Da den foreliggende undersøgelse var et hospital-baseret rets- kontrol undersøgelse, begrænset til kinesisk Han befolkning, kan det have nogle begrænsninger. Men genotype frekvens distributioner (dvs. -1420G, 97906A alleler var 0,103, 0,072, henholdsvis), i kontrolpersoner af vores undersøgelse svarede til dem rapporteret for kinesiske befolkning, herunder i HapMap database (dvs. -1420G, 97906A alleler var 0,114 , 0,067, henholdsvis). Desuden genotypefrekvenser blandt kontroller kunne passe Hardy-Weinberg loven foreslog også tilfældighed af emnet udvælgelse. Von Bergh AR et al. rapporterede, at exon 2 af

DAB2IP

genet blev fusioneret med

MLL

gen i en akut myeloid leukæmi patient. Vi undlod imidlertid at observere

DAB2IP /MLL

fusion gen i 82 tilfælde af lungekræft væv og deres tilstødende normale væv, endsige den mulige virkning af 97906C En polymorfi på

DAB2IP /MLL

fusionsgen. På grund af de teknologiske begrænsninger, vi endnu ikke udføre andre funktionel analyse at identificere, om 97906C Et locus er i en intronisk forstærker eller en splejsning-relateret site. I denne forening studie, opnåede vi en undersøgelse magt 80.2% at opdage rå OR på 1,35 for 97906CA + AA genotyper (som forekom med en frekvens på 13,6% i kontrollerne) i forhold til 97906CC genotype. Derfor synes det at være, at de 97906CA + AA genotyper forbundet med en øget risiko for lungekræft er usandsynligt, at der er opnået ved en tilfældighed.

Som konklusion på dette hospital-baseret case-kontrol undersøgelse for lungekræft fandt vi, at de 97906A genetiske varianter af

DAB2IP

gen var forbundet med tidlig debut alder og en øget risiko for lungekræft hos mænd, især i de undergrupper af emner yngre end 60 år, mandlige, aldrig drikker, obesities , og dem med familie kræft historie. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse af 97906A genetiske varianter i

DAB2IP

gen og lungekræft modtagelighed. Større, helst populationsbaserede case-control studier, såvel som veldesignede mekanistiske undersøgelser, er berettiget til at validere vores resultater.

Materialer og metoder

Undersøgelse fag og prøveindsamling

Undersøgelse emner af 1056 lungekræftpatienter og 1056 kræft-fri kontroller blev rekrutteret som tidligere beskrevet [20]. Kort fortalt alle histopatologisk bekræftede patienter med primær lungecancer blev fortløbende ansat i byerne sygehuse og i forstad til Guangzhou fra marts 2007 til marts 2009. Personer med anden lunge tumorer, eller primære tumorer øvre trakeal tvedeling blev udelukket. 1056 kræft-fri kontroller, der var frekvens-matchede til sagerne på alder (± 1 år) og køn blev udvalgt tilfældigt fra omkring 10.000 personer, der deltog i de sunde helbredsundersøgelse programmer i Fællesskabet sundhed stationer gennemført i Guangzhou. Alle forsøgspersoner genetisk ubeslægtede etniske han-kinesere og var fra Guangzhou City og de omkringliggende områder i det sydlige Kina. Ingen havde blodtransfusioner i sidste 6 måneder. En simpel spørgeskema blev anvendt til at indsamle data om demografiske karakteristika, herunder rygning status, brug af alkohol og andre faktorer, herunder køn, alder, BMI med underskrevet samtykkeerklæring både i tilfælde og kontroller. Oplysningerne i sub-etniske (dvs. kantonesisk, Teochewese, Hakkas, og Han etnisk fra andre provinser uden for Guangdong) blev også indsamlet under interviews. Alle deltagere rekrutteret i vores undersøgelse havde underskrevet en samtykkeerklæring, før spørgeskemaet interviewet og vores undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Boards of Guangzhou Medical University.

SNP udvælgelse

Vi brugte TSSW programmet ( https://www.softberry.ru/berry.phtml) til at forudsige promotorregionen og fandt, at 4000 bp 5′-opstrøms region af

DAB2IP

gen er potentielle promotorregion. Baseret på HapMap databasen (HapMap data Rel 27 PhaseII + III, Feb 09 på NCBI B36 forsamling, dbSNP B126), fandt vi, at der var ni fælles SNPs (dvs., med mindre allel frekvens ≥5%) inden for promoter regionen

DAB2IP

gen i kinesisk Han Beijing befolkning. Vi yderligere udvalgt de tagSNPs baseret på den parvise LD analyse (r

2 tærskel = 0,8) med Haploview 4.2 software, og fandt, at polymorfi rs7042542 (-1420T G) var en tagSNP som repræsenterer den genetiske information af andre SNP’er (fig S1). Desuden tilsætte rs1571801 (97906C A) SNP i intron 1 af

DAB2IP

gen, der var blevet rapporteret at være signifikant associeret med øget risiko for aggressiv prostatakræft som to GWAS undersøgelser vist [19], vi genotypede denne to SNP’er (-1420T G, og 97906C a) i vores undersøgelse (figur S2)

Genotypebestemmelse analyse

Genomisk DNA blev ekstraheret fra 1 ml af en leukocyt cellepellet der. blev opnået fra fibrinlag ved centrifugering af 5 ml perifert blod, ved hjælp af DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Valencia, A), ifølge producentens instruktioner. DNA renhed og koncentrationer blev bestemt ved måling af spektrofotometrisk absorbans ved 260 nm og 280 nm.

De to SNP’er blev genotype under anvendelse af polymerasekædereaktionen-restriktionsfragmentlængde-polymorfisme (PCR-RFLP) -metoden. For -1420T G, et 132 bp PCR-produkt blev amplificeret fra genomisk DNA under anvendelse af specifikke primere: 5′-CTCCTGACCT CAGGTGATC C-3 ‘(fremad), 5′-TGGTGGGGAGGACAAAGATGCATCTGA-3′ (revers). PCR blev udført i 25 ul reaktionssystemer. Efter indledende denaturering ved 94 ° C i 5 minutter, der var 35 cykler ved 94 ° C i 30 s, 61 ° C i 30 s og 72 ° C i 60 s, og dernæst en endelig forlængelse trin på 72 ° C i 7 min. De amplificerede fragmenter blev spaltet med MlyI (New England Biolabs) natten over ved 37 ° C, og produkterne blev adskilt i 3,5% agarosegel. Den -1420GG genotype producerede 2 bands (112 og 20 bp), mens -1420TT genotypen produceret en enkelt bånd (132 bp), og de heterozygote viste alle 3 bånd (132, 112 og 20 bp) (figur S1). For 97906C A, blev en 98 bp PCR-produkt amplificeret fra genomisk DNA under anvendelse af specifikke primere: 5’-AAACAGGCATAAGG TTTTAAGT-3 ‘(fremad), 5′-AATTTGACTTCCAAGTTGTC-3’ (revers). Spaltet med Tsp5091 (New England Biolabs) natten over ved 65 ° C, den 97906AA genotype producerede 2 bånd (52 og 46 bp), 97906CC genotype producerede et enkelt bånd (98 bp), og de heterozygote viste alle 3 kategorier (98, 52 og 46 bp) (figur S2).

resultaterne blev evalueret af to eksperimentatorer uafhængigt som var blindet til forsøgspersonernes patient eller kontrol status. Vi valgte tilfældigt 10% prøver for hver af de 2 SNPs at udføre gentagne assays, og resultaterne var 100% overensstemmende. For hvert mål genotype af PCR-produkterne blev oprenset og bekræftet ved direkte sekventering (fig S3).

DAB2IP

mRNA-ekspression analyse

Vi udførte QRT-PCR til at bestemme, om den 97906C A havde en effekt på

DAB2IP

genekspression

in vivo

. 32 tumorvæv og deres tilstødende normale væv blev indsamlet fra de patienter, der ikke fik kemoterapi og /eller strålebehandling før blev komplet kirurgisk resektion af primær lungekræft. Alle tumorprøver blev histologisk bekræftet og genotyper af disse prøver var alle sekventering bekræftede. Totalt RNA blev ekstraheret ved anvendelse af Trizol Reagent (Invitrogen, Inc.). En alikvot af total RNA (1 ug) blev derefter revers transkriberet til komplementært DNA ved anvendelse af oligo primer og SuperscriptII (Invitrogen). Relativ mRNA ekspressionsniveauer af

DAB2IP

og en intern reference gen

påvistes p-actin til salg på ABI Prism 7500 Detektionssekvensen systemet (Applied Biosystems) baseret på SYBR-Green metode. De anvendte primere til

DAB2IP

var 5’CTG AGC GGG ATA AGT GGA TGG -3 «(fremad) og 5’AAA CAT TGT CCG TCT TGA GCT T -3« (omvendt) og for

p-actin

var 5′-GGC GGC ACC ACC ATG TAC FTT-3 ‘og 5′-AGG GGC CGG ACT CGT CAT ACT-3’. Metode til 2

AT blev brugt til at demonstrere niveauet af

DAB2IP

genets udtryk (figur 2). Alle analyser blev udført i et blindet måde med de laboratoriemetoder personer uvidende om genotypebestemmelse data. Hver assay blev udført tre gange.

Påvisning af

DAB2IP /MLL

fusion gen

Da von Bergh AR et al. rapporterede, at exon 2 af

DAB2IP

genet blev fusioneret med intron 9 i

MLL

gen i en akut myeloid leukæmi patienten og dermed mistet sin funktion, vi udførte PCR til påvisning af eventuel effekt af 97906C En polymorfi på at gøre

DAB2IP /MLL

fusion gen. Genomisk DNA blev ekstraheret fra 82 lungekræft væv og deres tilstødende normale væv blev indsamlet under den kirurgiske excision i første, andet og tumor hospitaler i Guangzhou Medical College (Guangzhou, Kina) og opbevaret i -80 ° C køleskab. Vi amplificerede fragmentet af DAB2IP /MLL fusionsgenet med PCR-fremgangsmåder som von Bergh AR beskrevet [28]. Den fremadrettede primer var nær exon 2 af

DAB2IP

genet (5’CATCTGATGCCGAGGCTGAA-3 ‘), og den reverse primer var i exon 10 i

MLL

genet (5′-GTCCACTCTG ATCCTGTGGACT 3 ‘). PCR-produkterne vil være 700-900 bp længde. De amplificerede fragmenter blev klonet med TOPO TA kloning kittet (Invitrogen, Carlsbad, CA) at oprense og øge mængden, og blev yderligere sekventeret ved den kommercielle virksomhed af Invitrogen med Applied Biosystems ABI 3730 DNA analyzer.

Statistiske analyse

de chi-square tests blev anvendt til at vurdere forskelle i fordelingen af ​​sub-nation mellem cases og kontroller samt allel og genotyper. Den Hardy-Weinberg ligevægt (HWE) er blevet underkastet en goodness-of-fit chi-square test for at sammenligne de forventede genotypefrekvenser med observerede genotypefrekvenser i kræft-fri kontrol. Sammenhængen mellem case-kontrol status og hver SNP, målt med odds ratio (OR) og dens tilsvarende konfidensinterval 95% [29], blev anslået ved hjælp af en ubetinget logistisk regressionsmodel, med og uden justering for alder, køn, rygning status , brug af alkohol, BMI. Logistisk regression model blev også anvendt til test for trend. I lagdeling analysen, vurderede vi det vigtigste effekt af

DAB2IP

i hvert undergruppe og vekselvirkningen mellem den

DAB2IP

polymorfier og udvalgte variabler om kræftrisiko ved at montere en multiplikativ interaktion med ubetinget logistisk regressionsmodel ; den (MDR) software Multifaktor dimensionalitet Reduktion blev brugt til at validere mulig interaktion [30]. Den 2LD programmet og PROC Allel statistiske procedure i SAS /Genetics (SAS Institute Inc., Cary, NC) blev software anvendes til at detektere LD af de to SNP’er. Pearson korrelation analyser, ANOVA tests og Cox regressions modeller blev anvendt til at analysere alder debut i lungekræftpatienter af

DAB2IP

genotyper. Alle statistiske tests var to-sidet og P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Støtte oplysninger

figur S1..